超敏反应性疾病的免疫学检验.ppt

超敏反应性疾病的免疫学检超敏反应性疾病的免疫学检验验张思英张思英 病原学教研室病原学教研室 超敏反应：超敏反应：已经致敏的机体再已经致敏的机体再次接受相同抗原刺激后，所引起的次接受相同抗原刺激后，所引起的以生理功能紊乱或组织损伤为主的以生理功能紊乱或组织损伤为主的异常的适应性免疫应答。异常的适应性免疫应答。第一节第一节 激发试验激发试验激发试验（激发试验（provocation testprovocation test）是模拟自然发病条件，用少量超敏原是模拟自然发病条件，用少量超敏原引起一次较轻的超敏反应发作，达到引起一次较轻的超敏反应发作，达到确定超敏原的一种体内试验。确定超敏原的一种体内试验。l 非特异性激发：非特异性激发：是用组胺等刺激物是用组胺等刺激物做雾化吸入，做雾化吸入，以观察患者对以观察患者对型超敏反应的敏型超敏反应的敏感性，进而分感性，进而分 析病因或判定疗效。析病因或判定疗效。l 特异性激发：特异性激发：是用抗原如尘螨等做是用抗原如尘螨等做试验，对明确试验，对明确 超敏原有一定价值。超敏原有一定价值。用于用于型和型和型型超敏反应性疾病超敏反应性疾病的检查。的检查。0.010.03ml/针相同超敏相同超敏原不同稀原不同稀释释度度速速发发型型151530min30min内内观观察察迟发迟发型型 484872h72h内内观观察察4mm/4mm/针针方法方法结果结果一、皮肤试验一、皮肤试验-皮内试皮内试验验速发型皮肤试验的结果判定标准速发型皮肤试验的结果判定标准分级 皮 内 试 验 点 刺 试 验-无风团或小于阴性对无风团或小于阴性对照照无风团反应或小于阴性对无风团反应或小于阴性对照照+风团风团3 35mm5mm、红晕、红晕20mm20mm无风团无风团,阴性对照红晕阴性对照红晕20mm20mm+风团风团6 69mm9mm伴红晕伴红晕无风团，红晕无风团，红晕20mm20mm+风团风团101015mm15mm伴红晕伴红晕风团伴红晕风团伴红晕+风团风团15mm15mm伴红晕和伴红晕和伪足伪足风团伴红晕和伪足风团伴红晕和伪足迟发型皮试结果判定标准迟发型皮试结果判定标准反应程度 结果判定 -无反应或小于阴性无反应或小于阴性对照对照 +仅有红肿仅有红肿 +红肿伴硬结红肿伴硬结 +红肿、硬结、小疱红肿、硬结、小疱 +大疱或大疱或/和溃疡和溃疡l 比皮内试验敏感性稍低，但假阳性比皮内试验敏感性稍低，但假阳性较少；较少；l 皮试液浓度要比皮内试验高皮试液浓度要比皮内试验高1010100100倍。倍。将试验抗原与对照将试验抗原与对照液分别滴于试验部液分别滴于试验部位的皮肤上位的皮肤上用针尖透过液滴轻挑用针尖透过液滴轻挑一下一下以刺破皮肤而不出血以刺破皮肤而不出血为度为度1min1min后拭（吸）去试验后拭（吸）去试验抗原液抗原液一、皮肤试验一、皮肤试验-点刺试点刺试验验速发型皮肤试验的结果判定标准速发型皮肤试验的结果判定标准分级 皮 内 试 验 点 刺 试 验-无风团或小于阴性对无风团或小于阴性对照照无风团反应或小于阴性对无风团反应或小于阴性对照照+风团风团3 35mm5mm、红晕、红晕20mm20mm无风团无风团,阴性对照红晕阴性对照红晕20mm20mm+风团风团6 69mm9mm伴红晕伴红晕无风团，红晕无风团，红晕20mm20mm+风团风团101015mm15mm伴红晕伴红晕风团伴红晕风团伴红晕+风团风团15mm15mm伴红晕和伴红晕和伪足伪足风团伴红晕和伪足风团伴红晕和伪足皮内试验较点刺试验有更好的敏感性皮内试验较点刺试验有更好的敏感性l第一次读：第一次读：4848小时打开斑试器小时打开斑试器,间隔间隔30min30min待斑试器待斑试器 压痕消失后判定结果。压痕消失后判定结果。l第二次读：第第二次读：第3 3天或第天或第4 4天。天。l如怀疑光过敏，在斑贴试验的基础上给如怀疑光过敏，在斑贴试验的基础上给予紫外线照予紫外线照 射，操作过程相似。射，操作过程相似。一、皮肤试验一、皮肤试验-斑贴试斑贴试验验迟发型皮试结果判定标准迟发型皮试结果判定标准反应程度 结果判定 -无反应或小于阴性无反应或小于阴性对照对照 +仅有红肿仅有红肿 +红肿伴硬结红肿伴硬结 +红肿、硬结、小疱红肿、硬结、小疱 +大疱或大疱或/和溃疡和溃疡假阴性出现的常见原因：皮试液的浓度过低或失效；老年患者或过敏性休克或哮喘大发作之后；皮试前用过抗组胺药或免疫抑制剂；操作不当将皮试液注入皮下或注入量过少等。结果分析及注意事项结果分析及注意事项 结果分析及注意事项结果分析及注意事项 假阳性出现的常见原因：皮试液含有非特异性刺激物；患者患有皮肤划痕征；操作手法较重；注入量较大或浓度过高；注入少量空气等。l询问病史阳性对照l必备抢救药品和设施如何避免假性结果的出如何避免假性结果的出现：现：适应证阴性对照皮试液浓度皮肤试验的应皮肤试验的应用用l预防药物或疫苗等过敏 l防治型超敏反应性疾病l结核菌素试验l评估机体细胞免疫功能 l预防皮肤接触过敏 结核菌素试验 是用结核菌素进行皮肤试验，通过观察局部是否出现迟发型超敏反应，判断机体有无结核分枝杆菌感染和对该菌的免疫力。l阳性：机体已感染过结核杆菌或BCG接种成功；l强阳性：可能有活动性结核病；l阴性：机体未感染过结核分枝杆菌，但应考虑：感染初期；老年人；重度结核病患者，机体处于免疫反应低下状态；患有其他疾病。结核菌素试验 手捏式雾化器二、支气管激发试验二、支气管激发试验（bronchial bronchial provocative test,BPTprovocative test,BPT）雾化抗原颗粒5微米测定肺功能指标：用力肺活量(FVC)1秒用力呼气容积(FEV1)最大呼气流速(PEF)比气道传导率(sGaw)射流雾化器二、支气管激发试验二、支气管激发试验（bronchial bronchial provocative test,BPTprovocative test,BPT）测基础肺测基础肺功能功能 激发物稀释液：激发物稀释液：低浓度低浓度/小剂量小剂量双倍浓度双倍浓度/剂量递增剂量递增阳性伴明显气促、阳性伴明显气促、喘息喘息口吸口吸入入1 11 1分分半钟半钟测定肺功测定肺功能能阳性标阳性标准准/明显不明显不适适/临床症临床症状状直直至至激发物达到最激发物达到最高浓度高浓度阴性反阴性反应应支气支气管管舒张舒张剂剂吸吸入入二、支气管激发试验二、支气管激发试验（bronchial bronchial provocative test,BPTprovocative test,BPT）支气管反应有三种类型：速发、迟发和双重反应。支气管反应有三种类型：速发、迟发和双重反应。每次观察不能小于每次观察不能小于2424小时。小时。lFEV1FEV1：重复性好，结果稳定；重复性好，结果稳定；lPEFPEF：峰流速仪价格低廉、方便、不受场地限峰流速仪价格低廉、方便、不受场地限制，制，与与FEV1FEV1有较好的相关性，适合流行病学有较好的相关性，适合流行病学调查；调查；lsGawsGaw：敏感性好，但重复性稍差。敏感性好，但重复性稍差。测定指标测定指标二、支气管激发试验二、支气管激发试验（bronchial bronchial provocative test,BPTprovocative test,BPT）结果判断：结果判断：变应原的确定常以定性试验判断结果。变应原的确定常以定性试验判断结果。阳性：阳性：气道反应性增高气道反应性增高 FEV1FEV1、PEFPEF较基础下降较基础下降2020或或sGawsGaw下降下降35%35%，有时伴有明显自觉症状或肺部闻及哮鸣音。有时伴有明显自觉症状或肺部闻及哮鸣音。定性判断定性判断二、支气管激发试验二、支气管激发试验（bronchial bronchial provocative test,BPTprovocative test,BPT）结果判断：结果判断：阴性：阴性：气道反应性正常气道反应性正常 FEV1FEV1、PEFPEF或或sGawsGaw上述标准，正常值为阴性。上述标准，正常值为阴性。无论激发试验阳性或阴性，均应排除气道反应无论激发试验阳性或阴性，均应排除气道反应性的影响因素。可疑者，间隔性的影响因素。可疑者，间隔2 23 3周后复检或周后复检或2 2个月后再测。个月后再测。l受试者在心肺功能不全、高血压、甲亢、妊受试者在心肺功能不全、高血压、甲亢、妊娠、严重咽喉炎、呼吸道感染或肺炎等情况娠、严重咽喉炎、呼吸道感染或肺炎等情况下一般不适宜作激发试验；下一般不适宜作激发试验；l有过敏性休克，严重的血管性水肿及严重的有过敏性休克，严重的血管性水肿及严重的喉头水肿病史者；喉头水肿病史者；l一周之内预防接种、职业性过敏因素的接触一周之内预防接种、职业性过敏因素的接触等。等。禁忌证禁忌证二、支气管激发试验二、支气管激发试验（bronchial bronchial provocative test,BPTprovocative test,BPT）注意事项及禁忌症：注意事项及禁忌症：受试者在检查前：受试者在检查前：4848小时：停小时：停！抗组胺药、色甘酸钠及皮质激素抗组胺药、色甘酸钠及皮质激素类药类药;1212小时：停小时：停！支气管扩张剂支气管扩张剂;1515分钟：实验室休息分钟：实验室休息,病史、体检排除病史、体检排除BPTBPT的禁的禁忌证。忌证。注意事项注意事项二、支气管激发试验二、支气管激发试验（bronchial bronchial provocative test,BPTprovocative test,BPT）注意事项及禁忌症：注意事项及禁忌症：有一定的危险性，但较皮肤试验的有一定的危险性，但较皮肤试验的特异性高特异性高与受试者的病史、症状和体征相关与受试者的病史、症状和体征相关性较强性较强确定支气管哮喘的过敏原，尤其皮试确定支气管哮喘的过敏原，尤其皮试结果不肯定时结果不肯定时排除皮试时的假阳性反应和假阴性排除皮试时的假阳性反应和假阴性反应反应检测新制剂的抗原性、平喘药疗效及检测新制剂的抗原性、平喘药疗效及观察脱敏效果观察脱敏效果缺点是每次仅能用一种抗原，要专门缺点是每次仅能用一种抗原，要专门设备和技术，并需对病人进行训练并设备和技术，并需对病人进行训练并与之配合与之配合二、支气管激发试验二、支气管激发试验（bronchial bronchial provocative test,BPTprovocative test,BPT）应用与评价：应用与评价：观察症状观察症状症状好症状好转转或减轻或减轻导致导致基础基础饮食饮食吃吃 可可 疑疑的的过过 敏敏 食食物物症状症状加重加重1 1周后周后疑疑似似过过敏敏原原，重重复复3 3次次确定确定某某食食物物为为过过敏敏原原症状未减轻症状未减轻1 1周后周后排除排除 食食物物所所致致过过敏敏三、食物激发试验三、食物激发试验口腔激发试验口腔激发试验将超敏原直接与口腔黏膜接将超敏原直接与口腔黏膜接触，当口腔黏膜出现肿胀和触，当口腔黏膜出现肿胀和充血时，可判断为阳性反应。充血时，可判断为阳性反应。结膜激发试验结膜激发试验将超敏原滴于一眼，阳性反将超敏原滴于一眼，阳性反应为结膜充血、水肿、分泌应为结膜充血、水肿、分泌增加、搔痒，甚至眼睑红肿。增加、搔痒，甚至眼睑红肿。注意假阳性对结果的干扰。注意假阳性对结果的干扰。鼻黏膜激发试验鼻黏膜激发试验将抗原吸入将抗原吸入/滴入受试者鼻腔，滴入受试者鼻腔，出现鼻黏膜水肿、苍白、鼻出现鼻黏膜水肿、苍白、鼻痒、流涕、喷嚏为阳性。痒、流涕、喷嚏为阳性。四、其他方法四、其他方法第二节第二节 IgE的检测的检测一、血清总一、血清总IgEIgE的检测的检测 ELISA双抗体夹心法：操作简便，敏感性很高，是测定血清IgE最常用的方法。CLIA：敏感度更高，特异性高，定量。临床意义临床意义：正常人群血清：正常人群血清IgEIgE水平受地域水平受地域环境、种环境、种 族、遗传、年龄、性别、寄生虫感染、族、遗传、年龄、性别、寄生虫感染、测定法及取测定法及取 样等影响，结果有一定差异。样等影响，结果有一定差异。参考参考值值0.10.10.9mg/L0.9mg/L某些过敏体质者高于正常某些过敏体质者高于正常100010001000010000倍倍 血清血清IgEIgE高高特应症、支气管肺曲特应症、支气管肺曲菌病、菌病、药物性间质性肺炎、药物性间质性肺炎、麻风、麻风、寄生虫病及寄生虫病及IgEIgE型骨型骨髓瘤等髓瘤等一、血清总一、血清总IgEIgE的检测的检测 酶联免疫吸附试验（ELISA）：常用间接法。免疫印迹技术（IBT）：操作简单，能一次性测定多种变应原的特异性IgE，故临床已普遍采用IBT法。二、特异性二、特异性IgEIgE的检测的检测（+）E EE EE EE EE EE E洗洗涤涤洗洗涤涤洗洗涤涤结结果果ELISAELISA间接法检测特异间接法检测特异性性IgEIgE特异性变应原加入待特异性变应原加入待检血清检血清转印至转印至NC膜膜NC膜膜待检血清待检血清特异性特异性IgE抗抗-IgEHRP底物底物特异性抗原特异性抗原条带显色条带显色NC膜膜变应原变应原特异性特异性IgE抗抗-IgEHRPIBT检测特异性IgE目前公认的检测I型超敏反应方法之一；具有特异性强、敏感性高；影响因素少、对患者绝对安全等优点；过敏性哮喘诊断；寻找变应原。缺点：费用昂贵、花费时间长、不同试剂盒的参比血清不同不易相互比较。二、特异性二、特异性IgEIgE的检测的检测第三节第三节 免疫复合物免疫复合物检测检测CIC：分子量600kDa以上，沉降系数19S；热聚合人IgG(heat agglutination human IgG,HAHG)：作为参考标准品，绘制标准曲线进行CIC定量或测定A值代表CIC相当于HAHG的含量。一、抗原非特异性一、抗原非特异性CICCIC检测技术检测技术一、抗原非特异性一、抗原非特异性CICCIC检测技术检测技术CIC的检测方法：按抗体分子在结合抗原后发生的物理学和生物学特性的改变而设计。PEG比浊法;ELISA法;细胞法Raji细胞法;抗球蛋白技术mRF凝胶扩散试验。一、抗原非特异性一、抗原非特异性CICCIC检测技术检测技术PEG比浊法：1.基本原理 聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）为不带电荷、直链大分子结构的多糖，有强脱水作用，利用2%4%浓度的PEG可选择性沉淀大分子CIC。2.技术要点 生物化学检验。3.注意事项：2%PEG沉淀大分子CIC；4%PEG沉淀较小分子CIC；超过5%PEG选择性沉淀CIC的特性消失；温度影响极大，需进行温差校正；低密度脂蛋白使浊度增加，空腹采血；高球蛋白血症和标本反复冻融浊度增加。一、抗原非特异性一、抗原非特异性CICCIC检测技术检测技术PEG比浊法：一、抗原非特异性一、抗原非特异性CICCIC检测技术检测技术ELISA法：1.基本原理 ELISA法测定的CIC，是能够结合C1q的 IgG类抗体与其特异性抗原形成的CIC。2.技术要点 将聚苯乙烯包被上C1q，加入受检血清，CIC中IgG的Fc段与C1q结合，再加抗人IgGHRP，形成C1q-CIC-抗人IgGHRP复合物，加底物显色。一、抗原非特异性一、抗原非特异性CICCIC检测技术检测技术 灵敏度高于PEG比浊法，检测到0.1mg/L，重复性好等优点；C1q制品不易精制,纯品不稳定，只能检出与补体结合的CIC。ELISA法：一、抗原非特异性一、抗原非特异性CICCIC检测技术检测技术细胞法-Raji细胞法：1.基本原理 Raji细胞是从Burkitt淋巴瘤分离建株似B细胞系，在体外繁殖传代，细胞表面有高密度的C1q、C3b、C3d等补体受体，而且不易脱落。2.技术要点 将一定量待检血清、HAHG和Raji细胞混合，使补体、CIC或HAHG与Raji细胞形成复合物，加入抗人IgGFIC，形成Raji细胞补体CIC(或 HAHG)抗人IgG FIC复合物，检测荧光强度。一、抗原非特异性一、抗原非特异性CICCIC检测技术检测技术细胞法-Raji细胞法：3.影响因素 培养条件能改变Raji细胞其表面受体的数量及亲和性，影响检测敏感性;待检血清中如有抗淋巴细胞的抗体，能和Raji细胞反应;SLE血清中的抗DNA也能和Raji细胞反应，使测定结果偏高。一、抗原非特异性一、抗原非特异性CICCIC检测技术检测技术细胞法-Raji细胞法：4.方法评价 敏感性高(6mg/L HAHG)，实用性强；缺点需培养Raji细胞和同位素标记抗人IgG，操作繁琐;Raii细胞培养较困难，不易长期稳定保持其特性，培养条件受限。一、抗原非特异性一、抗原非特异性CICCIC检测技术检测技术细胞法-Raji细胞法：1.方法评价IgG或IgM类自身抗体与IC中IgG的Fc段结合而不与游离IgG结合的特性，mRF与CIC亲和力较强。一、抗原非特异性一、抗原非特异性CICCIC检测技术检测技术抗球蛋白技术-mRF凝胶扩散试验：1.方法评价IgG或IgM类自身抗体与IC中IgG的Fc段结合而不与游离IgG结合的特性，mRF与CIC亲和力较强。一、抗原非特异性一、抗原非特异性CICCIC检测技术检测技术抗球蛋白技术-mRF凝胶扩散试验：2.技术要点将mRF和待检血清中的CIC在琼脂凝胶中扩散，mRFCIC结合形成沉淀现象，进行CIC定性或定量。一、抗原非特异性一、抗原非特异性CICCIC检测技术检测技术抗球蛋白技术-mRF凝胶扩散试验：3.方法评价敏感度较低100mg/L（HAHG），mRF来源受限，操作费时，难于常规应用。一、抗原非特异性一、抗原非特异性CICCIC检测技术检测技术抗球蛋白技术-mRF凝胶扩散试验：CIC检测方法的基本原理及敏感性比较检测方法的基本原理及敏感性比较方法方法原理原理 敏感性敏感性(mg/L HAHG)PEG比浊法比浊法溶解度溶解度2020超速离心超速离心分子大分子大小小-分子超滤分子超滤分子大分子大小小-凝胶过滤凝胶过滤分子大分子大小小3030ELISA法法结合结合C1q0.10.1C1q液相法液相法结合结合C1q1010C1q偏离试验偏离试验结合结合C1q1 15 5抗补体实验抗补体实验固定补固定补体体0.10.1mRF凝胶扩散凝胶扩散法法结合结合RF100100mRF固相抑制固相抑制法法结合结合RF1 12020抗抗体法抗抗体法结合结合Ig2 23 3Raji细胞法细胞法补体受补体受体体6 6花环抑制试验花环抑制试验补体受补体受体体1010自身免疫性疾病病程中连续动态观察或辅助诊断：试验方法本身不完善；IC形成的复杂性，如在生理状态下IC是由各种抗原 与相应抗体所构成的，维持动态平衡。在病理状态 下往往是单一种类IC增高，而此种单一成分增高发 展到足以影响IC总体水平情况下，才能被试验检出。二、二、CICCIC检测方法评价及应用检测方法评价及应用检测方法评价：肾脏疾病：急性肾小球肾炎、移植肾、IgA肾病；消化系统疾病：慢活肝炎、原发性胆淤性肝硬化；皮肤病：荨麻疹、天疱疮、皮疹性皮炎；型超敏反应性疾病：SLE、RA、硬皮症、自身 免疫性溶血性贫血等。此外，CIC的检测对于肿瘤、肝癌、白血病、霍奇金病、神经肌肉萎缩性侧索硬化症等疾病的诊断。二、二、CICCIC检测方法评价及应用检测方法评价及应用临床应用：固定或沉积于病变局部组织中的IC测定常用免疫组化技术免疫组化技术，如荧光免疫组化技术检测到组织标本有Ig和补体。受累组织的成分、构型和特定的部位可为疾病的严重程度和预后提供依据。三、沉积于组织中三、沉积于组织中IC IC 的测定的测定第四节第四节 抗球蛋白抗球蛋白试验试验（Coombs试验试验）类型类型l不完全抗体：抗体分子较短小，只能与颗粒抗原一方相结合，不出现可见的凝集现象，但能封闭抗原决定簇，使其不能再与完全抗体结合。l抗人球蛋白试验（antiglobulin test,AGT）：将人球蛋白注入异种动物，诱导动物产生抗人球蛋白血清抗人球蛋白血清（antiglobulin serum，AGS)，AGS加入表面结合有不完全抗体的红细胞复合物中，就能出现可见的凝集现象。作用：作用：检测红细胞检测红细胞表面结合的不完全表面结合的不完全抗体。抗体。临床意义：临床意义：新生儿新生儿溶血症和自身免疫溶血症和自身免疫性溶血性贫血的诊性溶血性贫血的诊断。断。RBCRBC为为RhRh+7S7S的的IgGIgG体内发体内发生生+抗抗IgGIgG体外测试体外测试抽抽血血一、直接抗球蛋白试验一、直接抗球蛋白试验二、间接抗球蛋白试验二、间接抗球蛋白试验检测游离在检测游离在血清中的不血清中的不完全抗体或完全抗体或红细胞表面红细胞表面的抗原的抗原RBCRBC为为Rh+Rh+不完全抗体不完全抗体试剂试剂+抗抗IgGIgG体外测试体外测试间接间接Coombs试验各反应物加入量试验各反应物加入量反应物反应物受检受检管管阳性对阳性对照照阴性对阴性对照照血清（受检或已知）血清（受检或已知）2 2滴滴5%5%红细胞悬液红细胞悬液(已知已知或受检或受检)1 1滴滴不完全抗不完全抗D血清血清2 2滴滴AB型血清型血清2 2滴滴5%5%Rh阳性红细胞悬阳性红细胞悬液液1 1滴滴1 1滴滴二、间接抗球蛋白试验二、间接抗球蛋白试验 技术要点二、间接抗球蛋白试验二、间接抗球蛋白试验 结果判断 凝集为阳性，表明受检血清有不完全抗体或红细胞上有相应抗原；同时具备阳性对照管凝集阴性对照管不凝集，如有不完全抗体，可将血清以作倍比稀释进行效价测定。二、间接抗球蛋白试验二、间接抗球蛋白试验注意事项 在37水浴中，抗体吸附相应红细胞上的结合程度，与致敏的时间、离子强度有关；离心速度和时间十分重要，原则应以最小的离心力和最短的离心时间使阳性对照管出现反应为宜。二、间接抗球蛋白试验二、间接抗球蛋白试验方法评价是一种极为敏感的检查不完全抗体的方法，也是RhD检出的确证试验。操作繁杂，受试验条件影响较大。二、间接抗球蛋白试验二、间接抗球蛋白试验临床意义 血液病的检测；鉴定血型和检查血清中不完全抗体；有助于RhD的检出，多用于检测母体RhD抗体；输血前交叉配血试验及其他特殊研究；及早发现和避免新生儿溶血症的发生；红细胞不相容的输血所产生的血型抗体进行检测。超敏反应性疾病通过体内和体外实验，可进行变应原的相关检测，包括激发试验（根据刺激物不同分为非特异性和特异性激发试验，按检测部位又分为皮肤试验、支气管激发试验、食物激发试验等）；IgE检测（总IgE和特异性IgE检测）；免疫复合物检测主要针对抗原非特异性CIC；抗球蛋白试验（直接法和间接法）；药物过敏筛选实验（组胺含量测定和特异性抗体测定）。小结小结