犬新孢子虫Nc-1株在MDBK、Vero和MDCK细胞中的培养比较.pdf

第4 5卷 第3期2 0 2 3年9月 延 边 大 学 农 学 学 报A g r i c u l t u r a lS c i e n c eJ o u r n a l o fY a n b i a nU n i v e r s i t y V o l.4 5 N o.3 S e p.2 0 2 3收稿日期:2 0 2 3-0 8-1 6 基金项目:国家自然科学基金(3 2 0 6 0 8 0 7);吉林省教育厅“十三五”科学技术项目(J J KH 2 0 2 0 0 5 2 2 K J);高等学校学科创新引智计划(D 2 0 0 3 4)作者简介:刘禹馨(2 0 0 0-),女,吉林松原人,硕士研究生,研究方向为动物疫病综合防控。通信作者:于龙政(1 9 7 8-),男,吉林长春人,副教授,博士,E-m a i l:6 2 3 9 6 6 1 5 1q q.c o m文章编号:1 0 0 4-7 9 9 9(2 0 2 3)0 3-0 0 5 6-0 6 D O I:1 0.1 3 4 7 8/j.c n k i.j a s y u.2 0 2 3.0 3.0 0 9犬犬新孢子虫N c-1株在MD B K、V e r o和MD C K细胞中的培养比较刘禹馨1,贾 芮1,杨孝龙1,王奕博1,李亭玉1,于龙政1,2*(1.延边大学 农学院;2.东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心:吉林 延吉1 3 3 0 0 2)摘要:为了分析新孢子虫在3种不同宿主细胞内的生长情况,该试验采用犬新孢子虫N c-1株,将其与牛肾细胞(MD B K)、非洲绿猴肾细胞(V e r o)和犬肾上皮细胞(MD C K)在3 7条件下培养1 0d,每天观察比较3种细胞在虫体入侵前后的形态变化并记录虫体数量,绘制虫体生长曲线。结果表明:犬新孢子虫N c-1株在MD-B K、V e r o和MD C K细胞中均能够正常生长。其中,N c-1株在入侵V e r o细胞的第6天可以较快达到生长高峰期,而在MD B K和MD C K细胞中生长较慢,在第7天才能达到虫体数量的最大值,且MD C K细胞中虫体数量最少。因此,除V e r o细胞外,MD B K细胞也可作为一种培养新孢子虫良好的细胞系。该试验为深入了解新孢子虫感染机制和选择合适的体外培养模型提供重要参考。关键词:新孢子虫;MD B K细胞;V e r o细胞;MD C K细胞;体外培养中图分类号:S 8 5 2.7 2 3 文献标志码:A C o m p a r i s o no fN e o s p o r a c a n i n u mN c-1s t r a i nc u l t u r e d i nMD B K,V e r oa n dMD C Kc e l l sL I U Y u x i n1,J I AR u i1,YANGX i a o l o n g1,WANGY i b o1,L IT i n g y u1,YUL o n g z h e n g1,2*(1.A g r i c u l t u r a lC o l l e g eo fY a n b i a nU n i v e r s i t y;2.E n g i n e e r i n gR e s e a r c hC e n t e ro fB e e fC a t t l eS c i e n c e sa n dT e c h n o l o g yI n n o v a t i o no ft h eM i n i s t r yo fE d u c a t i o ni nN o r t h e a s tC o l dR e g i o n:Y a n j iJ i l i n1 3 3 0 0 2,C h i n a)A b s t r a c t:I no r d e r t oa n a l y z e t h eg r o w t ho fN e o s p o r a c a n i n u mi n t h r e ed i f f e r e n t h o s t c e l l s,N c-1s t r a i nw a su s e d i n t h i s e x p e r i m e n t a n dc u l t u r e dw i t hb o v i n ek i d n e yc e l l s(MD B K),A f r i c a ng r e e nm o n k e yk i d n e yc e l l s(V e r o)a n dc a n i n ek i d n e ye p i t h e l i a lc e l l s(MD C K)a t3 7 f o r1 0d a y s.T h em o r p h o l o g i c a lc h a n g e so ft h r e ek i n d so f c e l l sb e f o r e a n da f t e r i n v a s i o nw e r eo b s e r v e da n dc o m p a r e de v e r yd a y,a n d t h en u m b e r o f i n-v a s i v ep a r a s i t ew a sr e c o r d e d,a n dt h eg r o w t hc u r v eo f i n v a s i v ep a r a s i t ew a sd r a w n.T h er e s u l t ss h o w e dt h a tN c-1s t r a i nc o u l dg r o wn o r m a l l y i nMD B K,V e r oa n dMD C Kc e l l s.N c-1s t r a i nc o u l dr e a c h i t sg r o w t hp e a kf a s t e ro nt h e6 t hd a ya f t e r i n v a s i o no fV e r oc e l l s,w h i l e i tg r e ws l o w l yi nMD B Ka n dMD C Kc e l l s,r e a c h i n gt h em a x i m u mn u m b e ro f i n v a s i v ep a r a s i t eo nt h e7 t hd a y,a n dt h en u m b e ro f i n v a s i v ep a r a s i t e i nMD C Kc e l l sw a s t h e l e a s t.T h e r e f o r e,i na d d i t i o nt oV e r oc e l l s,MD B Kc e l l sc o u l da l s ob eu s e da sag o o dc e l l l i n e f o r c u l t u r eN.c a n i n u m.T h i s s t u d yp r o v i d e s a n i m p o r t a n t r e f e r e n c e f o ru n d e r s t a n d i n g t h em e c h a-第3期刘禹馨,等:犬新孢子虫N c-1株在MD B K、V e r o和MD C K细胞中的培养比较n i s mo fN.c a n i n u mi n f e c t i o na n ds e l e c t i n gas u i t a b l ec u l t u r em o d e l i nv i t r o.K e y w o r d s:N e o s p o r a c a n i n u m;MD B K;v e r o;MD C K;i nv i t r oc u l t u r e 新孢子虫病(N e o s p o r o s i s)是由 犬 新 孢 子 虫(N e o s p o r a c a n i n u m)引起的多种动物共患的一种寄生虫病,在世界范围内广泛流行1。该病的临床特征主要表现为神经、肌肉功能障碍,会引起孕畜流产、死胎或弱胎。新孢子虫病的宿主范围广泛,在牛、马、猪、犬、猫等多种家养动物以及鹿、狐狸、熊等多种野生动物中均可感染2-3,其中,犬既是该病的中间宿主,也是终末宿主。在家畜中,该病对牛危害严重,是导致牛流产的主要原因4。同时,新孢子虫病的传播方式分为水平传播与垂直传播,其中,垂直传播是该病在群体中持续存在的原因。感染该病的母畜可通过胎盘传递给胎儿5。因此,给我国养殖业带来了严重的经济损失。目前,在新孢子虫防治方面,尚未研制出特效药物及商品化疫苗6-7。针对新孢子虫的体外研究表明,新孢子虫可以在多种不同细胞系中培养成功,如非洲绿猴肾细胞(V e r o)8、牛单核细胞9-1 0和人宫颈癌细胞(H e l a)等1 1-1 2。为了筛选出在体外培养新孢子虫的合适细胞系,谢素珠等1 3比较了犬新孢子虫N C-G F P株在非洲绿猴肾细胞(V e r o)、人胚肾细胞(HE K-2 9 3)、人宫颈癌细胞(H e L a)和小鼠骨髓瘤细胞(S P 2/0)中的培养状态,发现HE K-2 9 3细胞可以作为短期较快培养新孢子虫的细胞系。但目前并无研究表明,新孢子虫可以感染人类。新孢子虫病对牛和犬的危害比较严重,然而关于新孢子虫在牛肾细胞(MD B K)和犬肾上皮细胞(MD C K)中的增殖情况的直接比较还相对较少。因此,该研究分析了新孢子虫N c-1株在V e r o、MD B K和MD C K3种细胞内的生长情况,通过比较虫体在不同细胞中的生长状态以及增殖情况,旨在观察新孢子虫在接近自然感染动物的牛肾细胞、犬肾细胞内的生长情况,为今后对犬新孢子虫的研究提供重要参考。1 材料与方法1.1 虫体与细胞犬新孢子虫(N c-1株),MD B K、V e r o和MD C K细胞由延边大学生物技术实验室保存。1.2 仪器与试剂胎牛血清、DMEM细胞培养液、青链霉素混合液、0.2 5%胰蛋白酶-E D T A消化液(购自G i b c o公司);台盼蓝染液(购自索莱宝生物科技有限公司);瑞氏-姬姆萨染色液(购自珠海贝索生物技术有限公司);细胞基因组D NA提取试剂盒、S u p e r R e a l荧光定量预混试剂增强版(S Y B RG r e e n)(购自天根生化科技(北京)有限公司)。二氧化碳培养箱(购自日本三洋公司);离心机(购自其林贝尔仪器厂);超净工作台(购自上海新苗医疗器械公司);荧光定量P C R仪(购自安捷伦科技有限公司);恒温水浴锅(购自苏州威尔试验用品有限公司)。1.3 细胞复苏与细胞单层培养从液氮中取出MD B K细胞、V e r o细胞和MD-C K细胞,并置于3 7水浴锅中融化。12 0 0r/m i n离心5m i n,用DMEM细胞培养液(含5%血清)重悬细胞沉淀,并转移至T 2 5细胞培养瓶中,3 7,5%C O2条件下培养。待细胞正常生长且密度9 0%铺满时,进行传代。取细胞形态正常且处于对数生长期的细胞,并分别对3种细胞进行台盼蓝染色和细胞计数。将3种细胞的密度调整至11 05个/m L,接种5m L于T 2 5培养瓶中,置于3 7,5%C O2条件下培养。1.4 虫体的复苏与悬液制备从液氮中取出冻存的虫体,置于3 7水浴锅中融化,将冻存的虫体悬液加入到5m LDMEM完全培养液中,20 0 0r/m i n离心1 0m i n,将虫体重悬液接种在V e r o细胞中连续传3代,待其稳定后,再接种到3种不同的细胞系中进行生长。待细胞形态发生明显变化且在显微镜下能看到大量虫体时,用细胞刮刀收集细胞。并用2 7G针头反复破碎细胞,使虫体释放。再用5m滤膜进行过滤,除去部分细胞碎 片。20 0 0r/m i n离 心1 0 m i n,弃 上 清,用DMEM培养液重悬沉淀,并用细胞计数板进行计数,将纯化后虫体密度调整至11 03个/m L,制成虫体悬液,备用。1.5 犬新孢子虫N c-1株在细胞中生长情况观察取上述虫体悬液1m L接种在事先准备好的3种细胞中进行培养。在显微镜下观察细胞,并记录细胞形态变化情况。1.6 犬新孢子虫N c-1株在细胞中生长曲线的测定在虫体入侵细胞后,每天取1 0L虫体培养液上清滴在细胞计数板上,在显微镜下记录细胞外虫75延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 体的数量,连续观察记录1 0d,并绘制虫体在3种细胞中的生长曲线。1.7 瑞氏-姬姆萨染色与观察为判断虫体是否能够入侵3种细胞,弃掉细胞培养瓶中的培养液,用P B S洗涤5次,细胞刮刀收集细胞,2 7G针头反复破碎细胞,过5m滤膜,取1 0 0L滴在载玻片上,待其自然风干后,滴加瑞氏-姬姆萨染色液A,染色1m i n。再将B液滴加在A液之上,充分混合均匀,染色5m i n。并在显微镜下观察新孢子虫在不同宿主细胞中的入侵情况。1.8 感染细胞荧光定量P C R检测在虫体入侵细胞的第3天,用P B S洗涤3次,再用细胞刮刀将贴壁细胞刮下,20 0 0r/m i n离心1 0m i n,用1m L不完全培养液重悬,过5m滤膜,1 20 0 0r/m i n离心1m i n收集虫体,尽量去除上清。加入B u f f e rGA,震荡悬浮沉淀。然后在样品中加入2 0L蛋 白 酶K溶 液,混 匀。再 加 入2 0 0LB u f f e rG B,颠倒混匀后,在7 0放置1 0m i n。再向其中加入2 0 0L的无水乙醇,震荡混匀1 5s后,进行离 心。向 吸 附 柱 中 加 入B u f f e rG D,离 心 后 用B u f f e rPW洗涤2次,最后加入5 0L的B u f f e rT E使D NA洗脱下来,-2 0保存备用。荧光定量P C R所用的引物序列为N c 5-R e a l F:5-A C T G GAG G C A C G C T GAA C A C-3,N c 5-R e-a l R-5:AA C AAT G C T T C G C AAGAG GAA-3。反应体系 为:2S Y B R M i x2 0L,上 下 游 引 物 各1L,模板D NA1L,d d H2O7L;反应条件为:预变性9 4 2m i n;变性9 4 3 0s e c,退火5 8 1 5s e c,延伸7 23 0s e c,循环4 0次。2 结果与分析2.1 MD B K、V e r o和MD C K细胞的培养观察MD B K细胞呈梭形贴壁生长,细胞轮廓清晰,生长速度较快,传代3d后,可铺满瓶底(图1-A)。V e r o细胞形态与MD B K细胞相似,细胞与细胞间紧密排列,呈铺路石状,细胞大小均等,形态完整,胞质突起,边界清晰,传代2d后就可长满瓶底(图1-B)。MD C K细胞呈不规则多角形生长,类似于长梭形,细胞轮廓清晰,生长速度相对较慢,传代4d后才能铺满瓶底(图1-C)。图1 正常细胞状态(4 0 0)F i g.1 N o r m a l c e l l s t a t e(4 0 0)2.2 瑞氏-姬姆萨染色观察新孢子虫纯化后采用瑞氏-姬姆萨染色方法进行染色(图2)。通过观察可以发现,在染色液作用下可以将新孢子虫染为深蓝色,说明新孢子虫可以入侵3种细胞。图2 N c-1株在不同细胞中G i e m s a染色(4 0 0)F i g.2 G i e m s a s t a i n i n go fN c-1s t r a i n i nd i f f e r e n t c e l l s(4 0 0)85 第3期刘禹馨,等:犬新孢子虫N c-1株在MD B K、V e r o和MD C K细胞中的培养比较2.3 荧光定量P C R检测结果在虫体入侵细胞后,对3种细胞提取D NA并用相应的引物进行荧光定量P C R检测,结果如表1所示。根据扩增曲线(图3)可知,3种细胞进行扩增后,均出现峰值,说明新孢子虫对3种细胞均可感染,其中,V e r o细胞在虫体入侵后提取的D NA,率先出现峰值,与另外2种细胞相比,C t值比较低。说明在V e r o细胞中的虫体数量比较多。而在MD-C K细胞中,最后出现峰值,且C t值最高,说明在MD C K细胞中的虫体数量比较少。表1 各组样本的C t值T a b l e1 C t v a l u e so f e a c hg r o u po f s a m p l e s样本C t值V e r o1 7.8 7 9MD B K1 8.5 5 9MD C K1 9.1 4 5图3 荧光定量P C R扩增曲线F i g.3 F l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v eP C Ra m p l i f i c a t i o nc u r v e2.4 犬新孢子虫N c-1株在3种细胞中的生长情况观察3种细胞接种N c-1株后,每天观察细胞状态。第1天接种虫子后,3种细胞大小形态无明显变化,细胞轮廓较为清晰,核质明显。接种虫子第2天,V e r o细胞开始变长,细胞与细 胞间的缝隙 较大。MD B K细胞拉长紧缩,细胞与细胞间出现空泡。而MD C K细胞无明显变化。虫体培养第3天,V e r o细胞中出现带虫空泡(图4-A),且可观察到带虫空泡中的速殖子,细胞形态发生明显改变,细胞排列疏松。MD B K细胞部分呈不规则改变,细胞大小不一,其中可观察到带虫空泡(图4-B)。而MD C K细胞的形态此时发生改变,细胞变短,细胞中的带虫空泡增多(图4-C)。继续培养虫体后发现,V e r o细胞在虫体入侵第6天几乎全部脱落。而MD B K和MD C K细胞在虫体入侵第9天,细胞大部分破裂,脱落。以上说明犬新孢子虫N c-1株在V e r o细胞中可以较快生长,且生长状态较好,其次是MD B K细胞,最后为MD C K细胞。图4 各细胞接种N c-1株第3天形态(4 0 0)F i g.4 M o r p h o l o g yo fN c-1s t r a i n i n o c u l a t e d i n t oe a c hc e l l o nt h e t h i r dd a y(4 0 0)95延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 2.5 犬新孢子虫N c-1株在3种细胞中的生长曲线测定接种虫体后,每天记录细胞外速殖子的数量,绘制虫体生长曲线(图5),进一步比较新孢子虫在3种不同来源细胞中的生长情况。3种细胞接种虫体后的第1天虫体数量几乎为0。相比于MD B K和MD C K细胞,V e r o细胞在虫体入侵的第2天细胞培养液上清中游离的虫体数量增多。在虫体入侵的第3天,可观察到虫体在V e r o细胞中的数量显著提升。V e r o细胞中的虫体数量在第6天达到最高峰,而MD B K和MD C K细胞中的虫体数量在第7天才达到最高峰,且虫体数量明显低于V e r o细胞中的虫体数量。虫体培养第8天之后,各细胞中虫体的数量均有所下降。因此,虫体在V e r o细胞中增殖较快,且虫体数量在接种后的第6天出现高峰,第7天虫体数量略微下降。而在MD B K细胞中虫体数量在第7天出现高峰期,从第8天开始虫体数量呈下降趋势。虫体在MD C K细胞中的生长最为缓慢。图5 犬新孢子虫N c-1株在3种细胞中的生长曲线F i g.5 G r o w t hc u r v e so fN e o s p o r a c a n i n u mN c-1s t r a i ni nt h r e ek i n d so f c e l l s3 讨论与结论自1 9 8 8年D u b e y发现并命名新孢子虫后,世界各地的寄生虫学研究者迅速有效地开展了新孢子虫的研究1 4。目前已经从病原学、病理学、免疫学、分子生物学等 多方面进 行了有 关 新 孢 子 虫 的 研究1 5。研究者对新孢子虫及新孢子虫病的认识是一个逐渐深入的过程,从病原的确定、宿主范围的不断扩大、对不同宿主的危害、完整生活史的发现、对传播途径的认识、不同国家(地区)和不同动物的感染情况、诊断方法的建立、防控等各方面的认识都是逐渐获得的,因此,选择合适的体外培养细胞系,是对新孢子虫病展开研究的基础1 6。V e r o细胞系是从正常的非洲绿猴肾细胞转化而获 得 的 细 胞 系,属 于 贴 壁 依 赖 型 成 纤 维 细 胞系1 7。有研究表明,新孢子虫入侵宿主细胞与致密颗粒蛋白、棒状体蛋白以及虫体表面抗原有关1 8-1 9。吴保义等2 0筛选出了V e r o细胞与新孢子虫分泌的棒状体蛋白N c AMA 1相互作用的Tm e d 2蛋白,该蛋白在V e r o细胞中可能会起到抑制虫体入侵的作用2 1。相 比 于V e r o细 胞 系,MD B K细 胞 是 由M a d i n等2 2从成年牛肾脏中分离出的细胞株。白荣臻等2 3对感染新孢子虫的MD B K细胞进行了基因表达差异的研究,共有1 7 6个基因转录显著上调。而MD C K细胞是1 9 5 8年D a r b yNB等2 4从成年英国小猎犬的肾脏组织中分离出来的。在针对新孢子虫的研究中,N i s h i k a w aY等2 5比较了犬I F N-、I F N-和I F N-对犬新孢子虫速殖子感染犬细胞抑制作用,其研究表明,犬I F N-和I F N-抑制了新孢子虫感染在MD C K细胞内的增殖。该研究建立了新孢子虫感染MD B K和MD C K细胞的体外培养模型,通过比较N c-1株在3种细胞中的增殖情况发现,新孢子虫在MD B K、V e r o和MD C K细胞中均能够增殖,并在一段时间内形成带虫空泡,其中,犬新孢子虫N c-1株在V e r o细胞中生长及增殖情况最为良好,其次是MD B K细胞,最后为MD C K细胞。需要注意的是,该研究仅提供了对比新孢子虫在MD B K、V e r o和MD C K3种细胞中增殖情况的初步结果,至于犬新孢子虫N c-1株在3种不同细胞系中的增殖情况具有差异的原因尚待研究。因此,未来的研究可以进一步探索不同因素对新孢子虫增殖的影响,以及探究新孢子虫与宿主细胞之间的相互作用机制,从而提供更全面的了解和指导。参考文献:1 D U B E YJ.R e c e n t a d v a n c e s i nN e o s p o r aa n dn e o s p o r o-s i sJ.V e t e r i n a r y P a r a s i t o l o g y,1 9 9 9,8 4(0 3):3 4 9-3 6 7.2 G O N D I MFL.N e o s p o r a c a n i n u mi nw i l d l i f eJ.T r e n d s i nP a r a s i t o l o g y,2 0 0 6,2 2(0 6):2 4 7-2 5 2.3 马国文,石滨,裴福峰.猪弓形虫病诊断及临床病理学研究J.内蒙古民族大 学学 报(自 然 科学 版),2 0 0 5(0 6):6 4 2-6 4 4.4 吴佳琦,高丽娟,郑海英,等.牛新孢子虫病的诊断方06 第3期刘禹馨,等:犬新孢子虫N c-1株在MD B K、V e r o和MD C K细胞中的培养比较法J.北方牧业,2 0 2 3(1 1):4 2.5 J UN I O RI,ME S QU I T A L,M I R AN D A D,e ta l.E n-d o g e n o u s t r a n s p l a c e n t a l t r a n s m i s s i o no fN e o s p o r ac a n-i n u mi ns u c c e s s i v eg e n e r a t i o n so fc o n g e n i t a l l yi n f e c t e dg o a t sJ.V e t e r i n a r yP a r a s i t o l o g y,2 0 2 0,2 8 4:1 0 9 1 9 1.6 闫艳娟,张东林,庞洪泽,等.鸡球虫核酸疫苗的研究进展J.河北科技师范学院学报,2 0 1 8,3 2(0 1):6 5-6 9.7 康桂英,秦建华,翟丽娟,等.抗堆型艾美球虫子孢子单克隆抗体杂交瘤细胞的复苏及其活性的初步鉴定J.内蒙古 民 族 大 学 学 报(自 然 科 学 版),2 0 1 1,2 6(0 1):5 2-5 4.8 NAGU L E S WA R ANA,C ANNA SA.V e r oc e l l s u r f a c ep r o t e o g l y c a ni n t e r a c t i o n w i t ht h e m i c r o n e m ep r o t e i nN c M I C 3 m e d i a t e s a d h e s i o n o f N e o s p o r a c a n i n u mt a c h y z o i t e st oh o s tc e l l su n l i k et h a ti n T o x o p l a s m ag o n d i iJ.I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l f o rP a r a s i t o l o g y,2 0 0 2,3 2(0 6):6 9 5-7 0 4.9 MA R TA G,L AUR AJ,P I L A R H,e ta l.D i f f e r e n t i a lr e s p o n s e so fb o v i n em o n o c y t e-d e r i v e dm a c r o p h a g e st oi n f e c t i o nb yN e o s p o r ac a n i n u m i s o l a t e so fh i g ha n dl o wv i r u l e n c eJ.F r o n t i e r s i n i mm u n o l o g y,2 0 1 9,1 0:9 1 5.1 0 S HA RMAP,HA R T L E YCS,HAQU E M,e t a l.B o-v i n en e o n a t a l m o n o c y t e sd i s p l a y p h e n o t y p i cd i f f e r-e n c e sc o m p a r e dw i t ha d u l t sa f t e rc h a l l e n g ew i t ht h ei n f e c t i o u sa b o r t i f a c i e n ta g e n tN e o s p o r ac a n i n u mJ.F r o n t i e r s i n i mm u n o l o g y,2 0 1 8,9:3 0 1 1.1 1 C A R VA LHO VJ,A L V E SM C,C A R D O S OR M,e ta l.D i f f e r e n t i a ls u s c e p t i b i l i t yo fh u m a nt r o p h o b l a s t i c(B e W o)a n du t e r i n e c e r v i c a l(H e L a)c e l l s t oN e o s p o-r ac a n i n u mi n f e c t i o nJ.I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l f o rP a r-a s i t o l o g y,2 0 1 0,4 0(1 4):1 6 2 9-1 6 3 7.1 2 边征征,吕强,宫鹏涛,等.新孢子虫速殖子在HC T-8、V e r o和H e l a细胞中培养的比较J.中国病原生物学杂志,2 0 1 4,9(0 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D ONGJ,L I J,WANGJ,e t a l.I d e n t i f i c a t i o na n dc h a r-a c t e r i z a t i o no fG R A 6/G R A 7o fN e o s p o r ac a n i n u mi nMD B Kc e l l sJ.A c t aB i o c h i m i c ae tB i o p h y s i c aS i n i-c a,2 0 1 7,4 9(0 4):3 6 1-3 6 6.2 3 白荣臻.牛源肾细胞在弓形虫和新孢子虫感染下基因表达差异的研究D.洛阳:河南科技大学,2 0 2 1.2 4 HAA S SC,KOO E H,C A P E L L A,e ta l.P o l a r i z e ds o r t i n go fb e t a-a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i na n d i t sp r o-t e o l y t i cp r o d u c t si n MD C Kc e l l si sr e g u l a t e db yt w oi n d e p e n d e n t s i g n a l sJ.J o u r n a l o fC e l lB i o l o g y,1 9 9 5,1 2 8(0 4):5 3 7-5 4 7.2 5 N I S H I KAWAY,I WA T AA,NA GA S AWA H,e t a l.C o m p a r i s o no f t h eg r o w t hi n h i b i t o r ye f f e c t so f c a n i n eI F N-a l p h a,-b e t aa n d-g a mm ao nc a n i n ec e l l s i n f e c t e dw i t hN e o s p o r ac a n i n u mt a c h y z o i t e sJ.T h eJ o u r n a lo fV e t e r i n a r yM e d i c a l S c i e n c e,2 0 0 1,6 3(0 4):4 4 5-4 4 8.16