NY∕T 4195.6-2022 农药登记环境影响试验生物试材培养 第6部分：近头状尖胞藻.pdf

2022?11?11发布2023?03?01实施农药登记环境影响试验生物试材培养第6部分：近头状尖胞藻04中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX65.020CCS B4195.62022Guidance on the housing and care of organisms used for environmental impacttest of pesticide registrationPart 6:Raphidocelis subcapitata中华人民共和国农业农村部发 布N Y/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.NY/T 农药登记环境影响试验生物试材培养 分为个部分:第部分:蜜蜂;第部分:日本鹌鹑;第部分:斑马鱼;第部分:家蚕;第部分:大型溞;第部分:近头状尖胞藻;第部分:浮萍;第部分:赤子爱胜蚓.本文件是NY/T 农药登记环境影响试验生物试材培养 的第部分.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口.本文件起草单位:农业农村部农药检定所.本文件主要起草人:陈朗、周欣欣、袁善奎、蒲倩云、安雪花、张璋、毛连纲、俞瑞鲜、崔晓、赵秀振.N Y/T 农药登记环境影响试验生物试材培养第部分:近头状尖胞藻范围本文件规定了农药登记环境影响试验用近头状尖胞藻的引入、验收、培养条件、保种培养、预培养等技术方法,以及记录资料要求.本文件适用于近头状尖胞藻(R a p h i d o c e l i s s u b c a p i t a t a)的实验室培养,其他品种的淡水绿藻,如普通小球藻(C h l o r e l l av u l g a r i s)、近具刺链带藻(D e s m o d e s m u ss u b s p i c a t u s,曾用名:S c e n e d e s m u ss u b s p i c a t u s)等可参照使用.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.G B/T 化学农药环境安全评价试验准则第 部分:藻类生长抑制试验术语和定义下列术语和定义适用于本文件.保种培养 s t o c kc u l t u r e在实验室内用固体或液体培养基小规模培养单一藻种,以备分离、转移到新鲜培养基中并培养成为受试藻的过程.预培养p r e c u l t u r e试验前,将藻细胞接种至与试验时相同的无菌培养基中,在试验要求的相同条件下培养,使其达到对数生长状态的过程.引入与验收 应从专业的藻类研究或培养机构引入藻种,并由其提供品系证明.藻种到达实验室后进行品系确认,近头状尖胞藻的生物学背景和形态学特征见附录A.提前准备好培养基,藻种到达后尽快进行转接.首次引入该藻类品种时,接收后应在实验室内至少培养周,建立起反复接种培养的能力后,再开展试验.材料与设备 培养设备 主要仪器设备包括:洁净工作台、高压灭菌锅等无菌操作相关设备;恒温振荡光照培养箱、光照培养箱、冰箱等培养或保种培养设备;生物显微镜、血球计数板或流式细胞仪、紫外分光光度计等观察与计数仪器;温度计、照度计(球形传感器/余弦传感器)、p H计等环境监控仪器设备;N Y/T 电子天平等称量仪器.培养容器应采用玻璃或其他化学惰性材料制成,且透光性好.常采用玻璃锥形瓶、螺口玻璃试管等.同时,配备透气棉塞或透气封口膜等,便于容器内外部的空气交换.所有器皿、封口材料、吸管等在使用前均应进行高压灭菌(,m i n).培养基 培养基的选择根据藻种选择适宜其生长的培养基.近头状尖胞藻可在多种培养基中保存,宜使用B G 培养基、O E C D藻类培养基或AA P藻类培养基.培养基配制方法 液体培养基B G 培养基的配制方法见G B/T ,O E C D藻类培养基或AA P藻类培养基的配制方法见附录B.固体培养基每升液体培养基中加入约克琼脂条或琼脂粉,经高压灭菌(,m i n m i n)后,在试管中铺成斜面培养基,冷却备用.配制培养基的试剂应为分析纯以上等级.配制用水应为电导率 S/c m的蒸馏水或去离子水.培养方法 保种培养 液体培养基培养 液体培养基在室温下平衡后,将一定量的藻细胞转接至培养基中,摇匀.在 条件下培养,采用持续、均匀的荧光照明,液面光合有效辐射(n m n m)保持在 E/(ms)E/(ms)(相当于冷白光源条件下光强 l x l x).培养期间,保持持续振荡或搅拌.根据培养条件和生长状况,每d d转接次(如装有 mL藻液的锥形瓶,置于 持续光照下培养,可每周转接次).进行长期保种时,将处于对数生长期的藻培养液在条件下冷藏、避光保存,每半年转接次.固体培养基培养 进行长期保种时,也可将处于对数生长期的藻培养液划线转接到固体斜面培养基上,封口.在 、l x l x持续光照条件下培养至固体培养基表面长出藻细胞,然后,转为在条件下冷藏、避光保存.每个月进行次复壮.将藻体转接到液体培养基中培养至对数生长状态,转接次次后再转为固体培养基培养.所有操作必须在无菌条件下进行,以免受到细菌、真菌或其他藻类的污染.状态检查 定期镜检,以确认藻液是否被污染.当出现轻微污染时,可采取以下分离措施:脱脂棉或滤纸过滤,适用于寄生虫和藻细胞体积相差较大的情况;离心法分离,适用于寄生虫和藻细胞重量相差较大的情况;琼脂板划线培养进行分离纯化等.N Y/T 当污染严重时,应重新引入新的藻种.预培养 在 、l x l x持续光照条件下培养,不同位点光照强度差异应控制在 范围内.培养过程中保持持续振荡或搅拌,使藻细胞处于悬浮状态.从保种培养中分离并接种一定量藻细胞至新配制无菌的液体培养基中(接种藻细胞浓度为 个/m L 个/mL),摇匀后在试验条件下培养dd使其达到对数生长状态.近头状尖胞藻以外的其他藻种,需根据具体藻种确定接种藻细胞浓度和达到对数生长所需的时间.达到对数生长状态的藻液可用于试验,也可接种至新配制的无菌液体培养基中,继续进行预培养.每次转接前应通过镜检确定培养液中藻细胞形态、颜色及生长状态是否正常.当藻类培养液中含有异常细胞时,不应继续培养和用于试验.操作要求保种培养和预培养过程中,所有操作应在无菌条件下进行,以免受到细菌、真菌和其他藻类的污染.记录资料对每批次保种培养、预培养的藻,实验室均应保存完整的引入、培养记录,相关原始记录表格设计见附录C.主要记录资料包括:引入与验收记录;保种培养记录;预培养记录;培养基配制记录;水质检测记录;环境条件等.N Y/T 附录A(资料性)生物学背景与形态学特征A 生物学背景近头状尖胞藻(R a p h i d o c e l i s s u b c a p i t a t a)是国际上藻类毒性测试的模式藻种,属绿藻门环藻目月牙藻科.曾用名为“近头状伪蹄形藻”(P s e u d o k i r c h n e r i e l l as u b c a p i t a t a).过去该藻株用于生态毒理学测试时常被称为羊角月牙藻(S e l e n a s t r u mc a p r i c o r n u t u m).在实验室内、E/(ms)持续光照条件下比生长速率为 /d /d.A 形态学特征近头状尖胞藻的形态学特征见图A .其形状弯曲,似羊角形,细胞末端增厚近头状,大小为(m m)(mm),体积约为 m.图A 近头状尖胞藻的形态学特征N Y/T 附录B(资料性)常用培养基配方O E C D培养基配方见表B ,AA P培养基配方见表B .表B O E C D培养基配方储备液组分储备液浓度,g/L培养基中的含量,m g/LANHC l M g C l(HO)C a C l(HO)M g S O(HO)KHP O BF e C l(HO)N aE D T A(HO)CHB O M n C l(HO)Z n C l C o C l(HO)N aM o O(HO)C u C l(HO)DN a HC O 储备液A和C经高压灭菌(,m i n)或 m无菌滤膜过滤后,于冷藏()、黑暗条件下可保存个月;储备液B和D经 m无菌滤膜过滤后,于冷藏()、黑暗条件下可保存个月.制备LO E C D培养基:向约 m L无菌蒸馏水或去离子水中分别加入 m L储备液A、m L储备液B、m L储备液C及m L储备液D,用 m o l/L或 m o l/LHC l或N a OH调节p H为 ,用无菌蒸馏水或去离子水定容至L.培养基应提前d d制备,并在使用前测定p H,必要时,用 m o l/L或m o l/LHC l或N a OH进行调节.表B A A P培养基配方序号组分储备液浓度,g/L培养基中的含量,m g/LAN a HC O BN a NO CM g C l(HO)DC a C l(HO)EM g S O(HO)FKH P O GF e C l(HO)N aE D T A(HO)HB O M n C l(HO)Z n C l C o C l(HO)N aM o O(HO)C u C l(HO)储备液A、储备液G经 m无菌滤膜过滤后,于冷藏()、黑暗条件下可保存个月;储备液BF经高压灭菌(,m i n)或 m无菌滤膜过滤后,于冷藏()、黑暗条件下可保存个月.制备LA P P培养基:向约 m L无菌蒸馏水或去离子水中分别加入 m L储备液AF及 m L储备液G,用 m o l/L或 m o l/LHC l或N a OH调节p H为 ,用无菌蒸馏水或去离子水定容至L.培养基应提前d d制备,并在使用前测定p H,必要时,用 m o l/L或 m o l/LHC l或N a OH进行调节.N Y/T 附录C(资料性)记录表格示例引入与验收记录见表C .保种/预培养记录见表C .预培养记录见表C .培养基配制记录见表C 表C .表C 引入与验收记录名称品种引入日期引入数量引入来源实验室内批次放置位置到达时状态验收人/日期品系确认:(详细描述镜检方法与结论等)操作者/日期:表C 保种培养记录名称/品种引入批次a保种培养批次a/编号培养基名称放置位置b日期藻细胞数(个)/仪器编号:藻细胞浓度(个/m L)藻细胞状态接种量藻液量(m L)/培养基体积(m L)保种培养新批次a操作者/日期备注/a批次编号中应包含相应的日期,即引入批次应包含引入日期,其余批次应包含该批次从上一批次中分离出来的日期.b所用仪器相关记录中应包含仪器使用期间的温度监控记录、光照周期及强度检查记录.N Y/T 表C 预培养记录名称/品种引入批次a保种培养批次a/编号培养基名称培养仪器编号b日期藻细胞数(个)/仪器编号:藻细胞浓度(个/m L)藻细胞镜检状态接种量藻液量(m L)/培养基体积(m L)预培养批次a,c操作者/日期备注/a批次编号中应包含相应的日期,即引入批次应包含引入日期,其余批次应包含该批次从上一批次中分离出来的日期.b所用仪器相关记录中应包含仪器使用期间的温度监控记录、光照周期及强度检查记录.c当转接瓶数时,还应给出不同容器的编号.表C 培养基储备液配制记录储备液类型组分来源(批号、厂家)实际称取量g定容体积m L灭菌方法a 滤膜过滤 高压灭菌储备液编号储存位置储存条件有效期至仪器编号操作者/日期a选择“滤膜过滤”时给出滤膜规格,选择“高压灭菌”时给出仪器编号、灭菌温度及时间表C 培养基配制记录培养基编号储备液编号取用量m Lp H是否调节p H(如调节,注明方法)定容体积m L仪器编号操作者/日期N Y/T 参考文献毕列爵,胡征宇中国淡水藻志 第八卷 绿藻门绿球藻目M北京:科学出版社,:中国科学院淡水藻种库E B/O L h t t p:/a l g a e i h b a c c n/O r g a n i s a t i o nf o rE c o n o m i cC o o p e r a t i o na n dD e v e l o p m e n t T e s t i n gG u i d e l i n e :F r e s h w a t e rA l g aa n dC y a n o b a c t e r i a,G r o w t hI n h i b i t i o nT e s tR P a r i s:O E C D,