实验三---线粒体活体染色.pptx

实验三 线粒体活体染色线粒体活体染色n实验目的：实验目的：掌握线粒体活体染色的方法与原理掌握线粒体活体染色的方法与原理n实验原理：实验原理：线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。活活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线粒体的专一是线粒体的专一性活体染色剂。呈碱性，具有脂溶性，能够穿过细胞膜进入细胞内，并性活体染色剂。呈碱性，具有脂溶性，能够穿过细胞膜进入细胞内，并通过其结构中带有正电荷的染色基团结合到带负电荷的线粒体内膜上。通过其结构中带有正电荷的染色基团结合到带负电荷的线粒体内膜上。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。胞质中染料被还原，成为无色状态。线粒体活体染色活体染色：是使生活有机体的细胞或组织特异性着色，活体染色：是使生活有机体的细胞或组织特异性着色，但对该样本又没有毒害作用的一种染色方法。但对该样本又没有毒害作用的一种染色方法。目的：既显示活体细胞内的某些结构，又不影响细胞目的：既显示活体细胞内的某些结构，又不影响细胞的生命活动和产生任何物理和化学变化以致细胞的死亡。的生命活动和产生任何物理和化学变化以致细胞的死亡。应用：活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形应用：活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和细胞生理、病理状态态结构和细胞生理、病理状态线粒体活体染色1、人口腔粘膜上皮细胞活体染色显示线粒体（1）用消毒牙签刮取口腔粘膜细胞，用力应稍重些，以便得到生活力教旺盛的细胞，将刮取物涂在载玻片中央。（2）滴1滴詹纳斯绿B染液于细胞涂片处，23分钟后盖上盖玻片。（3）用显微镜观察，在高倍镜下可见细胞质中散在一些被染成亮绿色的短棒状和圆形颗粒，即为线粒体。线粒体活体染色小鼠肝细胞中线粒体的显示实验四 染色体标本制备染色体标本制备n实验目的：初步掌握动物骨髓（精巢细胞）染色体标本制备基本过程，了解操作步骤的原理。染色体标本制备实验原理：染色体是细胞内遗传物质的载体。骨髓细胞具有高度的分裂能力，可直接观察到细胞周期中的各个时相。但通常情况下，中期染色体在镜下的数量较少，如经秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞大多被阻断在有丝分裂中期，经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可得到理想的染色体标本，用以观察中期染色体形态和染色体组型分析等实验。实验仪器、用具实验仪器、用具n天平n离心机n温箱n显微镜n酒精灯n注射器n解剖盘n解剖剪n刀片n离心管n吸管n烧杯n冰冻载玻片染色体标本制备骨髓细胞染色体标本制备1.秋水仙素处理动物：按4g/g体重的剂量经腹腔注 射秋水仙素，34h后杀死动物。2.取骨髓取出动物后肢的股骨，剪去两端骨骺。用注射器吸取2ml 0.075M KCl溶液注入骨髓腔，将 骨髓细胞冲入离心管中，用吸管反复吸打骨髓细胞，使细胞团块分散。3.加至5ml低渗液，吹打后将离心管置37水浴中低渗 20min。精巢细胞染色体标本制备1.秋水仙素处理动物：按4g/g体重的剂量经腹腔注 射秋水仙素，34h后杀死动物。2.取雄性小鼠睾丸及附睾组织，将其放在平皿中。加入 2ml 0.075M KCl低渗液，用剪子剪开睾丸及附睾组 织，使精细胞游离出来，吸取上清液转移到离心管中。3.加至5ml低渗液，吹打后将离心管置37水浴中低渗 20min。染色体标本制备4.1000rmin离心8min。，弃上清液。5.固定：加入新配制的甲醇：冰醋酸(3：1)固定液5ml，立即用吸管将细胞轻轻吸打均匀，静置固定20min。（如此反复固定23次，每次20min。）6.滴片：固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，加入 少量新配制的固定液，将细胞团块轻轻吸打成悬液。在干净、冰冷的载玻片上滴23滴上层细胞悬液，在酒精灯上文火烘干。染色体标本制备7.染色：将玻片标本放于染缸中，用1：10 Giemsa应 用液染色10min。8.冲洗：在自来水管下细流水冲洗15s。9.观察：用滤纸吸干玻片标本，置于显微镜观察。染色体标本观察1.在显微镜下可观察到染色体被Giemsa应用液染为紫 红色或桃红色。小鼠染色体数目2n=40。2.在低倍镜下可见较多的圆形的间期细胞核。寻找染 色体分散良好的中期分裂相，移至视野中央，然后 用油镜观察。在油镜下，可见40条清晰的染色体，每条染色体中，还可以见到着丝粒、染色体长臂和 短臂等特征。油镜下小鼠骨髓细胞染色体油镜下观察染色体标本观察线粒体活体染色线粒体活体染色ACCMMN线粒体电镜观察线粒体电镜观察CCMNMVLCBMMNNNMVMVLL线粒体电镜观察