免疫增殖性疾病的免疫学检验.pptx

第九单元 免疫增殖性疾病免疫学检验免疫增殖性疾病免疫学检验免疫增殖性疾病的免疫学检验第1页概概 述述v免疫增殖病通常是指以浆细胞、淋巴细胞和巨噬细免疫增殖病通常是指以浆细胞、淋巴细胞和巨噬细胞异常增生为特征疾病，其表现往往有免疫功效异胞异常增生为特征疾病，其表现往往有免疫功效异常及免疫球蛋白质和量改变。常及免疫球蛋白质和量改变。v与免疫学检验最为亲密是与免疫学检验最为亲密是B淋巴细胞异常增殖或其淋巴细胞异常增殖或其它造成免疫球蛋白异常免疫球蛋白病，免疫球蛋白它造成免疫球蛋白异常免疫球蛋白病，免疫球蛋白病主要表现为高免疫球蛋白血症。病主要表现为高免疫球蛋白血症。免疫增殖性疾病的免疫学检验第2页v当临床上考虑为多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它当临床上考虑为多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它浆细胞恶变等免疫球蛋白病时，普通先以血清蛋白区浆细胞恶变等免疫球蛋白病时，普通先以血清蛋白区带电泳、免疫球蛋白定量检测或尿本周蛋白定性作带电泳、免疫球蛋白定量检测或尿本周蛋白定性作为初筛试验。为初筛试验。v假如发觉有异常球蛋白区带，继而进行免疫固定电泳、假如发觉有异常球蛋白区带，继而进行免疫固定电泳、免疫球蛋白亚型定量等检测做深入定量分析和免疫球免疫球蛋白亚型定量等检测做深入定量分析和免疫球蛋白分类判定。蛋白分类判定。免疫增殖性疾病的免疫学检验第3页试验一试验一血清免疫固定电泳试验血清免疫固定电泳试验免疫增殖性疾病的免疫学检验第4页试验目标试验目标v本试验以血清免疫固定电泳试验为例进行实习本试验以血清免疫固定电泳试验为例进行实习v经过实习，熟悉血清免疫固定电泳试验过程及注意经过实习，熟悉血清免疫固定电泳试验过程及注意事项；掌握血清免疫固定电泳检测事项；掌握血清免疫固定电泳检测M蛋白基本原理蛋白基本原理与临床意义。与临床意义。免疫增殖性疾病的免疫学检验第5页试验原理试验原理v 将患者血清在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后，将固定剂将患者血清在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后，将固定剂和各型和各型Ig及其轻链抗血清加于凝胶表面各自泳道上，经孵育及其轻链抗血清加于凝胶表面各自泳道上，经孵育让固定剂和抗血清在各自泳道对应凝胶内渗透并扩散，若让固定剂和抗血清在各自泳道对应凝胶内渗透并扩散，若有对应抗原存在，则在适当位置形成抗原抗体复合物并沉有对应抗原存在，则在适当位置形成抗原抗体复合物并沉淀下来。电泳凝胶在洗脱液中漂洗，去除未结合蛋白质，淀下来。电泳凝胶在洗脱液中漂洗，去除未结合蛋白质，仅保留贮存在凝胶内抗原抗体复合物。经染色后蛋白质电仅保留贮存在凝胶内抗原抗体复合物。经染色后蛋白质电泳参考道和抗原抗体沉淀区带被泳参考道和抗原抗体沉淀区带被Acide Violet染色液着色。染色液着色。依据电泳移动距离分离出单克隆组分。依据电泳移动距离分离出单克隆组分。免疫增殖性疾病的免疫学检验第6页试剂与器材试剂与器材vAcide Violet染色液：用染色液：用1L 10%冰醋酸溶解冰醋酸溶解Acide Violet。v脱色液：用脱色液：用1L蒸馏水溶解蒸馏水溶解Citric Acid Destain。v清洗液清洗液：8L蒸馏水溶解蒸馏水溶解Tris-Buffered Saline。v电泳仪：电泳仪：spife 3000全自动电泳仪。全自动电泳仪。免疫增殖性疾病的免疫学检验第7页Spife 3000全自动电泳仪全自动电泳仪免疫增殖性疾病的免疫学检验第8页操作步骤操作步骤v样本处理：样本处理：用生理盐水将血清标本适当稀释后备用，其中同一份血清用生理盐水将血清标本适当稀释后备用，其中同一份血清第一泳道样本稀释第一泳道样本稀释3倍，第二至第六泳道样本稀释倍，第二至第六泳道样本稀释5倍。倍。免疫增殖性疾病的免疫学检验第9页v区带电泳区带电泳 上样上样 胶片准备胶片准备 电泳电泳免疫增殖性疾病的免疫学检验第10页v沉淀反应沉淀反应 加抗血清加抗血清洗涤、烘干洗涤、烘干着着 色色 免疫增殖性疾病的免疫学检验第11页结果分析结果分析 v对染色烘干后胶片进行判读。将第一泳道作为血清蛋白分对染色烘干后胶片进行判读。将第一泳道作为血清蛋白分子量参考道，观察第二至第六泳道有没有对应特异性单克子量参考道，观察第二至第六泳道有没有对应特异性单克隆免疫球蛋白条带。如图隆免疫球蛋白条带。如图12-1所表示所表示,其中其中sp泳道为血清蛋泳道为血清蛋白参考道，由下至上分别为白蛋白、白参考道，由下至上分别为白蛋白、1球蛋白、球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白。第球蛋白。第2、3、4、5、6泳道分别为泳道分别为IgG、IgA、IgM、抗血清泳道。抗血清泳道。免疫增殖性疾病的免疫学检验第12页免疫增殖性疾病的免疫学检验第13页注意事项注意事项v标本需取新鲜血清进行分析，为防止抗原过剩引发带现象，标本需取新鲜血清进行分析，为防止抗原过剩引发带现象，血清于加样前应先作适当稀释并混匀。血清于加样前应先作适当稀释并混匀。v总免疫球蛋白水平总免疫球蛋白水平20g/L稀释剂量加倍，当总免疫球蛋白稀释剂量加倍，当总免疫球蛋白水平水平5g/L稀释剂量减半（除了稀释剂量减半（除了ELP泳道）。泳道）。v一些样本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝胶）冷藏或冰冻后，一些样本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝胶）冷藏或冰冻后，可能变得粘稠或混浊。这种样本可能因为扩散障碍而存在可能变得粘稠或混浊。这种样本可能因为扩散障碍而存在点样问题。在这么情况下，加点样问题。在这么情况下，加25l液化剂于液化剂于75l血清中，混血清中，混匀匀15s。然后按要求程序继续进行。然后按要求程序继续进行。免疫增殖性疾病的免疫学检验第14页v一些单克隆蛋白质可能因多聚体而造成全部免疫固定一些单克隆蛋白质可能因多聚体而造成全部免疫固定泳道上均出现单克隆片段。在这么情况下可加泳道上均出现单克隆片段。在这么情况下可加25l还还原剂（原剂（1-巯基乙醇）于巯基乙醇）于75l血清混匀并令其反应最血清混匀并令其反应最少少15min（至多（至多3h)后按要求程序继续进行。后按要求程序继续进行。v在电泳之前，凝胶与电泳槽贴合面充满电泳介质，并在电泳之前，凝胶与电泳槽贴合面充满电泳介质，并确保二者之间无气泡。确保二者之间无气泡。免疫增殖性疾病的免疫学检验第15页v在抗血清加入血清加样孔后，确保血清与凝胶之间无在抗血清加入血清加样孔后，确保血清与凝胶之间无气泡。气泡。v染色之前胶片一定要置于洗涤液中充分洗涤，以出去染色之前胶片一定要置于洗涤液中充分洗涤，以出去游离血清和抗血清成份，降低染色后凝胶背景色。游离血清和抗血清成份，降低染色后凝胶背景色。免疫增殖性疾病的免疫学检验第16页临床应用临床应用v本法可对各类本法可对各类Ig及其轻链进行分型，最惯用于临床及其轻链进行分型，最惯用于临床常规常规M蛋白分型与判定。通惯用于单克隆蛋白分型与判定。通惯用于单克隆Ig增殖病，增殖病，单克隆单克隆Ig病，本周蛋白和游离轻链病、多组份单克病，本周蛋白和游离轻链病、多组份单克隆隆Ig病，重链病、脑脊液寡克隆蛋白判别、多克隆病，重链病、脑脊液寡克隆蛋白判别、多克隆Ig病诊疗和判别诊疗。病诊疗和判别诊疗。v免疫固定电泳优点是分辨率高、敏感度高、操作周免疫固定电泳优点是分辨率高、敏感度高、操作周期短（仅需数小时）、结果易于分析。期短（仅需数小时）、结果易于分析。免疫增殖性疾病的免疫学检验第17页思索题思索题v结合试验室免疫固定电泳分析系统，简述血清结合试验室免疫固定电泳分析系统，简述血清免疫固定电泳影响原因及其克服免疫固定电泳影响原因及其克服方法。方法。温州医学院温州医学院 陶志华陶志华免疫增殖性疾病的免疫学检验第18页试验二试验二 血清血清IgG定量检测可定量检测可汇报范围评价试验汇报范围评价试验 免疫增殖性疾病的免疫学检验第19页v可汇报范围指能够汇报全部结果范围，包含两种类型范可汇报范围指能够汇报全部结果范围，包含两种类型范围，即分析测量范围和临床可汇报范围。围，即分析测量范围和临床可汇报范围。v分析测量范围指对没有进行任何预处理（稀释，浓缩等）分析测量范围指对没有进行任何预处理（稀释，浓缩等）标本，分析方法能够直接测定出待测物范围，也就是系标本，分析方法能够直接测定出待测物范围，也就是系统最终输出值（活性或浓度）与被分析物活性或浓度成统最终输出值（活性或浓度）与被分析物活性或浓度成线性百分比范围，它反应整个系统输出特征。线性百分比范围，它反应整个系统输出特征。概述概述免疫增殖性疾病的免疫学检验第20页v临床可汇报范围临床可汇报范围 是指对临床诊疗、治疗有意义待测物浓是指对临床诊疗、治疗有意义待测物浓度范围。此范围假如超出了分析测量范围，可将标本经过度范围。此范围假如超出了分析测量范围，可将标本经过稀释、浓缩等预处理使待测物浓度处于分析测量范围内，稀释、浓缩等预处理使待测物浓度处于分析测量范围内，最终结果乘以稀释倍数。最终结果乘以稀释倍数。免疫增殖性疾病的免疫学检验第21页试验目标试验目标v掌握血清掌握血清IgG定量检测可汇报范围评价原理和方法学，定量检测可汇报范围评价原理和方法学，了解血清了解血清IgG测定方法学性能。测定方法学性能。免疫增殖性疾病的免疫学检验第22页试验原理试验原理v因为抗原抗体反应特殊性，免疫学检测项目应使用多点定因为抗原抗体反应特殊性，免疫学检测项目应使用多点定标绘制标准曲线，在绘制标准曲线上查阅结果。因为计算标绘制标准曲线，在绘制标准曲线上查阅结果。因为计算机技术发展，仪器可对反应响应呈不一样表现结果做适当机技术发展，仪器可对反应响应呈不一样表现结果做适当处理，直接以最终计量单位方式汇报检验结果，在此情况处理，直接以最终计量单位方式汇报检验结果，在此情况下，评价患者结果可汇报范围时，可无须再去评价响应结下，评价患者结果可汇报范围时，可无须再去评价响应结果真实曲线状态，只要将样品作不一样程度稀释或配制后，果真实曲线状态，只要将样品作不一样程度稀释或配制后，将预期值和实际检测值作比较，绘制在坐标纸上应呈一条将预期值和实际检测值作比较，绘制在坐标纸上应呈一条经过原点、斜率为经过原点、斜率为1直线。直线所达限值即为该方法患者直线。直线所达限值即为该方法患者结果可汇报范围。结果可汇报范围。免疫增殖性疾病的免疫学检验第23页试剂与器材试剂与器材v选取与检测仪器相配套试剂、校准品及其它辅选取与检测仪器相配套试剂、校准品及其它辅助试剂助试剂v参考选取检测系统中血清参考选取检测系统中血清IgG检测范围选择低检测范围选择低浓度标本和高浓度标本浓度标本和高浓度标本免疫增殖性疾病的免疫学检验第24页操作步骤操作步骤v按标本操作规程做好项目校准、常规质控，确保检测系统按标本操作规程做好项目校准、常规质控，确保检测系统处于良好状态。处于良好状态。v试验标本配制，将血清试验标本配制，将血清IgG高（高（H）和低（）和低（L）样品按：）样品按：5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H关系各自配关系各自配制混合，形成系列评价试验样品。并计算各样品预期值。制混合，形成系列评价试验样品。并计算各样品预期值。v将系列评价试验样品上机检测，每标本重复检测将系列评价试验样品上机检测，每标本重复检测24次，次，结果统计于下表。结果统计于下表。v依照稀释关系，计算各试验样品预期值。按试验要求，每依照稀释关系，计算各试验样品预期值。按试验要求，每个样品做个样品做6次重复测定，得次重复测定，得6个实测值，它们和预期值形成个实测值，它们和预期值形成6对数据。对数据。免疫增殖性疾病的免疫学检验第25页结果分析结果分析免疫增殖性疾病的免疫学检验第26页v观察结果有没有显著数据差异，若有显著差异时，应判断观察结果有没有显著数据差异，若有显著差异时，应判断是否为离群点。是否为离群点。v在坐标纸上，以在坐标纸上，以X表示各样品预期值，以表示各样品预期值，以Y表示各样品实测表示各样品实测值，将试验结果点在图上。值，将试验结果点在图上。v若全部试验点在坐标纸上呈显著直线趋势，用直线回归对若全部试验点在坐标纸上呈显著直线趋势，用直线回归对数据进行统计，得直线回归方程数据进行统计，得直线回归方程Y=bX+a，若，若b在在0.971.03范围内，范围内，a靠近于靠近于0，则可直接判断测定方法可汇报范，则可直接判断测定方法可汇报范围在试验已包括浓度。围在试验已包括浓度。v若若b不在不在0.971.03范围内，范围内，a较大，试着舍去某组数据，另较大，试着舍去某组数据，另作回归统计。若缩小分析范围后，回归式有显著改进，若作回归统计。若缩小分析范围后，回归式有显著改进，若b靠近于靠近于1，a趋于趋于0。此时，缩小分析范围可作为真实可汇报。此时，缩小分析范围可作为真实可汇报范围。范围。免疫增殖性疾病的免疫学检验第27页注意事项注意事项v进行可汇报范围试验评价样品必须与真实标本尽可能相进行可汇报范围试验评价样品必须与真实标本尽可能相同，也要与真实标本含有相同基质状态。同，也要与真实标本含有相同基质状态。v评价样品要评价样品要5个或以上系列浓度试验样品，浓度范围遍布个或以上系列浓度试验样品，浓度范围遍布整个预期可汇报范围。最高浓度样品应到达可汇报范围整个预期可汇报范围。最高浓度样品应到达可汇报范围上限。上限。v若收不到低值样品，可搜集高值样品，经系列不一样程若收不到低值样品，可搜集高值样品，经系列不一样程度稀释，形成系列评价样品。度稀释，形成系列评价样品。v一天内做完本试验，普通每个试验样品做一天内做完本试验，普通每个试验样品做24次重复测次重复测定。综合全部结果作统计学处理。定。综合全部结果作统计学处理。免疫增殖性疾病的免疫学检验第28页v应仔细阅读试剂说明书，一些检测项目不宜用稀释方法获应仔细阅读试剂说明书，一些检测项目不宜用稀释方法获取系列浓度临床新鲜血清标本，可采取商品质控物、校准取系列浓度临床新鲜血清标本，可采取商品质控物、校准品等。品等。v 临床可汇报范围评价要对分析标本进行最大稀释度评价试临床可汇报范围评价要对分析标本进行最大稀释度评价试验，以此作为临床可汇报范围上限；假如低限有临床意义验，以此作为临床可汇报范围上限；假如低限有临床意义时，可增加分析标本反应量来进行检测下限评价试验，并时，可增加分析标本反应量来进行检测下限评价试验，并以此作为临床可汇报范围下限。以此作为临床可汇报范围下限。免疫增殖性疾病的免疫学检验第29页临床应用临床应用v可汇报范围评价是评价在此范围内不一样患者标本汇报可汇报范围评价是评价在此范围内不一样患者标本汇报结果间比值与各标本内含有分析物确实存在这么百分比结果间比值与各标本内含有分析物确实存在这么百分比关系。关系。免疫增殖性疾病的免疫学检验第30页思索题思索题v若血清若血清IgG低值为低值为0.5 g/L（L）、高值为）、高值为40.0 g/L（H），），请计算按：请计算按：5L、4L+1H、3L+2H、1L+4H、5H关系配制关系配制系列试验样品理论浓度分别为多少？系列试验样品理论浓度分别为多少？温州医学院温州医学院 陶志华陶志华免疫增殖性疾病的免疫学检验第31页病案讨论病案讨论 免疫增殖性疾病免疫增殖性疾病免疫增殖性疾病的免疫学检验第32页v某患者，男，某患者，男，48岁。主述岁。主述“乏力，脸色苍白，骨骼疼痛、乏力，脸色苍白，骨骼疼痛、背痛背痛”六个月，体检发觉：皮肤黏膜苍白，不足骨骼压痛，六个月，体检发觉：皮肤黏膜苍白，不足骨骼压痛，伴肝脾肿大。辅助检验发觉：（伴肝脾肿大。辅助检验发觉：（1）血象：）血象：Hb 8.2 g/dl，WBC血小板血小板 红细胞、白细胞和血小板镜检形态学正常，红细胞、白细胞和血小板镜检形态学正常，分类可见幼粒、幼红细胞，红细胞呈缗钱状排列；（分类可见幼粒、幼红细胞，红细胞呈缗钱状排列；（2）骨髓象：增生活跃，浆细胞占骨髓象：增生活跃，浆细胞占20，并发觉形态异常骨髓，并发觉形态异常骨髓瘤细胞。其余各系细胞大致正常；（瘤细胞。其余各系细胞大致正常；（3）骨）骨X线片、线片、CT或或同位素扫描：可发觉多部位穿凿样溶骨性病变或广泛性骨同位素扫描：可发觉多部位穿凿样溶骨性病变或广泛性骨质疏松。质疏松。免疫增殖性疾病的免疫学检验第33页问问 题题v依据以上初步检验结果，该患者初步诊疗为何疾病？依据以上初步检验结果，该患者初步诊疗为何疾病？v依据你理论知识，该患者还需做哪些免疫学检验项目？依据你理论知识，该患者还需做哪些免疫学检验项目？可能结果怎样？可能结果怎样？v与哪些疾病需进行判别诊疗？与哪些疾病需进行判别诊疗？温州医学院温州医学院 陶志华陶志华免疫增殖性疾病的免疫学检验第34页