生物物质分离与纯化市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

第九章第九章 生物物质分离与纯化生物物质分离与纯化王雪青第1页9.1概述概述生物物质分离（生物物质分离（Bioseparation)是生物化工一个主要组成部是生物化工一个主要组成部分，常称之为下游过程（分，常称之为下游过程（Downstream processing）。其与）。其与上中游一样主要，在某种程度上，甚至大于它们。前者处理丰上中游一样主要，在某种程度上，甚至大于它们。前者处理丰产问题，而下游分离过程处理丰收问题。产问题，而下游分离过程处理丰收问题。生物物质分离区分于其它物质分离在于生物物质分离区分于其它物质分离在于A:目标产物浓度很低。所以耗能、费用增高和产物价格也对目标产物浓度很低。所以耗能、费用增高和产物价格也对应增加。应增加。B:生物物质易受环境原因如温度、生物物质易受环境原因如温度、pH、金属离子和微生物等、金属离子和微生物等影响，增加了分离难度。影响，增加了分离难度。C:对终产品质量要求极高。尤其是医药产品或作为生物制剂对终产品质量要求极高。尤其是医药产品或作为生物制剂产品。产品。所以它是一项十分艰巨和耗资巨大工作。对于传统发酵工业所以它是一项十分艰巨和耗资巨大工作。对于传统发酵工业第2页Separation Processes:第3页来说，（如抗生素、乙醇、柠檬酸等生产来说，（如抗生素、乙醇、柠檬酸等生产),分离和提纯部分离和提纯部分费用占总投资分费用占总投资60%，而对基因工程菌发酵占到，而对基因工程菌发酵占到90%，对其下功夫研究和设计是一项十分主要和有意义工作。对其下功夫研究和设计是一项十分主要和有意义工作。表表 9-1 9-1 几个经典产品发酵液浓度几个经典产品发酵液浓度产品产品n n经典浓度经典浓度（g/L)g/L)产品产品n n经典浓经典浓度度（g/L)g/L)抗生素抗生素氨基酸氨基酸酒精酒精2525100100100100有机酸有机酸酶酶R-DNAR-DNA蛋白质蛋白质10010020201010第4页下游加工过程应遵照标准下游加工过程应遵照标准n n时间短；n n温度低n npH适中n n严格清洗和消毒第5页第6页下游加工普通工艺流程下游加工普通工艺流程发酵液发酵液细胞分离细胞分离提取、分离提取、分离纯化、精制纯化、精制产物产物胞外产物胞外产物胞内产物胞内产物离心或过滤离心或过滤细胞破碎细胞破碎整体细胞萃取整体细胞萃取离心或过滤离心或过滤离心或过滤离心或过滤干燥干燥含产物清液含产物清液废物废物离心或过滤离心或过滤干燥干燥产物产物第7页一、发酵液预处理一、发酵液预处理n n改变发酵液性质，以利于固液分离。经过酸化、加热、改变发酵液性质，以利于固液分离。经过酸化、加热、改变发酵液性质，以利于固液分离。经过酸化、加热、改变发酵液性质，以利于固液分离。经过酸化、加热、以降低发酵液黏度。以降低发酵液黏度。以降低发酵液黏度。以降低发酵液黏度。n n经过加入絮凝剂，使细胞或溶解大分子聚结成较大颗粒。经过加入絮凝剂，使细胞或溶解大分子聚结成较大颗粒。经过加入絮凝剂，使细胞或溶解大分子聚结成较大颗粒。经过加入絮凝剂，使细胞或溶解大分子聚结成较大颗粒。絮凝剂为人工合成高分子聚合物，如聚丙烯酰胺和聚乙絮凝剂为人工合成高分子聚合物，如聚丙烯酰胺和聚乙絮凝剂为人工合成高分子聚合物，如聚丙烯酰胺和聚乙絮凝剂为人工合成高分子聚合物，如聚丙烯酰胺和聚乙烯亚胺衍生物，天然有机高分子物质，如壳聚糖和葡聚烯亚胺衍生物，天然有机高分子物质，如壳聚糖和葡聚烯亚胺衍生物，天然有机高分子物质，如壳聚糖和葡聚烯亚胺衍生物，天然有机高分子物质，如壳聚糖和葡聚糖聚糖类，明胶和海藻酸钠，以及由微生物产生物质如糖聚糖类，明胶和海藻酸钠，以及由微生物产生物质如糖聚糖类，明胶和海藻酸钠，以及由微生物产生物质如糖聚糖类，明胶和海藻酸钠，以及由微生物产生物质如糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等，絮凝法常可得到粗糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等，絮凝法常可得到粗糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等，絮凝法常可得到粗糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等，絮凝法常可得到粗大絮团。大絮团。大絮团。大絮团。n n经过加入一些中性盐，造成胶体出现凝聚不稳定现象。经过加入一些中性盐，造成胶体出现凝聚不稳定现象。经过加入一些中性盐，造成胶体出现凝聚不稳定现象。经过加入一些中性盐，造成胶体出现凝聚不稳定现象。表征电解质凝聚能力大小用凝聚价，即使胶粒表征电解质凝聚能力大小用凝聚价，即使胶粒表征电解质凝聚能力大小用凝聚价，即使胶粒表征电解质凝聚能力大小用凝聚价，即使胶粒 发生凝聚发生凝聚发生凝聚发生凝聚作用最小电解质浓度。所以反离子价数越高该值就越小，作用最小电解质浓度。所以反离子价数越高该值就越小，作用最小电解质浓度。所以反离子价数越高该值就越小，作用最小电解质浓度。所以反离子价数越高该值就越小，凝聚能力就越强。惯用凝聚剂为明矾，凝聚能力就越强。惯用凝聚剂为明矾，凝聚能力就越强。惯用凝聚剂为明矾，凝聚能力就越强。惯用凝聚剂为明矾，AlCl3AlCl36H2O,6H2O,FeCl3,ZnSO4,MgCO3FeCl3,ZnSO4,MgCO3。采取凝聚方法得到凝聚体颗粒。采取凝聚方法得到凝聚体颗粒。采取凝聚方法得到凝聚体颗粒。采取凝聚方法得到凝聚体颗粒比较小。比较小。比较小。比较小。第8页二、发酵液固液分离二、发酵液固液分离n n经过固液分离，去除了发酵液中固相物质，为后续过程提供澄清或洁净原料液体。通常采取单元操作为过滤和离心。第9页设备设备特点特点缺点缺点板框过滤机板框过滤机平板过滤机平板过滤机真空旋转过滤机真空旋转过滤机管式过滤机管式过滤机蜂窝式过滤机蜂窝式过滤机深层过滤机深层过滤机n n设备设备简单，简单，操作操作轻易，轻易，适合适合大规大规模工模工业生业生产产n n分离速度分离速度低，分离低，分离效果受物效果受物料性质改料性质改变影响，变影响，劳动强度劳动强度大大过滤设备种类和特点过滤设备种类和特点过滤设备种类和特点过滤设备种类和特点第10页主要离心设备主要离心设备设备设备特点特点缺点缺点高速冷冻离心机高速冷冻离心机碟片式离心机碟片式离心机管式离心机管式离心机倾析式离心机倾析式离心机框式离心机框式离心机n n适适用于粒径适适用于粒径小，热稳定性小，热稳定性差物质回收，差物质回收，常试验实用常试验实用n n适适用于大规适适用于大规模生产，可连模生产，可连续或间歇操作，续或间歇操作，稳定性好，以稳定性好，以放大和推广。放大和推广。n n批式操作、转批式操作、转速高、分离效速高、分离效果好，含水率果好，含水率低，易放大。低，易放大。n n连续操作，易连续操作，易放大和工业应放大和工业应用，操作稳定。用，操作稳定。n n适适用于大颗适适用于大颗粒物质回收，粒物质回收，放大易，适于放大易，适于工业应用。工业应用。n n容量小，连续容量小，连续操作和规模化操作和规模化生产困难，生产困难，n n半连续或间歇半连续或间歇操作出渣及清操作出渣及清洗繁杂，连续洗繁杂，连续操作出渣固形操作出渣固形物含水率大。物含水率大。n n容量有限，噪容量有限，噪声大。声大。n n设备投资高，设备投资高，小颗粒物质回小颗粒物质回收困难。收困难。n n分离效果差，分离效果差，设备投资高，设备投资高，操作成本高。操作成本高。第11页Disc-CentrifugesSolids-retainingcentrifugeNozzle with pressurizeddischarge of concentrateNozzle with peripheralnozzlesPeriodicallysolids-ejectingcentrifugePeriodicallysolids-ejectingcentrifuge withaxial channels第12页第13页Centrifuges第14页三、细胞破碎三、细胞破碎破碎方法破碎方法机械方法机械方法非机械方法非机械方法固体剪切力固体剪切力流体剪切力流体剪切力干燥处理干燥处理溶胞处理溶胞处理球球磨磨法法压压榨榨法法高高压压匀匀浆浆超超声声法法酶酶溶溶法法化化学学法法物物理理法法第15页压力破碎法：利用压力释放时固液剪切进行破碎。操作简单，可连续操作，压力破碎法：利用压力释放时固液剪切进行破碎。操作简单，可连续操作，适用面广，但操作会产生热，需有冷却系统，同时破碎率低。适用面广，但操作会产生热，需有冷却系统，同时破碎率低。珠磨破碎法：利用固体剪切进行破碎。操作简单，可连续珠磨破碎法：利用固体剪切进行破碎。操作简单，可连续/批式操作，适用批式操作，适用面广，但操作会产生热，需有冷却系统，不一样细胞破碎条件差异大。面广，但操作会产生热，需有冷却系统，不一样细胞破碎条件差异大。超声破碎法：利用超声波形成空穴产生压力冲击进行破碎。操作简单，可连超声破碎法：利用超声波形成空穴产生压力冲击进行破碎。操作简单，可连续续/批式操作，但操作会产生热，需有冷却系统，破碎率低，适应性差。批式操作，但操作会产生热，需有冷却系统，破碎率低，适应性差。渗透压法：利用渗透压突变，造成细胞内压力差而引发细胞破碎。破碎率低，渗透压法：利用渗透压突变，造成细胞内压力差而引发细胞破碎。破碎率低，产物释放很好，操作复杂，条件要求苛刻，适合用于少许样品处理，费用高。产物释放很好，操作复杂，条件要求苛刻，适合用于少许样品处理，费用高。有机溶剂法：利用有机溶剂或表面活性剂改变细胞壁有机溶剂法：利用有机溶剂或表面活性剂改变细胞壁/膜通透性，使包内产膜通透性，使包内产物释放方法。该法简单，内含物释放少，产物较纯，可规模化生产，但适用物释放方法。该法简单，内含物释放少，产物较纯，可规模化生产，但适用面窄。面窄。第16页碱或酶处理法：利用碱或酶处理是细胞壁或膜破坏，产物得以释放。该法简碱或酶处理法：利用碱或酶处理是细胞壁或膜破坏，产物得以释放。该法简单，可规模化生产，但适用面窄。单，可规模化生产，但适用面窄。选择破碎法依据：选择破碎法依据：细胞处理量：细胞处理量：大规模，则普通采取机械法，而试验室规模，则选择非机械法。大规模，则普通采取机械法，而试验室规模，则选择非机械法。细胞壁强度和结构：细胞壁强度和结构：酵母和真菌，含有纤维素和几丁质，比细菌胞壁强度大，应选择高酵母和真菌，含有纤维素和几丁质，比细菌胞壁强度大，应选择高压匀浆法。而对于有高度分之微生物，会阻塞匀浆气阀而不能应用。压匀浆法。而对于有高度分之微生物，会阻塞匀浆气阀而不能应用。目标产物对破碎条件敏感性：目标产物对破碎条件敏感性：破碎程度：因为破碎会使细胞碎片细小，使固液分离困难，破碎程度：因为破碎会使细胞碎片细小，使固液分离困难，所以，适宜操作条件是高产物释放率，低能耗和便于后续提取三个所以，适宜操作条件是高产物释放率，低能耗和便于后续提取三个方面权衡。方面权衡。第17页Cell disruption equipment第18页第19页四、分离和纯化四、分离和纯化主要任务是提升溶液中产品浓度，同时也取出一些杂质。传统方法主要任务是提升溶液中产品浓度，同时也取出一些杂质。传统方法包含沉淀法、吸附法、离子交换、萃取法，另外，含有超滤、反渗包含沉淀法、吸附法、离子交换、萃取法，另外，含有超滤、反渗透，电渗析、凝胶电泳等，惯用为蒸发、萃取和吸附。透，电渗析、凝胶电泳等，惯用为蒸发、萃取和吸附。1.液体蒸发：又称浓缩，经过加热是溶液中部分水汽化并出去，以提升溶液浓度。蒸发连续进行必须满足而个条件：其一，确保连续提供不停汽化所需热量，同时不停移去二次蒸汽。2.液-液萃取：是一个惯用方法。应用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物分离和提取。尤其是近，与其它技术性结合产生了新分离技术，用于提取酶、蛋白质、核酸、多肽和氨基酸。如：反胶囊萃取（reversed micelle extraction),超临界萃取（supercritical fluid extraction)和液膜萃取（liquid membrane extraction)等适合DNA重组技术和遗传工程发展第20页Extractors溶质在二个互不相容溶剂分配系数不一样，溶质在二个互不相容溶剂分配系数不一样，所造成溶质转移。所造成溶质转移。混合器和澄清器混合器和澄清器第21页3.双水相萃取；双水相萃取；二种互不溶聚合物，这两种聚合物中含水率很高，普二种互不溶聚合物，这两种聚合物中含水率很高，普通在通在70-90%，这么就能够预防在有机相中变性，同时这些高聚物含，这么就能够预防在有机相中变性，同时这些高聚物含有保护和稳定蛋白质等生物活性物质作用。有保护和稳定蛋白质等生物活性物质作用。第22页4.反胶团萃取；反胶团萃取；在有机相中加入一定量表面活性剂，形成大小为毫微在有机相中加入一定量表面活性剂，形成大小为毫微米级微胶团。当此有机相与含有目标产物水相形成液米级微胶团。当此有机相与含有目标产物水相形成液-液萃取时，因为液萃取时，因为微胶团中表面活性剂带有与水相中蛋白质相反电荷，而将水相中蛋白质微胶团中表面活性剂带有与水相中蛋白质相反电荷，而将水相中蛋白质迁移入微团内水池中，实现物质提取。迁移入微团内水池中，实现物质提取。5.超临界萃取；超临界萃取；一样为溶剂萃取。而此方法使用溶剂是在超临界状态一样为溶剂萃取。而此方法使用溶剂是在超临界状态下液态气体，惯用为下液态气体，惯用为CO2,它含有液体密度和气体高扩散性，产品分离它含有液体密度和气体高扩散性，产品分离轻易等特点。受到广泛关注。轻易等特点。受到广泛关注。n nFor pure CO2,the critical conditions;Pressure(73atm),For pure CO2,the critical conditions;Pressure(73atm),temperature(31.1C)temperature(31.1C)第23页Supercritical Fluid Extraction第24页6;固体吸附：固体吸附：是物质从液相（发酵液）到固相（吸附剂）发生物质转移。此法用是物质从液相（发酵液）到固相（吸附剂）发生物质转移。此法用于蛋白质、核酸、氨基酸、抗生素等物质分离和提取。于蛋白质、核酸、氨基酸、抗生素等物质分离和提取。按照吸附剂作用原理：分为三大类。按照吸附剂作用原理：分为三大类。A物理吸附：物理吸附：依靠范德华力作用。吸附剂可用活性炭、硅藻土、硅胶、分子筛和依靠范德华力作用。吸附剂可用活性炭、硅藻土、硅胶、分子筛和氧化铝等。氧化铝等。B静电吸附：静电吸附：借助静电引力吸附物质。主要为合成树脂。借助静电引力吸附物质。主要为合成树脂。C:亲和吸附：亲和吸附：在树脂上嫁接一个能与要分离物质发生特异性反应配基。在树脂上嫁接一个能与要分离物质发生特异性反应配基。第25页五、提纯五、提纯1，层析法（，层析法（Elution Chromatography)又称洗脱法又称洗脱法/色谱法。他们与吸色谱法。他们与吸附法本质上是相同。但在操作过程不一样。造成了结果不一样。附法本质上是相同。但在操作过程不一样。造成了结果不一样。吸附法吸附和洗脱间断进行，搜集洗脱液也为一次性、不分段。所以，只有吸附法吸附和洗脱间断进行，搜集洗脱液也为一次性、不分段。所以，只有浓缩而无分离。浓缩而无分离。层析法则是吸附和洗脱同时进行，分段搜集洗脱液，所以分离和浓缩同时完层析法则是吸附和洗脱同时进行，分段搜集洗脱液，所以分离和浓缩同时完成。成。层析法又分为离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析层析法又分为离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析第26页Column Chromatography第27页Ion Exchange第28页Gel Filtration第29页Affinity Chromatography第30页2：沉淀法：沉淀法适合大规模生产，经过采取不一样伎俩使发酵液中目标适合大规模生产，经过采取不一样伎俩使发酵液中目标物质溶解度降低，使之发生沉淀，到达分离提纯目标。物质溶解度降低，使之发生沉淀，到达分离提纯目标。惯用等电点沉淀法、盐析法、加热沉淀法、有机溶剂沉惯用等电点沉淀法、盐析法、加热沉淀法、有机溶剂沉淀法等淀法等3.超滤法超滤法是一个半透膜，使溶液中溶剂和小分子物质经过，而阻是一个半透膜，使溶液中溶剂和小分子物质经过，而阻止截流大分子物质方法。止截流大分子物质方法。超滤区分于常规过滤主要采取了错流伎俩消除浓差极化超滤区分于常规过滤主要采取了错流伎俩消除浓差极化第31页4：电泳法：电泳法在电场作用下发生带电粒子定向运动，其移动速度受到在电场作用下发生带电粒子定向运动，其移动速度受到物质所带电荷多少而不一样，依据此而进行分离纯化方物质所带电荷多少而不一样，依据此而进行分离纯化方法。法。该法无法实该法无法实现规模化生现规模化生产，价格贵。产，价格贵。量少。量少。第32页SDS PAGE of Purification10 micrograms loaded in each lane 第33页六、最终加工六、最终加工包含结晶和干燥包含结晶和干燥第34页第35页Industrial Scale upn nTo transfer the pilot scale results into a commercially feasible production setting.n nFermentor sizes range from 100 L to 500,000 L,depending on products.第36页