Westernblot试剂配制及操作流程.docx

Western-Blot操作流程
试剂配制
蛋白提取试剂
1. RIPA裂解液：
50mM Tris（MW121.14，PH7.5） 3.02g
150mM NaCl 4.38g
1%TritonX-100 5ml
1%脱氧胆酸钠 5g
0.1%SDS 0.5g
蒸馏水至 500ml。
调pH值至7.5。
　　混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。
2. 蛋白酶抑制剂cooktail
所需母液成分：
（1）100mmol/L PMSF
　　　　　PMSF 17.4mg
　　　　　异丙醇 1ml
　　溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。
（2）10mM 亮肽素leupeptin: -20℃保存
（3）2.1mg/ml 抑肽素Aprotinin: 4℃保存
配制： 成分 终浓度 每ml裂解液所加母液量
PMSF 1mmol/L（储存浓度稀释100倍） 10ul
Leupeptin 0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍） 10ul
Aprotinin 1ug/ml （储存浓度稀释2000倍） 0.5ul
各成分直接加入所用的RIPA裂解液中 ，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。
蛋白定量试剂
1. G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）
　　　考马斯亮蓝G250 100mg
　　　95％乙醇 50ml
　　　85％磷酸 100ml
　　　蒸馏水至 1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存于棕色瓶中。
2．牛血清白蛋白BSA储存液（1mg/ml）：
100mg BSA粉末溶于20 ml双蒸水，定容至100 ml，加少量防腐剂，4℃保存。
上样用试剂
1．4X上样缓冲液
1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2ml
SDS 0.8g
溴酚蓝 0.04g
甘油 4ml
去离子水定容至10ml。混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。使用时稀释成1X。
2．1.0 mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）
用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT,分装成1ml小份储存于-20?C。使用时稀释成1X。
例如：上样量20μl--4X上样缓冲液 5μl+ DTT 2μl + 样本蛋白13μl
工作液
制胶用（1-6）：
1. 1.0mol/L Tris·HCl （pH6.8）
　　Tris (MW121.14) 12.114g
蒸馏水 100ml
溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。
2. 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）
　　Tris (MW121.14) 18.171g
蒸馏水 100ml
溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。
3. 10％SDS
　　SDS 10g
　　蒸馏水至 100ml
如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
4. 10％过硫酸胺（AP）
　　过硫酸胺 0.1g
蒸馏水 1ml
（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）
5． 四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4?C保存。
6． 30%丙稀酰胺： 4?C保存。
10%下层胶（两块胶，15ml）：
　　依次加入 去离子水 5.9ml
　　　　　　　　　30%丙烯酰胺 5ml
　　　　　　　　　1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml
　　　　　　　　　10%SDS 150μl
　　　　　　　　　10%AP 150μl
　　　　　　　　　TEMED 6μl
每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加正丁醇（1ml）消泡
5%上层胶（两块胶，6ml）：
　　依次加入 去离子水 4.1ml
　　　　　　　　　　30%丙烯酰胺 1ml
　　　　　　　　　　1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml
　　　　　　　　　　10%SDS 60μl
　　　　　　　　　　10%AP 60μl
　　　　　　　　　　TEMED 6μl
每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
7． 5X电泳液缓冲液
　　Tris（MW121.14） 15.1g
　　甘氨酸（MW75.07） 94g
　　SDS 5.00g
　　蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。
8． 10X转膜缓冲液
甘氨酸（MW75.07） 151.1g
Tris（MW121.14） 30.3g
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。
通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易产生沉淀）
9． 10XTBS缓冲液
Tris（MW121.14） 24.2g
NaCl 80.0g
蒸馏水至 1000ml
（浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。
10．1XTBST缓冲液
10XTBS缓冲液 100ml
蒸馏水 900ml
Tween-20 1 ml
因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。
溶解后室温保存。
11．封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)：
1XTBST缓冲液 95-100 ml
脱脂奶粉 5g
溶解后4℃保存，可于一周内使用。
其他商品性试剂
一抗、二抗、显影液、定影液、ECL化学发光试剂
操作步骤
（一） 蛋白样品制备
（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、 倒掉培养液，将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，（暂不作可将培养皿存于-80度）。
2、 向培养皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔，12孔板50-60ul/孔，冰上放置，摇床20min
3、 用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中，勺子在处理不同样本前清水洗净、擦干（注意冰上操作）
4、 超声处理（可选）注意蛋白悬液放于冰上，15sec处理，duty cycle 50-60 每次处理后清水洗探头、擦干，再作下一个
5、 于4℃下12000rpm离心5min。
6、 将离心后的上清分装转移倒1.5min的离心管中放于-80℃保存。
（2） 组织中总蛋白的提取：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（5ml离心管）。
2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于冰上。
3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管）
4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min,
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
（二） 蛋白含量的测定
1、 从-20℃取出1mg/mlBSA，室温融化后，备用。
2、 取7个5ml离心管，分别加入1mg/mlBSA:0、10、20、40、60、80、100ul，用蒸馏水补足各管至100ul。
3、样本取5ul，加蒸馏水95ul，使总量亦为100ul，混匀。
4、各管加G-250溶液2ml混匀，室温静止2分钟。
5、混匀后，在生物分光光度计上比色分析，测定595nm的光吸收，测定时浓度由低到高。
6、于Excel根据标准品绘制标准曲线，根据得出的公式计算样本浓度。

（三） SDS－PAGE电泳
（1） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2） 灌胶与上样
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
　　（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边）
2、 按前面方法配10％下层胶（15ml，两块胶，每块胶在6.5 ml左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。 灌胶后胶上加一层正丁醇（1ml左右），液封后的胶凝的更快。
3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。弃去正丁醇，用水冲洗，并用吸水纸将水吸干。
4、 等待胶凝期间可计算含50-100ug蛋白的溶液体积即为上样量（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量），目的蛋白GluT3一般在20-30μl左右。
取出上样样品至200μl的EP管中，加入4×上样缓冲液及DTT至终浓度均为1×（上样总体积一般不超过30μl）。上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性（亦可以使用PCR仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮沸了）。
5、 按前面方法配5％的上层胶（6ml，两块胶）,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。
　　灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小（也提示胶已经凝固），从而使加样孔的上样体积减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。
等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。
6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
*电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的上缘（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。
7、上样 (注意：最外两泳道易跑歪，尽量不用。)
Marker 6μl （Marker加在最边上的加样孔中）
样本 20-30μl
实验所用Marker电泳后出现10条带：10，15，25，35，40，55，70，100，130，170KDa
（3） 电泳：电压100V，电流300mA,功率50W，时间1.5hour。(电泳15分钟后可调节电压到130V)
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（一般要让目的条带跑过分离胶的1/3比较好）。
电泳结束前20分钟配制1X转膜缓冲液。
（四） 转膜
（1） 转一张膜需准备4张滤纸和1张硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套（因为手上的蛋白会污染膜）。将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1X转模缓冲液浸湿。
（2）夹子黑的一面：海绵-2张滤纸-胶-NC膜-2张滤纸-海绵
将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫二层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）
先将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下下层胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将硝酸纤维素膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖2张滤纸并除去气泡（膜盖下后不可再移动）。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
如果同时做两块胶，转膜的时候应记住样本的位置。
（3） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用100V转移1.5h。
* 实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块硝纤膜，以免转膜过头，因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般80-100V，时间也要延长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4度下12V转膜过夜；
* 硝纤膜建议使用0.22μ的小孔径膜，不容易转膜过头；
* 不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件；
* 转膜时电极方向注意是膜正胶负。
如果同时做两块胶，转膜结束应在膜上做标记，以便查询相应样本。
转膜结束前配制封闭液（5%脱脂牛奶)及1X TBST缓冲液。
（五） 免疫反应
（1） 封闭：将膜用移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。
（2） 一抗
a. 用parafilm膜制作与膜大小相同的槽；
b. 从封闭液中取出膜，1X TBST 5minX3次;
c. 将一抗用封闭液稀释至适当浓度（目的蛋白GluT3 1:300, actin 1:2000）；
d.将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体，室温下孵育1-2h后（目的蛋白GluT3 1.5h,actin 1h），4度过夜， 次日用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。
（3） 二抗
同上方法准备二抗稀释液（目的蛋白GluT3 1:1000,actin 1:1000）并与膜接触，室温下孵育1h后，用1X TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。
（六） 化学发光，显影，定影
（1） 将A和B两种试剂等量（常用各500μl）在5ml离心管中等体积混合；
　　　打开X-光片夹，铺上保鲜膜，将NC膜面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3min后（见到荧光），用保鲜膜包好。
（2） 将1×显影液，自来水和定影液分别到入盘中；
　　　在红灯下
* 取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min到5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；
* 曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；
* 显影结束后，先用自来水洗一下X-光片，然后再放到定影液中进行定影（这样可以延长定影液使用时间，从而节约定影液）。定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；
（七） 凝胶图象分析：将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。