臭椿酮对非小细胞肺癌顺铂耐药细胞A549_DDP的增敏作用.pdf

Vol.40 No.3 2023承 德 医 学 院 学 报JOURNAL OF CHENGDE MEDICAL UNIVERSITY181基础医学臭椿酮对非小细胞肺癌顺铂耐药细胞A549/DDP的增敏作用李祥伶1，刘承一2，刘 镭1，陈 龙1，于胜利3，许 倩1*（1.承德医学院基础医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院；3.承德市生态环境检验监测站）摘要：目的 探讨臭椿酮（AIL）对非小细胞肺癌顺铂耐药细胞系A549/DDP的增敏作用。方法 采用MTT检测AIL对A549和A549/DDP细胞活力的影响；Chou-Talalay中效法分析臭椿酮与顺铂的联合用药指数（CI）；流式细胞术检测细胞周期及凋亡，Western blotting法检测凋亡相关蛋白表达水平。结果 AIL（0.6mol/L）与DDP（50g/mL）联合用药有协同作用；细胞周期阻滞在G1期，同时细胞凋亡率升高；Caspase-3和 Bcl-2蛋白表达下降，Cleaved Caspase3、Bax、CDK4和CyclinD1的蛋白表达升高。结论 AIL可增强A549/DDP细胞对DDP的敏感性，协同DDP抑制A549/DDP细胞的生长，促进其凋亡。关键词：臭椿酮；顺铂；非小细胞肺癌；A549/DDP细胞；增敏中图分类号：R285 文献标志码：A 文章编号：1004-6879（2023）03-0181-06Ailanthone Sensitizes Resistant Cell Line A549/DDP to Cisplatinin Non-small Cell Lung CancerLI Xiang-ling1,LIU Cheng-yi2,LIU Lei1,CHEN Long1,YU Sheng-li3,XU Qian1*(1.School of Basic Medicine,Chengde Medical University,Chengde,Hebei,067000,China;2.Affi liated Hospital of Chengde Medical University;3.Chengde Ecological environment inspection and monitoring Station)Abstract:Objective To investigate the sensitization effect of Ailanthone(AIL)on cisplatin-resistant A549/DDP cells of non-small cell lung cancer.Methods The effects of AIL on the viability of A549 and A549/DDP cells were detected by MTT.Analysis of the combined drug use index(CI)of Ailanone and cisplatin using Chou-Talalay.Cell cycle and apoptosis were detected by fl ow cytometry,and the expression of apoptosis-related proteins were detected by Western blotting.Results AIL(0.6mol/L)and DDP(50g/mL)had synergistic effect.Cell cycle arrest and apoptosis rate increased in G1 phase.The protein expression of caspase-3 and bcl-2 decreased,but the protein expression of Cleaved Caspase3,Bax,CDK4 and CyclinD1 increased.Conclusion AIL enhanced the sensitivity of DDP to A549/DDP,and increased the growth inhibition and apoptosis of DDP on A549/DDP.Key words:ailanthone;cisplatin;non-small cell lung cancer;A549/DDPcells;sensibilization资助项目：国家自然科学基金项目（81703001）；河北省重点研发计划项目（19277783D）；河北省自然科学基金资助项目（H2021406021）；河北省医学科学研究计划项目（20210247；20221335）；承德医学院重大项目科研专项（KY2020005）；政府资助临床医学优秀人才培养项目；河北省高校重点学科建设冀教高（2013）4号*通讯作者肺癌是导致死亡最常见的恶性肿瘤之一1,2。据统计3,4，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在肺癌中患病率超过80%，且5年生存率仅为21%。目前，顺铂（cisplatin，DDP）仍是化疗一线用药，但长期使用会出现抗药性而导致治疗失败5。因此，寻找一种药物与之联用，增加药物敏感性，是肿瘤治疗研究中的热点。中草药具有可利用性、有效性高且毒性相对较低的优势6。臭椿酮（ailanthone，AIL）是椿皮中提取的一种苦木苦味素类药物，早期研究多在抗菌、抗炎等方面，最近发现其在抗肿瘤方面也有显著作用，如前列腺癌、结直承 德 医 学 院 学 报JOURNAL OF CHENGDE MEDICAL UNIVERSITY182Vol.40 No.3 2023肠癌等7-9。AIL亦能逆转DDP、阿霉素等药物的耐药性10，但机制尚不明确，且在NSCLC的治疗中尚未见报道。因此，本文就AIL对A549/DDP细胞的增敏作用展开研究，为NSCLC中药辅助治疗提供新思路。1 材料与方法1.1 仪器美国BD公司FACS CaLibur型流式细胞仪；中国上海天能公司6100型化学发光仪；美国博腾公司ELX808TM型酶标仪；中国麦克奥迪公司AE2000型倒置光学显微镜；中国大龙兴创公司D3024R型台式高速冷冻离心机；中国海尔公司HR30-2A2型生物安全柜。1.2 细胞及试剂人肺癌细胞A549及人肺癌DDP耐药细胞（A549/DDP细胞）购于上海喆文生物科技有限公司；AIL（货号：SA9130)、MTT（货号：SA9130、M818C)、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；DDP（货号：HY-17394/CS-1122）购于美国MCE公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测和周期检测试剂盒（货号AP101、CCS012）购于杭州联科生物技术股份有限公司；PBS缓冲液（1）、RPMI-1640 培养基及Trypsin-EDTA Solution（0.25%，1）购于美国Gibco公司；胎牛血清购于以色列Biological Industries公司。1.3 细胞培养A549细胞和A549/DDP细胞用含有10%FBS的RPMI-1640 培养基，置于37，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。1.4 MTT法检测细胞活力将对数生长期的A549和A549/DDP细胞，胰酶消化，计数，以1104个/孔接种于96孔板中，培养24h，分别按以下方案加药处理。方案一：A549细胞中加入梯度浓度（0、0.05、0.1、0.2、1、2、10、20、40mol/L）AIL；方案二：A549/DDP细胞中加入梯度浓度（0、0.2、2、20、40、80、160、320mol/L）AIL；方案三：为确定低毒性AIL浓度，在A549/DDP细胞中加入梯度浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2mol/L）AIL；方案四：在A549/DDP细胞中加入梯度浓度（0、25、50、100、200、400、800g/mL）DDP，并联合低浓度AIL。继续培养24h，加入MTT，孵育4h，加入100L二甲基亚砜，震荡13min。用酶标仪在490nm波长处检测各孔OD值，计算细胞存活率。1.5 药物联合作用的评价 利用CompuSyn软件中的Chou-Talalay中效分析法11，计算AIL与DDP联合用药的CI值，若CI1，认为两种药物有协同作用，CI=1认为两种药物有相加作用，CI1认为两种药物有拮抗作用12,13。1.6 流式细胞术检测细胞周期将对数生长期的A549/DDP细胞以1106个/皿接种于培养皿中，培养24h，分空白组、DDP组（50g/mL）、AIL组（0.6mol/L）、AIL（0.6mol/L）+DDP（50g/mL）组用药，继续培养24h，收集各组细胞。根据试剂说明每组加入1mL DNA Staining solution和10L Permeabilization solution，涡旋振荡10s混匀。室温避光孵育30min，低速上样，流式细胞仪进行检测。1.7 流式细胞术检测细胞凋亡细胞培养及用药分组如1.6，收集各组细胞，根据试剂说明向每组加入100L 1Binding Buffer、5L Annexin V-FITC 和10L PI试剂混匀，室温避光孵育5min，流式细胞仪进行检测。1.8 Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达细胞培养及用药分组如1.6，加入RIPA细胞裂解液，提取总蛋白，12000r/min离心1520min取上清，BCA法定量蛋白，取适量蛋白加入5蛋白上样缓冲液，100煮沸10min变性，上样后行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2h，加入相应一抗（抗Bcl-2、Bax、Caspase-3等抗体均1:2000稀释，抗-ACTIN抗体1:10000稀释），4过夜，次日用TBST清洗3次，加入二抗（山羊抗兔IgG以1：5000稀释）孵育1h，TBST清洗3次，凝胶成像系统显影，拍照，ImageJ软件分析条带灰度值，计算目的蛋白的相对表达水平。1.9 统计学方法采用SPSS 25.0软件统计分析，数据以均值标准差（）表示，采用单因素方差分析进行3组或3组以上的差异比较，采用Bonferroni进行组间两两比较。以P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 AIL对A549及A549/DDP细胞活力的影响MTT实验结果发现，用不同浓度AIL作用A549细胞，当药物浓度0.05mol/L时，细胞活力明显下降（图1A，P0.05）；而用不同浓度AIL作用A549/DDP细胞后，0.2mol/L浓度对细胞活力无明显影响（图1B，P0.05），Vol.40 No.3 2023承 德 医 学 院 学 报JOURNAL OF CHENGDE MEDICAL UNIVERSITY183药物浓度2mol/L时，细胞活力显著下降（图1B，P0.05）。为选择AIL作用的低毒性，用低梯度浓度AIL作用A549/DDP后，发现0.6mol/L为具有统计学意义的最低浓度（图1C，P0.05），可作为下一步实验的用药浓度。图1 AIL对A549、A549/DDP细胞活力的影响A：不同浓度AIL作用A549细胞；B：不同浓度AIL作用A549/DDP细胞；C：低浓度AIL作用A549/DDP细胞与空白组比较：*P0.05，nsP0.05；n=52.2 AIL与DDP联合用药的协同作用 采用CompuSyn软件计算AIL与DDP联合用药的CI值，如表1所示。当DDP浓度50g/mL时，CI1，说明联合用药有协同作用。当DDP浓度为50g/mL，与0.6mol/L AIL联合应用时，A549/DDP细胞的抑制率为37.181.90%，CI值为0.720.09%。因此，为了减少药物不良反应，选择药物浓度小且具有联合作用的50g/mL浓度的DDP进行后续实验。表1 0.6mol/L AIL与不同浓度DDP联合作用A549/DDP细胞的联合用药指数AIL（M）+DDP（g/mL）抑制率（%)联合用药指数（CI)0.6+2524.593.961.070.040.6+5037.181.900.720.090.6+10053.700.850.390.030.6+20059.671.890.550.060.6+40063.942.330.850.040.6+80083.960.570.290.122.3 AIL对A549/DDP细胞周期的影响流式细胞术检测AIL对A549/DDP细胞周期的影响，如图2。与空白组比较，AIL+DDP组、AIL组细胞在G1期明显阻滞，与DDP组比较，AIL组细胞在G1期阻滞增加（图2B，P0.05）；且分别与空白组、DDP组、AIL组相比，AIL+DDP组细胞在G2期明显阻滞（图2C，P0.05）；各组细胞S期无明显改变（图2D，P0.05）。图2 用药后各组A549/DDP细胞细胞周期变化情况A：流式细胞术检测细胞周期；B：G1期；C：G2期；D：S期与空白组比较：*P0.05；与DDP组比较：#P0.05；与AIL组比较：&P0.05承 德 医 学 院 学 报JOURNAL OF CHENGDE MEDICAL UNIVERSITY184Vol.40 No.3 2023组比较，AIL+DDP组中Cleaved Caspase3、Bax的表达水平明显升高；AIL组比空白组的Cleaved Caspase3、Bax表达水平显著增加（图4B、C，P0.05）。与空白组、DDP组比较，AIL+DDP组中CDK4、CyclinD1的表达水平上升；AIL组与空白组、DDP组相比，AIL组CDK4、CyclinD1的蛋白表达水平明显上升（图4D、G，P0.05）。2.4 AIL对A549/DDP细胞凋亡的影响流式细胞术检测细胞凋亡情况，如图3。结果显示，空白组、DDP组、AIL组和AIL+DDP组的凋亡率分别是10.460.52%、36.030.63%、16.510.96%和40.440.79%（图3A）。与空白组、DDP组和AIL组比较，AIL+DDP组细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义（图3B，P0.05）。2.5 AIL对A549/DDP细胞凋亡及周期相关蛋白的影响。AIL作用于A549/DDP细胞后，Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase3、CDK4、CyclinD1的蛋白表达水平，如图4所示。分别与空白组、DDP组和AIL组比较，AIL+DDP组中Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平均明显下降，AIL组比空白组Caspase-3、Bcl-2表达水平显著下调（图4E、F，P0.05）。AIL+DDP组与空白组、DDP组、AIL图3 用药后各组A549/DDP细胞凋亡率A：流式细胞术检测细胞凋亡；B：总凋亡率与空白组比较：*P0.05；与DDP组比较：#P0.05；与AIL组比较：&P0.05图4 用药后各组A549/DDP细胞中蛋白表达水平A：Western blot检测凋亡及周期相关蛋白；B：Bax蛋白表达水平；C：Cleaved Caspase3蛋白表达水平；D：CDK4蛋白表达水平；E：Bcl-2蛋白表达水平；F：Caspase3蛋白表达水平；G：CyclinD1蛋白表达水平与空白组比较：*P0.05；与DDP组比较：#P0.05；与AIL组比较：&P0.05Vol.40 No.3 2023承 德 医 学 院 学 报JOURNAL OF CHENGDE MEDICAL UNIVERSITY1853 讨论DDP化疗是晚期NSCLC以及手术切除后降低复发风险的重要治疗手段14。然而，DDP的持续使用会造成患者产生抗药性，从而导致NSCLC治疗失败6。研究15表明，有多种机制参与了顺铂耐药，包括顺铂在细胞内积累减少、外排增加、DNA修复能力增强、修复途径增加以及凋亡受抑制等。因此，寻找一种低毒高效的药物，增加DDP敏感性，降低化疗用药量，是目前NSCLC治疗中一个非常重要的策略。中药单体作为我国独特的治疗手段，因其低毒高效成为目前抗肿瘤辅助药物开发的重点16。AIL即为中草药椿皮中提取的小分子化合物。本研究发现，AIL作用A549细胞后，当物浓度0.05mol/L时，细胞活力明显下降；作用A549/DDP细胞后，药物浓度2mol/L时，细胞活力显著下降，这表明AIL对A549、A549/DDP细胞的增殖具有明显抑制作用，这与田艳等17研究一致。细胞凋亡是维持生物体和细胞内稳态的一个重要生物学过程。Caspase-3是参与凋亡的主要途径之一18,19。在对乳腺癌的研究20中发现，AIL具有诱导细胞凋亡，并将细胞周期阻滞细胞在G1期。本研究进一步检测AIL作用后A549/DDP细胞周期和凋亡情况，结果亦提示AIL作用A549/DDP细胞后，细胞在G1期阻滞，而AIL与DDP联合作用后，细胞在G1期和G2期都发生了明显的阻滞，且周期相关蛋白CDK4、CyclinD1蛋白的表达水平显著升高，AIL可以抑制A549/DDP细胞增殖。本研究检测亦发现，细胞总凋亡率从单独使用DDP的（36.030.63）%上升到联合应用后的（40.440.79）%，同时检测凋亡相关蛋白的表达情况。AIL用药后，Caspase-3表达水平显著下降，Cleaved Caspase3表达水平明显升高，进一步说明AIL增加A549/DDP细胞对DDP的敏感性可能通过Caspase3介导的凋亡途径。另外，Bcl-2和Bax都是Bcl-2家族的同源蛋白，有研究21,22指出Bcl-2相关蛋白的表达与顺铂耐药联系密切。本研究结果显示，AIL与DDP联合作用A549/DDP细胞后，Bcl-2的蛋白表达水平明显下调，而Bax蛋白表达水平显著上升。综上所述，AIL能抑制A549/DDP细胞的增殖，诱导其凋亡，增强DDP对A549/DDP的敏感性，抑制A549/DDP细胞生长并促进其凋亡。但是，AIL能否逆转肺癌DDP耐药尚不可知，其机制也有待研究。参考文献Cao M,Li H,Sun D.Cancer burden of major cancers in China:A need for sustainable actionsJ.Cancer Commun(Lond),2020,40(5):205-210.Wu H,Mu X,Liu L,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells-derived exosomal microRNA-193a reduces cisplatin resistance of non-small cell lung cancer cells via targeting LRRC1J.Cell Death Dis,2020,11(9):801.Meng J,Chang C,Chen Y,et al.EGCG overcomes gefitinib resistance by inhibiting autophagy and augmenting cell death through targeting ERK phosphorylation in NSCLCJ.Onco Targets Ther,2019,12:6033-6043.Miller KD,Siegel RL,Lin CC,et al.Cancer treatment and survivorship statistics,2016J.CA Cancer J Clin,2016,66(4):271-289.Panneerselvam J,Mohandoss P,Patel R,et al.DCLK1 Regulates 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与对照组相比较，各褪黑素组增殖率均显著下降，且细胞增殖率随褪黑素浓度的增加先升后降，以10 nmol/L褪黑素处理组的增殖率最高。GSIS实验结果显示，与对照组相比较，1 nmol/L、5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L褪黑素组的胰岛素浓度均显著下降，差异均有统计学意义（均P0.05），且GSIS功能随褪黑素浓度的增加先升后降，以10 nmol/L褪黑素组最高。Western blot实验结果显示，与对照组相比，褪黑素组和SB203580组均能显著降低p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白的表达水平（均P0.05）；与褪黑素组或SB203580组相比，褪黑素联合SB203580处理组p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白的表达水平均显著降低（均P0.05）。结论 褪黑素对胰岛细胞呈现倒U型损害作用，10 nmol/L褪黑素损害最小；褪黑素对胰岛细胞p38 MAPK信号通路产生抑制作用。关键词：褪黑素；糖尿病；胰岛素；INS-1细胞；p38 MAPK；增殖中图分类号：R34 文献标志码：A 文章编号：1004-6879(2023)03-0186-05资助项目：江西省自然科学基金（20202BABL216043）；江西省教育厅科学技术研究项目（GJJ211040）19202122