固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定饲料中4种林可胺类药物.pdf

动物营养学报，（）：固相萃取超高效液相色谱串联质谱法同时测定饲料中 种林可胺类药物王凤芹 开丽霞 程远之 汪以真（浙江大学动物科学学院，教育部动物分子营养学重点实验室，农业农村部华东动物营养与饲料重点实验室，浙江省饲料与动物营养重点实验室，杭州）摘 要：本研究旨在建立一种同时准确测定饲料中 种林可胺类药物（林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素）的方法。饲料中林可胺类药物用甲醇 磷酸氢二钾（，体积比）缓冲溶液提取，提取液经混合型强阳离子交换固相萃取小柱净化，采用 色谱柱分离，流动相为 甲酸溶液和乙腈，梯度洗脱，以电喷雾离子源（）正离子扫描方式，在多反应监测（）模式下进行测定，外标法定量。结果表明：本研究建立的固相萃取超高效液相色谱串联质谱（）法对饲料中林可胺类药物检出限为 ，定量限为 ；种林可胺类药物在 浓度范围内，线性关系良好，相关系数（）均大于；在 个浓度水平（、和 ）下进行添加试验，林可胺类药物的回收率为，相对标准偏差（）为 。由此可见，本研究建立的 法灵敏、可靠，可应用于饲料中 种林可胺类药物的准确测定。关键词：固相萃取；超高效液相色谱串联质谱法；饲料；林可胺类药物中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：现代农业生猪产业体系（）作者简介：王凤芹（），女，湖北黄梅人，高级实验师，博士，主要从事动物营养与饲料分析方法建立研究。：通信作者：汪以真，教授，博士生导师，：林可胺类药物（）是一类抑菌性抗菌药物，主要包括林可霉素（）、克林霉素（）、克林霉 素 磷 酸 酯（）和吡利霉素（）。林可胺类药物曾广泛用于治疗畜禽的呼吸道疾病和肠道细菌感染，也用于饲料添加剂，用来促进畜禽生长，提高饲料转化率。然而，林可胺类药物等抗生素在饲料中的不合理及违法使用带来了抗生素在食物中残留、细菌耐药性以及环境污染等系列问题。我国农业农村部公告第 号规定，自 年 月 日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种，因此饲用抗生素检测技术的建立在政府部门对行业的监管方面尤为重要。与此同时，从源头掌握动物食品安全状况也越来越需要灵敏、快速和可靠的分析方法作为饲料和食品检验的保障。林可胺类药物结构上（图）由酰胺与糖配基组成，由于其没有特征的紫外吸收基团和荧光基团，因此不能采用常规的液相色谱法测定。我国现行国家标准饲料中林可霉素的测定（）规定了对浓缩饲料和配合饲料中林可霉素的测定，其中采用薄层色谱法对林可霉素进行定性，并采用微生物标准曲线法进行定量，这与文献报道的一些抗生素分析方法一致，即先筛选确认后，再进行定量分析。但该类方法前处理耗时且特异性和选择性差，还会导致假阳性结果。一些研究报道了基于液相色谱与质谱联用的方法测定饲料中的林可胺类药物，部分 期王凤芹等：固相萃取超高效液相色谱串联质谱法同时测定饲料中 种林可胺类药物研究也展示出灵敏度高、准确性和重复性好的结果。然而，饲料样品基质复杂，通常含有水、谷物、矿物质、维生素和脂肪等成分。一方面，有些目标物受基质影响不能得到有效提取；另一方面，提取液不加净化或净化不完全将会引起基质效应，从而影响定量结果。例如，等采用 乙酸甲醇溶液提取饲料中林可霉素等 种药物，提取液再经 填料的固相萃取小柱净化，最后用液质联用法进行定量分析，对林可霉素而言，提取效率约为，基质效应达到了。由此可见，选择合适的提取液，并采用固相萃取小柱对提取液进行有效的净化以降低基质效应，对于林可胺类物质的检测至关重要。另外，值得注意的是，所有上述研究只是检测饲料中的林可胺类药物中的 种或 种。例如，等采用液质联用法对 份家禽饲料中的林可霉素进行了定量分析；等采用液质联用法分析了饲料中吡利霉素的含量。迄今为止，还没有此类方法用于饲料中的林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素 种林可胺类药物同时检测的报道。针对目前饲料中林可胺类药物前处理技术的不足以及同时检测方法的缺乏，本研究拟采用磷酸盐缓冲溶液对饲料中的林可胺类药物进行提取，并用混合型强阳离子交换固相萃取小柱净化去除基质干扰，然后在液质联用仪上检测，同时定量分析饲料中 种林可胺类药物，旨在为饲料中林可胺类药物的检测提供快速、准确和灵敏的分析方法。：林可霉素；：克林霉素；：克林霉素磷酸酯 ；：吡利霉素。图 林可胺类药物化学结构 材料与方法 试验材料 试验试剂 盐酸林可霉素（纯度）、盐酸克林霉素（纯度）、克林霉素磷酸酯（纯度）和盐酸吡利霉素（纯度）购自北京百灵威科技有限公司。色谱级甲醇、乙腈和甲酸购自美国 公司。混合型强阳离子交换反相吸附固相萃取小柱（，；，；，）、亲水亲脂平衡反相吸附固相萃取小柱（，）、混合型弱阳离子交换反相吸附固相萃取小柱（，）购自美国 公司。强阳离子固相萃取小柱（，）购自美国 公司，强阳离子固相萃取小柱（，）购自美国 公司，混合型弱阳离子交换反相吸附固相萃取小柱（，）购自上海笛柏生物科技有限公司。分析纯三水磷酸氢二钾、氨水和盐酸均购自国药集团化学试剂有限公司。主要仪器 超高效液相色谱质谱联用仪（，美 国 公司），超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），超纯水仪（德国 公司），电子分析天平（瑞士 公司），离心机（美国 公司），氮吹仪（美国 公司）。超高效液相色谱 串联质谱（）分析条件 色谱条件 色谱柱：，粒 径 ；进 样 量：；流 速：；流动相 相：甲酸溶液；流动相 相：乙腈。色谱分离梯度洗脱条件见表。动 物 营 养 学 报 卷表 色谱分离梯度洗脱程序 时间 流动相 流动相 曲线类型 质谱条件 电离方式：电喷雾离子源（）正离子模式；检测方式：多级反应监测（）；毛细管电压：；离 子 源 温 度：；脱 溶 剂 气 温 度：；脱溶剂气流速：。雾化气、干燥气为高纯氮气，碰撞气为高纯氩气。喷雾电压、碰撞能量等参数优化至最佳灵敏度。监测离子对、锥孔电压和碰撞能量见表。表 质谱分析条件 林可胺类药物母离子 （）子离子 （）锥孔电压 碰撞能量 林可霉素克林霉素克林霉素磷酸酯 吡利霉素 为定量离子对。样品的前处理 提取 平行做 份试验。称取 （精确至 ）饲料于 离心管中，准确加入 甲醇磷酸盐缓冲溶液（甲醇 磷酸氢二钾，体积比）；称取 三水磷酸氢二钾，加入 水溶解，用盐酸溶液调节 至，用水稀释至 ，混匀，涡旋混匀，超声提取，于 离心 ，取上清液于另一支 离心管中。重复提取 次，合并上清液，混匀。准确移取 于 离心管中，加入 的 甲酸溶液，混匀，备用。净化 依次用 甲醇、水和 的 甲酸溶液活化 固相萃取小柱，将备用液全部上样，分别用 的甲酸溶液、水和 甲醇淋洗，抽干。用 氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于 氮气吹干，准确加入 的 甲醇，涡旋溶解，过 有机滤膜，待 检测。标准曲线的制作 标准储备溶液（）：分别称取盐酸林可霉素、盐酸克林霉素、克林霉素磷酸酯和盐酸吡利霉素各适量（精确至 ），用甲醇溶解并稀释定容，混匀，制成浓度均为 的标准储备溶液，于 以下保存，有效期 个月。混合标准中间溶液（）：准确移取标准储备溶液各 于 容量瓶中，用甲醇稀释并定容，混匀，于 保存，有效期 。混合标准系列溶液：准确移取混合标准中间溶液适量，用 甲醇配制成浓度分别为、和 的混合标准系列溶液。上 期王凤芹等：固相萃取超高效液相色谱串联质谱法同时测定饲料中 种林可胺类药物机测试，以浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制溶剂标准工作曲线。基质匹配标准工作曲线：称取空白饲料 （精确至 ），置于 离心管中，按照 样品前处理试验步骤进行处理。以获得的复溶液作为空白基质，稀释林可胺类药物混合标准中间溶液，得到、和 的基质匹配标准工作溶液，上机测试，以浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制基质匹配标准工作曲线。方法的准确度与精密度 分别移取、和 等 个浓度的林可胺类药物混合标准溶液，加入到空白饲料 样 品 中，得 到 最 终 计 算 浓 度 为 、和 的 个添加水平。每种饲料在每个浓度下设 个平行，方法的准确度以回收率来评价，精密度以相对标准偏差（）表示。数据处理与分析 数据处理采用 统计分析软件进行处理和计算，结果以平均值来表示。结果与分析 流动相的组成 本试验考察了甲醇水（图）、乙腈水（图）、甲醇甲酸（图）和乙腈甲酸（图）等不同的流动相体系经色谱柱对林可胺类药物的分离效果。结果表明，使用含有甲酸、乙腈和水的流动相体系可以获得最大的灵敏度和最佳的峰形。这可能归因于甲酸增加了林可胺类药物的电离，而乙腈会产生比甲醇更好的色谱峰。本研究采用 甲酸溶液（）和乙腈（）体系作为流动相。在优化的色谱条件下，林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素的保留时间分别为、和 ，分析时间为。：甲醇水；：乙腈水；：甲醇甲酸 ；：乙腈甲酸水 。图 林可胺类药物标准溶液（）在不同流动相中 色谱图 （）动 物 营 养 学 报 卷 质谱条件 如图 所示，林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素均具有叔胺或仲胺结构，具有弱碱性，其在质谱上有很强的正离子响应，故选择正离子模式扫描。本研究将 的 种林可胺类药物标准溶液分别注入到质谱仪中，在质谱扫描模式下获得各种药物的一级和二级质谱图，选择响应值高、干扰小且具有代表性的离子对作为定量离子和定性离子。选择林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素 种林可胺类药物丰 度 较 高 的 准 分 子 离 子 峰 质 荷 比（）、和 作为母离子，对母离子进行轰击碎裂，产生相应的子离子质谱图（图）。对 种药物质谱裂解途径解析如下：林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯产生子离子 ，对应于 丙基甲基吡咯烷碎片离子（图 至图）。吡利霉素产生子离子 ，对应于 乙基哌啶（图）。林可霉素的子离子 、克林霉素的子离子 、克林霉素磷酸酯的子离子 和吡利霉素的子离子 的产生是由于各自准分子离子峰中硫代甲醇分子的丢失，另外克林霉素磷酸酯产生子离子 ，对应于磷酸的丢失。上述离子对的选择与现有报道林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素离子对一致。：林可霉素；：克林霉素；：克林霉素磷酸酯 ；：吡利霉素。图 林可胺类药物质谱图 提取液的确定 本试验比较了 甲醇、甲醇和甲醇磷酸氢二钾缓冲溶液对林可胺类药物的提取效率。称取鸡配合饲料空白样品 份，每份试样 （精确到），置于 离心管中，均添加 浓度为 的 种林可胺类药物混合标准溶液，室温放置过夜。每 份试样分别加入 甲醇、甲醇以及甲醇磷酸氢二钾缓冲溶液，经 样品的前处理步骤进行提取与净化，后上机测定。由图 可知，除了甲醇对克林霉素磷酸酯的回收率为，其他无论采取 甲醇还是甲醇作为提取液，种林可胺类药物回收率在 ；而采用甲醇磷酸氢二钾缓冲溶液提取，种林可胺类药物回收率均在 ，由此可见甲醇磷酸氢二钾缓冲溶液对 种林可胺类药物的提取效率高于 甲醇和甲醇。净化条件的优化 平行做 份试验（个处理，个重复）。称取猪配合空白饲料 （精确到 ），置于 离心管中，均添加 浓度为 的 种林可胺类药物混合标准溶液，室温放置过 期王凤芹等：固相萃取超高效液相色谱串联质谱法同时测定饲料中 种林可胺类药物夜。加入 甲醇磷酸氢二钾缓冲溶液，经样品的前处理步骤进行提取与净化，上机测定。图 提取液对林可胺类药物回收率的影响（）（）由图 可知，经甲醇磷酸氢二钾缓冲溶液提取和 固相萃取小柱净化，林可霉素和克林霉素磷酸酯有较好的保留，而克林霉素和吡利霉素 种药物的回收率小于，尤其是吡利霉素回收率只有。此外，款混合型弱阳离子交换反相吸附性质的 和 固相萃取小柱对 种林可胺类药物基本没有保留。选择甲醇磷酸氢二钾缓冲溶液提取，经、和 款强阳离子型固相萃取小柱净化，种林可胺类药物的回收率均在 以上。因此，选用 固相萃取小柱对提取液进行净化。图 款不同固相萃取小柱对林可胺类药物回收率的影响（）（）在此基础上，采用、和 种不同规格的 固相萃取小柱对猪配合饲料提取液进行净化，以考察其净化效果及承载量。称取空白猪配合饲料 份，各 （精确到），置于 离心管中，其中一份添加 浓度为 的 种林可胺类药物，室温放置过夜。经甲醇磷酸氢二钾缓冲溶液提取，制得备用液。种不同规格 固相萃取小柱各 个依次用甲醇和水各 活化，备用液全部过柱。再按 样品的前处理步骤进行提取与净化，上机测定。由图 可知，应用 种不同规格 固相萃取小柱，克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素均动 物 营 养 学 报 卷能获得较好满意的回收率（）；但是对于最高添加浓度（）的林可霉素，应用 和 种规格的 固相萃取小柱净化，回收率小于；而应用 的 固相萃取小柱，种林可胺类药物均可以获得 的回收率。因此，选择 的 固相萃取小柱用于提取液的净化。图 不同规格 固相萃取小柱对林可胺类药物回收率的影响（）（）基质的影响 按照 所述，制备溶剂标准工作曲线和基质匹配标准工作曲线，标准工作曲线、相关系数（）和基质效应见于表，其中基质效应在 。由此可知，空白基质未对林可胺类药物产生明显的增强或抑制效应。因此，采用溶剂标准工作曲线对测定结果进行计算。线性关系和线性范围 种林可胺类药物在 浓度范围内，均大于，可见 种林可胺类药物均具有良好的线性关系，符合定量要求。检出限和定量限 向空白饲料中添加林可霉素、克林霉素、克林霉素 磷 酸 酯 和 吡 利 霉 素 使 之 添 加 浓 度 为 ，其信噪比（）均大于，并且经前处理后其浓度在线性范围内，该方法的检出限则根据 ，确定的检出限可达到 。所以，最终确定方法的检出限为 ，定量限为 ，满足分析方法的要求。方法的准确度和精密度 选用畜禽配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料分别进行加标回收率试验，每种饲料采用不同的添加浓度，每个添加浓度制备 个平行样品，当样品的上机浓度超过线性范围时，需要根据测定浓度，用 甲醇进行稀释后重新测定，直到上机液浓度在标准曲线的线性范围内，结 果 见 表。从 回 收 率 结 果 看 出，在 添加浓度范围内，回收率为，为 。由此可见回收率较好，精密度较高，说明本方法能满足饲料中林可胺类药物含量测定需要。实际样品（非添加样）的测定 为进一步验证方法的适用性和科学性，应用所建立的测定方法对养殖场的 余份饲料样品进行检测，包括配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和预混合饲料，结果发现所检样品中林可胺类药物均低于检测限。讨 论 提取液的选择 林可胺类药物在酸性条件下易发生水解，在中性或弱碱性溶液中相对稳定，且易溶于极性有机溶剂。因此，种林可胺类药物提取与净化条件的优化，主要依据其弱碱性、酸不稳定性和脂溶性。已见文献报道对林可胺类药物其中 种或 种药物的提取，采用 甲醇、甲醇、甲醇磷酸氢二钾缓冲溶液等。本研究比较了文献报道的 甲醇、甲醇和甲醇磷酸氢二钾缓冲溶液对饲料中的林可胺类药物进行提取，经 固相萃取小柱净化。采取 甲醇和甲醇作为提取液，至少 种林可胺类药物回收率在 ，而采用甲醇磷酸氢二钾缓冲溶液作为提取液，种林可胺类药物回收率均在。因此，本研究采用甲醇磷酸氢二钾缓冲溶液作为提取液。期王凤芹等：固相萃取超高效液相色谱串联质谱法同时测定饲料中 种林可胺类药物表 不同饲料基质中林可胺类药物的标准曲线与相关系数和基质效应 ，样品林可霉素标准曲线与相关系数 基质效应 克林霉素标准曲线与相关系数 基质效应 溶剂标准工作溶液 ，鸡配合饲料 ，鸡浓缩饲料 ，鸡预混合饲料 ，猪配合饲料 ，猪预混合饲料 ，奶牛精料补充料 ，样品名称克林霉素磷酸酯标准曲线与相关系数 基质效应 吡利霉素标准曲线与相关系数 基质效应 溶剂标准工作溶液 ，鸡配合饲料 ，鸡浓缩饲料 ，鸡预混合饲料 ，猪配合饲料 ，猪预混合饲料 ，奶牛精料补充料 ，动 物 营 养 学 报 卷表 饲料样品中的林可胺类药物回收率 （）林可胺类药物添加水平鸡配合饲料 回收率相对标准偏差鸡预混合饲料 回收率相对标准偏差鸡浓缩饲料 回收率相对标准偏差猪配合饲料 回收率相对标准偏差猪预混合饲料 回收率相对标准偏差奶牛精料补充料 回收率相对标准偏差林可霉素 克林霉素 克 林 霉 素 磷酸酯 吡利霉素 期王凤芹等：固相萃取超高效液相色谱串联质谱法同时测定饲料中 种林可胺类药物 固相萃取小柱的选择 如前所述，林可胺类药物呈现弱碱性，因此通常会选用阳离子型固相萃取小柱进行净化和富集，也有文献采用 或，固相萃取小柱对基质中林可霉素或克林霉素进行净化。本研究考察了 亲水亲脂平衡反相吸附固相萃取小柱、和 款混合型弱阳离子交换反相吸附固相萃取小柱以及、和 款强阳离子交换固相萃取小柱的净化效果。经甲醇磷酸氢二钾缓冲溶液提取和 固相萃取小柱净化，克林霉素的回收率小于，吡利霉素回收率只有，款混合型弱阳离子交换反相吸附性质的 和 固相萃取小柱对 种林可胺类药物基本没有保留，而采用、和 款强阳离子型固相萃取小柱净化，种林可胺类药物的回收率均在 以上。因此，选用其中的一款 固相萃取小柱对提取液进行净化。样品的基质效应 基质效应是指目标化合物在离子化时受到基质干扰物竞争引起分析信号变化从而导致增强或抑制的效应，基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线斜率的比值反映基质效应的强弱。采用公式基质效应（其中 和 分别为基质标准曲线斜率和溶剂标准曲线斜率）计算，当基质效应 时，表明产生基质增强效应；当基质效应 时，表明产生基质抑制效应；当基质效应为 时，说 明 基 质 效 应 不 明 显。等报道，分析林可霉素时出现了明显的基质抑制效应，为减少基质效应对其干扰，而采取基质匹配标准工作曲线对其定量分析。本研究中，基质效应在 ，因此，采用溶剂标准工作曲线对 种林可胺类药物进行定量分析。结 论 本研究采用甲醇磷酸氢二钾缓冲溶液提取饲料中的 种林可胺类药物，并经混合型强阳离子交换固相萃取小柱净化，成功建立了提取和净化程序，该前处理方法基质干扰影响较小。通过 分析，建立了外标法同时定量测定饲料中 种林可胺类药物的方法。该方法中 种林可胺类药物的检出限和定量限分别为 和 。在 个浓度水平（、和 ）下进行添加试验，林可胺类药 物 的 回 收 率 为 ，为，准确度和精密度高。综上所述，本试验建立的固相萃取（）法操作简单，准确度高，可应用于饲料中林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素 种林可胺类药物的同时检测。参考文献：，：，：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：（），：，（）：韩镌竹，杨文腰超高效液相色谱串联质谱法同时动 物 营 养 学 报 卷测定饲料中林可霉素和克林霉素残留现代畜牧兽医，（）：，（）：（）贾涛，王剑，王建国，等液相色谱串联质谱法测定奶牛用饲料中盐酸吡利霉素饲料研究，（）：，（）：（），：，（）：，（）：，：，：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会饲料中林可霉素的测定：北京：中国标准出版社，：，（），（）：，（）：，：，：，：？，（）：严丽娟，张峰，方恩华，等超高效液相色谱电喷雾串联质谱法测定动物饲料中的大环内酯类和林可胺类抗生素色谱，（）：，（）：（），：，（）：，（）：，（）：期王凤芹等：固相萃取超高效液相色谱串联质谱法同时测定饲料中 种林可胺类药物 ，（）：孙雷，张骊，王树槐，等超高效液相色谱串联质谱法对动物源食品中 种林可胺类及大环内酯类药物残留的检测 分析测试学报，（）：，（）：，（），（）：，：，（）：，：，：动 物 营 养 学 报 卷，：（责任编辑 田艳明）（，）：（，）（，），（）（）（）；，（）；（，），（），（）：；