鉴定LTBP1作为胃癌预后的生物标志物及其与肿瘤免疫微环境的相关性.pdf

医学分子生物学杂志,2024,21(1):057-062 J Med Mol Biol,2024,21(1):057-062DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.01.009通讯作者:王小瑞(电话:[phone],E-mail:15057924 )Corresponding author:WANG Xiaorui(Tel:[phone],E-mail:15057924 )鉴定 LTBP1 作为胃癌预后的生物标志物及其与肿瘤免疫微环境的相关性王小瑞1,王觅柱21包头市第四医院消化内科 内蒙古自治区包头市,0140302内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院消化内科 内蒙古自治区包头市,014030【摘要】目的 探索潜在转化生长因子 结合蛋白1(latent transforming growth factor beta binding protein 1,LTBP1)在胃癌发生发展及免疫微环境中的生物学功能。方法 在 TCGA 数据库中分析 LTBP1 在泛癌中的表达,然后通过胃癌组织和癌旁组织进行验证。通过回归比例分析法分析 LTBP1 表达与临床病理变量之间的相关性。Cox 回归分析和 Kaplan-Meier 图用于评估 LTBP1 在胃癌中的预后价值。通过 TIMER 分析 LTBP1的表达水平与胃癌中免疫细胞浸润之间的相关性。免疫组织化学染色检测 LTBP1 蛋白在胃癌组织及癌旁组织中的表达水平。结果与正常胃组织相比,胃癌组织中 LTBP1 表达显著上调。其表达与病理 TNM 分期显著相关。LTBP1 高表达的胃癌患者的总体生存率(overall survival,OS)缩短。免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,LTBP1 在胃癌组织中显著高表达。TIMER 检测发现 LTBP1 的表达与 3 种免疫细胞浸润呈正相关。结论 LTBP1 可能是胃癌预后的一个潜在生物标志物,并影响癌症的肿瘤免疫微环境。【关键词】胃癌;潜在转化生长因子 结合蛋白 1;生存分析;肿瘤微环境【中图分类号】R735.2Identification of LTBP1 as Biomarker for Prognosis of Gastric Cancerand Its Correlation with Tumor Immune MicroenvironmentWANG Xiaorui1,WANG Mizhu21Department of Digestive Diseases,the Fourth Hospital of Baotou,Baotou,Inner Mongolia Autono-mous Region,014030,China2Inner Mongolia Institute of Digestive Diseases,the Second Affiliated Hospital of Baotou Medical Col-lege,Inner Mongolia University of Science and Technology,Baotou,Inner Mongolia AutonomousRegion,014030,China【Abstract】Objective To explore the biological functions of latent transforming growth factor be-ta binding protein 1(LTBP1)in the occurrence,development,and immune microenvironment ofgastric cancer.Methods The expression level of LTBP1 in gastric cancer was analyzed by using TC-GA databases,the results were then validated in the gastric cancer tissues and the para-cancerous tis-sues.The association between LTBP1 expression level and the clinicopathological variables were ana-lyzed by regression proportional analysis method.Cox regression analysis and Kaplan-Meier plots wereused to assess the prognostic value of LTBP1 in gastric cancer.The correlation between the expressionlevel of LTBP1 and the immune cells infiltration was analyzed by TIMER.Immunohistochemical stai-ning was used to detect the expression level of LTBP1 protein in gastric cancer tissues and adjacenttissues.Results LTBP1 was significantly up-regulated in the gastric cancer tissues when comparedwith that in the normal samples.Its expression level was significantly correlated with the pathologicTNM stages.Higher LTBP1 expression indicated poor overall survival(OS)in patients with gastriccancer.We identified that LTBP1 expression had a positive correlation with 3 kinds of immune cellsinfiltration by TIMER.Immunohistochemical results showed that LTBP1 was significantly overexpressedin gastric cancer tissues.Conclusion LTBP1 can be a potential prognostic biomarker for gastric canc-er patients and influences tumor immune microenvironment in gastric cancer.【Key words】gastric cancer;latent transforming growth factor beta binding protein 1;survivalanalysis;tumor microenvironment 胃癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率居恶性肿瘤的第五位1-3。胃癌早期通常无症状,有些患者诊断时已处于晚期,生存率仅为24%4-6。近年来,一些治疗晚期胃癌的靶向药物已被开发并批准用于临床,包括曲妥珠单抗、雷莫昔单抗和帕博利珠单抗7-9。然而,胃癌患者的总体预后仍然较差。在中国,胃癌的发病率和死亡率均位居第三。全球每年新发胃癌病例中,中国约占其中的40%。我国早期胃癌占比很低,仅约20%,大多数发现时已是进展期,总体5 年生存率低于50%,以手术为基础的综合治疗仍是胃癌的主要治疗方法10。一些研究表明,胃癌患者术后的中位生存时间仅为 37 43 个月,术后随访 27.8 个月,复发率高达 36.8%,其中大部分为远处转移11-13。潜在转化生长因子 结合蛋白 1(latent trans-forming growth factor beta binding protein 1,LTBP1)作为一种分泌蛋白,是细胞外基质的重要组成部分,属于转化生长因子-蛋白家族成员,具有独特的结构域激活 TGF-信号通路,发挥多种生物学功能14。研究发现,LTBP1 促进食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的肿瘤发生与进展15,并且可能通过调控细胞外基质(extracellular matrix,ECM)介导了抑郁症与恶性胶质瘤的发生进展16,而在宫颈癌中有发现 LT-BP1 的降低与肿瘤恶性进展有关17。此外,LTBP1与 AFP 合用可以更好的诊断和预测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)18。但是 LTBP1在胃癌中的生物学功能研究仍不多。有研究发现,在胃神经内分泌癌中的部分样本中检测到 LTBP1 的突变19,另一项研究表明,LTBP1 的高表达可能与微卫星不稳定性高的胃癌患者总生存率低相关20。本研究主要探索 LTBP1 与胃癌发生发展的关系,为LTBP1 应用于胃癌靶向治疗提供新的视角。1 材料与方法1.1 TCGA 中胃癌测序数据的处理在 R 软件中使用 limma 包来标准化矩阵数据,并在每个数据集中识别肿瘤组织和癌旁组织之间的差异表达基因(DEG)。使用 Benjamin Hochberg 方法调整P 值。调整后的 P1 表明基因差异具有统计学意义。1.2 患者和组织样本胃癌组织芯片 HStm-Ade150 CS-01 购买于上海芯超生物公司,该组织芯片包含 75 例胃癌组织及癌旁组织,所有组织的收集都获得患者的知情同意,组织芯片的使用已获得样本伦理使用审查(YBM-05-02)。将胃癌石蜡切片脱蜡至水。在室温下用3%过氧化氢孵育5 min,以消除内源性过氧化物酶的活性。用蒸馏水冲洗,在 PBS 中浸泡 5 min,重复两次。用10%山羊血清(用 PBS 稀释)封闭,室温孵育 10 min,小心倒出血清,加入一抗工作液,4 孵育过夜。用 PBS 冲洗 5 min,重复 3 次。滴加1 mL生物素标记的二抗工作液,37 孵育20 min。用PBS 洗涤5 min 并重复3 次。滴加1 mL 辣根酶标记的链霉亲和素工作溶液,在37 下孵育20 min。用PBS冲洗5 min,重复3 次。显影剂显色后,每隔 30 s 立即在显微镜下观察是否有染色(DAB),2 min 后变为灰褐色时表示染色成功。用自来水充分冲洗,复染,脱水,透明并密封薄膜。1.3 TIMER 分析 LTBP1 与免疫细胞的相关性利用 TIMER(Tumor Immune Estimation Re-source)免疫浸润分析在线网站,在基因模块中输入 LTPB1 基因表达水平和免疫标记基因列表,并将它们分组以进行进一步的参数设置,分析 LTBP1与肿瘤免疫 B 细胞、T 细胞、Th1 细胞,Treg 细胞的相关系数。1.4 生存和预后分析为了验证关键基因的可靠性,我们使用在线工具GEPIA22 验证了 TCGA-STAD 数据中肿瘤组织和正常组织中关键基因的 mRNA 表达水平。然后,基于 TC-GA-STAD 数据,我们使用 R 软件中的生存包进行 Ka-plan-Meier 单变量生存分析,以探讨患者的总生存率(OS)与关键基因之间的关系。在这项研究中,只选择完成随访时间的患者进行生存分析,然后根据关键基因的表达中值分为两组。与预后相关的关键基因(P0.05)被认为具有统计学意义。1.5 统计分析使用 R 软件版本 4.0.2(https:/www.r-pro-ject.org/)处理实验数据。测量数据表示为 x s。独立样本采用独立样本 t 检验,配对样本采用配对样本 t 检验。Kaplan-Meier 生存率分析采用对数秩检验。P0.05 表明差异具有统计学意义。2 结果2.1 LTBP1 在胃癌中的表达及临床意义泛癌分析结果显示,LTBP1 在 TCGA 的 33 种85王小瑞,等.鉴定 LTBP1 作为胃癌预后的生物标志物及其与肿瘤免疫微环境的相关性肿瘤中均有表达(图 1A)。LTBP1 在肿瘤组织中的表达水平显著高于其在癌旁组织中的表达(图1B)。在配对的胃癌样本中 LTBP1 也显著高表达(图 1C)。应用 ROC 分析验证 LTBP1 的潜在诊断价值,并计算 LTBP1 ROC 曲线下的面积。ROC 曲线下的面积为 0.733,表明 LTBP1 可能是一种潜在的诊断标志物(图 1D)。A:TCGA 数据库中 33 种肿瘤中 LTBP1 的表达情况;B:LTBP1 在胃癌和癌旁组织中的表达;C:LTBP1 在胃癌及配对癌旁组织中的表达;D:LTBP1 在胃癌诊断中的特异性和灵敏性。ACC:肾上腺皮质癌;BLCA:膀胱尿路上皮癌;BRCA:乳腺浸润癌;CESC:宫颈鳞癌和腺癌;CHOL:胆管癌;COAD:结肠癌;DLBC:弥漫性大 B 细胞淋巴瘤;ESCA:食管癌;GBM:多形成性胶质细胞瘤;HNSC:头颈癌;KICH:肾嫌色细胞癌;KIRC:肾透明细胞癌;KIRP:肾乳头状细胞癌;LAML:急性髓系白血病;LGG:脑低级别胶质瘤;LIHC:肝癌;LUAD:肺腺癌;LUSC:肺鳞状细胞癌;MESO:间皮瘤;OV:卵巢癌;PAAD:胰腺癌;PCPG:嗜铬细胞瘤和副神经节瘤;PRAD:前列腺癌;READ:直肠癌;SARC:肉瘤;SKCM:皮肤黑色素瘤;STAD:胃癌;TGCT:睾丸癌;THCA:甲状腺癌;THYM:胸腺瘤;UCEC:子宫内膜样癌;UCS:子宫癌肉瘤;UVM:眼部黑色素瘤。图 1 LTBP1 在胃癌中的表达分析2.2 LTBP1 表达与胃癌的临床相关性我们比较了LTBP1 表达与患者临床病理关系特征的相关性。结果显示,与 T1 期患者相比,LTBP1 在T1、T2 和 T3 期患者中表达也逐渐升高(图2A),病理分期中也出现了一致的结果,在恶性高的 、和期中表达升高(图 2B),LTBP1 在 M0 和 M1 期患者中的表达无显著差异(图 2C)。这些结果表明,LT-BP1 的高表达与胃癌的恶性进展密切相关。A:LTBP1 表达与胃癌临床 T 分期的关系,与 T1 期比较,P0.05,P0.01;B:LTBP1 表达与胃癌临床分级的关系,与 Stage 比较,#P0.01;C:LTBP1 表达与胃癌临床 M 分期关系。图 2 LTBP1 表达与胃癌临床参数相关性分析95医学分子生物学杂志,2024,21(1):057-062 J Med Mol Biol,2024,21(1):057-0622.3 LTBP1 表达与胃癌预后的关系使用“survminer”软件包绘制的 Kaplan-Meier图评估LTBP1 在胃癌中的预后价值。结果显示,LT-BP1 的高表达与总生存期缩短 HR=1.46(1.05 2.03),P=0.026 和无进展生存期缩短 HR=1.35(0.95 1.93),P=0.038 相关(图 3)。A:总生存率;B:无进展生存率。图 3 LTBP1 表达与胃癌患者生存预后的关系2.4 LTBP1 表达与胃癌免疫浸润的相关性采用 Spearman 相关分析法对胃癌患者肿瘤微环境中 LTBP1 的表达水平与 TIMER 定量的免疫浸润进行相关性分析。我们分析了 T 细胞、B 细胞、Treg 和 Th1 细胞与 LTBP1 表达之间的相关性,首先我们发现 LT-BP1 在 T 细胞、B 细胞和 Th1 细胞富集分数高的组中高表达,具有统计学差异,与调节性 T 细胞(Treg)富集分数无显著差异。进一步分析发现,发现 LTBP1 的表达与 T 细胞、B 细胞、Th1 细胞和Treg 细胞的浸润相关系数分别为 0.203、0.289、0.182 和 0.061,统计学分析显示 LTBP1 的表达与T 细胞、B 细胞、Th1 细胞显著正相关,差异具有统计学意义(图 4)。A:LTBP1 在胃癌免疫 T、B、Th1 细胞和调节性 T 细胞中的表达情况;B:LTBP1 的表达与胃癌免疫 T、B、Th1和调节性 T 细胞的相关性。图 4 TIMER 定量分析 LTBP1 与胃癌免疫细胞浸润关系2.5 评估 LTBP1 表达作为胃癌预后标志物为了进一步验证 LTBP1 蛋白在胃癌中的表达情况,我们在 75 例胃癌患者及配对癌旁组织进行免疫组织化学染色,结果表明,与癌旁组织相比,06王小瑞,等.鉴定 LTBP1 作为胃癌预后的生物标志物及其与肿瘤免疫微环境的相关性LTBP1 在胃癌组织中高表达(图 5)。图 5 免疫组化检测 LTBP1 在胃癌及胃癌旁组织中的表达情况(200 )3 讨论胃癌是世界上发病率较高的恶性肿瘤,被发现时大多处于晚期。晚期胃癌患者预后较差,对化疗不敏感21-22。因此,寻找有效的生物标志物对预测胃癌预后和作为潜在靶点具有重要意义。LTBP1是一类具有多种生物学功能的分泌蛋白,通过其自身的 EGF 结构域调节 TGF-的活化。TGF-的异常活化与多种疾病的发生特别是肿瘤的发生相关。LTBP1 在胃癌中的研究不多,作用尚不明确。本研究通过综合生物信息学分析,结合 TCGA-STAD 分析了 LTBP1 在胃癌的表达情况,我们发现LTBP1 高表达于胃癌样本,此外通过比较 LTBP1在 GTEx 数据库及 TCGA 数据库中正常样本和胃癌患者样本中的表达,发现 LTBP1 在胃癌患者样本中高表达。ROC 曲线表明 LTBP1 具备潜在的胃癌诊断价值。接下来,我们进一步比较了 LTBP1 表达与患者临床病理关系特征的相关性并对 LTBP1在胃癌中的预后价值进行评估,我们发现 LTBP1的表达与 TNM 分期和组织学分级有一定的相关性,且 LTBP1 的上调与胃癌总体生存率期和无进展生存期缩短显著相关。我们通过免疫组织化学染色进一步在 75 例胃癌组织及配对癌旁组织中检测了LTBP1 的表达,进一步验证了 LTBP1 在胃癌中的表达水平显著高于癌旁组织。此外,通过 TIMER我们进行了 LTBP1 表达与胃癌中免疫细胞浸润情况的分析,我们发现 LTBP1 的表达与 T 细胞、B细胞、Treg 和 Th1 细胞的浸润具有相关性。这些结果证实了 LTBP1 在胃癌组织中高表达,且和胃癌的临床特征密切相关。但是 LTBP1 促进胃癌的分子生物学机制还需进一步研究。未来我们将继续分析和探讨 LTBP1 在胃癌的发生发展中的可能机制,以提高胃癌的筛查和早期诊断,改进治疗方法,减少复发和转移。参考文献1SIEGEL R,MILLER K,WAGLE N,et al.Cancer statis-tics,2023J.CA Cancer J Clin,2023,73(1):17-48.2 JOSHI S,BADGWELL B.Current treatment and 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