楝酰胺对人肝癌细胞增殖、凋亡的影响.pdf

实验研究CHINESE COMMUNITY DOCTORS中国社区医师2024年第40卷第4期中国社区医师2024年第40卷第4期肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，具有易转移、易复发、致死率高等特点，目前，分子靶向药物和免疫抑制剂的研究成为肝癌治疗的热点1。楝酰胺是一种楝科米仔兰属植物代谢产物，属环戊烷苯丙呋喃化合物，具有抗肿瘤作用。有研究发现，楝酰胺可抑制肝癌细胞增殖，但内在机制尚未完全明确2。磷脂酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路是一种参与调控肿瘤细胞增殖、凋亡、分化等多项生理活动的重要信号通路3。本研究旨在分析楝酰胺是否通过PI3K/Akt信号通路对人肝癌细胞的增殖、凋亡产生影响，现报告如下。doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2024.04.004摘要目的：分析楝酰胺对人肝癌细胞增殖、凋亡的影响。方法：体外培养人肝癌细胞，分别采用0、50、100、200 nmol/L楝酰胺处理，对应为对照组及低、中、高楝酰胺组。测定各组细胞增殖水平、凋亡情况、差异蛋白及其表达水平。结果：干预24、48、72 h，各组细胞增殖率比较，对照组低楝酰胺组中楝酰胺组高楝酰胺组，差异有统计学意义(P0.05)。干预24、48、72 h，各组细胞凋亡率比较，对照组低楝酰胺组中楝酰胺组高楝酰胺组，差异有统计学意义(P0.05)。经质谱分析，整合素(ITGA)、层粘连蛋白1(LAM1)蛋白为差异蛋白。低、中、高楝酰胺组 LAM1、ITGA、磷脂酸肌醇-3-激酶/(PI3K)、蛋白激酶 B(Akt)蛋白表达量低于对照组，差异有统计学意义(P0.05)。结论：楝酰胺对人肝癌细胞增殖、凋亡具有一定的调控作用，可能通过抑制上游蛋白LAM1、ITGA蛋白靶向激活PI3K/Akt通路，下调PI3K/Akt信号发挥抗肿瘤作用。关键词楝酰胺；层粘连蛋白；整合素V；磷脂酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路；肝癌中图分类号R285文献标识码AEffect of Rocaglamide on Proliferation and Apoptosis of Human Hepatocellular Carcinoma CellsLi Ruihua1,Yue Aimin2,Gao Guowei3,Shen Yuhou2,Liu Fangyan1The Fourth Clinical College,Xinxiang Medical University1,Xinxiang 453000,Henan Province,ChinaDepartment of General Oncology,East Branch of Xinxiang Central Hospital2,Xinxiang 453000,Henan Province,ChinaDepartment of Radiology,Xinxiang Central Hospital3,Xinxiang 453000,Henan Province,ChinaAbstractObjective:To analyze the effect of rocaglamide on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinomacells.Methods:Human hepatocellular carcinoma cells were in vitro cultured and treated with 0,50,100,and 200 nmol/Lrocaglamide,as control group,low rocaglamide group,medium rocaglamide group,and high rocaglamide group,respectively.Thecell proliferation level,apoptosis,differential proteins and their expression level were determined in each group.Results:After 24 h,48 h and 72 h of intervention,the cell proliferation rate in each group was ranked as follows:control group low rocaglamidegroup medium rocaglamide group high rocaglamide group,with statistically significant differences(P0.05).After 24 h,48 hand 72 h of intervention,the apoptosis rate in each group was ranked as follows:control group low rocaglamide group mediumrocaglamide group high rocaglamide group,with statistically significant differences(P0.05).Mass spectrometry analysis showedthat,integrin V(ITGAV)and laminin 1(LAM1)protein were differential proteins.The protein expressions of LAM1,ITGAV,phosphatidylinositol-3-kinase(PI3K)and protein kinase B(Akt)in low rocaglamide group,medium rocaglamide group,and highrocaglamide group were lower than those in the control group,and the difference was statistically significant(P0.05).Conclusion:Rocaglamide may regulate the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells,and contribute to targetedactivation of PI3K/Akt pathway and down-regulation of PI3K/Akt signals through inhibiting the upstream proteins LAM1 andITGAV,resulting in an anti-tumor effect.Key wordsRocaglamide;Laminin;Integrin V;PI3K/Akt pathway;Hepatocellular carcinoma楝酰胺对人肝癌细胞增殖、凋亡的影响李瑞华1岳爱民2高国伟3沈裕厚2刘芳艳1453000新乡医学院第四临床学院1，河南 新乡453000新乡市中心医院东院普瘤科2，河南 新乡453000新乡市中心医院放疗科3，河南 新乡10实验研究CHINESE COMMUNITY DOCTORS中国社区医师2024年第40卷第4期中国社区医师2024年第40卷第4期*图3各组LAM1、ITGA蛋白表达比较图4各组细胞PI3K、Akt蛋白表达比较*Control-1Control-2Control-3RocA-100nM-1RocA-100nM-2RocA-100nM-3Control-1Control-2Control-3RocA-100nM-1RocA-100nM-2RocA-100nM-3图1LAM1质谱分析图图2ITGA质谱分析图表1楝酰胺对肝癌细胞增殖率的影响(xs，%)组别干预24 h干预48 h干预72 h高楝酰胺组0.170.05*#0.200.03*#0.220.03*#中楝酰胺组0.190.04*#0.260.03*#0.330.04*#低楝酰胺组0.240.03*0.320.05*0.400.05*对照组0.330.040.450.040.670.08F2.2643.2794.958P0.0160.0030.001注：与对照组比较，*P0.05；与低楝酰胺组比较，#P0.05；与中楝酰胺组比较，P0.05表2楝酰胺对肝癌细胞凋亡率的影响(xs，%)组别24 h48 h72 h高楝酰胺组12.201.37*#1 8.852.08*#25.773.20*#中楝酰胺组11.351.26*#16.832.12*#20.293.24*#低楝酰胺组8.520.73*10.551.74*14.731.82*对照组5.330.615.901.186.040.93F6.6759.18713.197P0.0010.0010.001注：与对照组比较，*P0.05；与低剂量组比较，#P0.05；与中剂量组比较，P0.05注：与对照组比较，*P0.05材料与方法实验细胞：人肝癌细胞株(生产厂家：赛百慷生物技术股份有限公司)。实验试剂：楝酰胺(生产厂家：美国Sigma公司)、全蛋白提取试剂盒(生产厂家：南京凯基生物科技发展有限公司)。实验仪器：流式细 胞 仪(生 产 厂 家：美 国 贝 克 曼 公 司；型 号：C00445)、培养箱(生产厂家：美国 Thermo 公司；型号：ZXMP-A1430)、凝胶成像系统(生产厂家：美国伯乐公司；型号：ChemiDoc MP)。方法：细胞培养：取对数生长期细胞人肝癌细胞株，加入不同浓度(50、100、200 nmol/L)楝酰胺溶液培养，分别作为低、中、高楝酰胺组；另选一组人肝癌细胞细胞株不做处理，作为对照组。检测细胞增殖水平：细胞培养24、48、72 h后，各组分别加入CCK8试剂避光孵育2 h，随后加入二甲基亚砜测定吸光度值。细胞增殖率(%)=(实验组吸光度值-空白对照组吸光度值)/(溶剂对照组吸光度值-空白对照组吸光度值)100%。操作重复3次，取平均值。检测细胞凋亡：各组加入胰酶液消化并收集细胞，提取1 mL离心，去除上清液，于100 L Annexin V buffer液重悬，避光状态下孵育15 min，取细胞沉淀，应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，细胞凋亡率=凋亡细胞数/全部细胞数100%。实验重复3次，取平均值。蛋白组学及质谱分析：提取样品中总蛋白，进行色谱分离，选出具有显著表达差异的蛋白。检测细胞蛋白表达水平：采用Western blot法检测显著表达差异蛋白水平。统计学方法：数据应用 SPSS 22.0 统计学软件分析；计量资料以xs表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK-q 检验；P0.05 为差异有统计学意义。结果楝酰胺对肝癌细胞增殖率的影响：干预24、48、72 h，各组细胞增殖率比较，对照组低楝酰胺组中楝酰胺组高楝酰胺组，差异有统计学意义(P0.05)。见表1。楝酰胺对肝癌细胞凋亡率的影响：干预24、48、72 h，各组细胞凋亡率比较，对照组低楝酰胺组中楝酰胺组高楝酰胺组，差异有统计学意义(P0.05)。见表2。蛋白质组学鉴定结果：经质谱分析，整合素(ITGA)、层粘连蛋白 1(LAM1)蛋白为差异蛋白。见图1、2。各组 LAM1、ITGA、PI3K、Akt蛋白表达比较：低、中、高楝酰胺组 LAM1、ITGA、PI3K、Akt蛋白表达量低于对照组，差异有统计学意义(P0.05)。见图3、4。注：与对照组比较，*P0.0511实验研究CHINESE COMMUNITY DOCTORS中国社区医师2024年第40卷第4期中国社区医师2024年第40卷第4期讨论肝癌是常见消化系统恶性肿瘤，归属于中医“肝积”“癥瘕”“黄疸”等范畴，宜采用活血化瘀、扶正祛邪的治法。楝酰胺是米仔兰分离的天然环戊烷并苯并呋喃类化合物，具有活血化瘀、消肿止痛、扶正功效4。现代药理研究显示，楝酰胺参与恶性肿瘤的发生及发展，可抑制癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡，减轻神经元组织的炎性反应，选择性调节癌细胞的能量代谢5-6。本研究结果表明，干预24、48、72 h，各组细胞增殖率比较，对照组低楝酰胺组中楝酰胺组高楝酰胺组；各组细胞凋亡率比较，对照组低楝酰胺组中楝酰胺组高楝酰胺组；低、中、高楝酰胺组LAM1、ITGA、PI3K、Akt 蛋白表达量低于对照组。说明楝酰胺对肝癌细胞增殖具有抑制作用，有利于促进肝癌细胞凋亡，可能与其能够抑制上游蛋白LAM1、ITGA蛋白靶向激活PI3K/Akt通路，下调PI3K/Akt信号有关。PI3K/Akt信号是人体肿瘤异常激活的经典途径，Akt被PI3K磷酸化激活后，通过调节下游蛋白参与促肝癌细胞增殖转移、抑制细胞凋亡7-9。LAM1属于细胞外基质糖蛋白家族，是基底膜的主要非胶原成分，涉及细胞黏附、分化、迁移、信号传导、神经元生长和转移等生理活动，包括肿瘤血管生成、侵袭及转移过程。有研究发现，LAM1在血清中的表达与恶性肿瘤患者临床分期、淋巴结转移有关，可能通过抗肿瘤免疫、增强细胞活性的方式促进肿瘤生长10-12。ITGA是一种细胞外基质的跨膜黏附受体，可直接作用于胞内结合蛋白，促进细胞骨架重组，从而影响细胞与基质的黏附作用，提高细胞浸润、迁移水平13-15。有研究显示，ITGA过表达与肿瘤细胞侵袭转移具有明显相关性16。LAM1、ITGA是PI3K/Akt通路的上游蛋白，推测楝酰胺可能通过下调ITGA、LAM1的表达抑制PI3K/Akt通路的激活，从而发挥抗肿瘤作用。但这仍需要进一步的实验验证。综上所述，楝酰胺对人肝癌细胞增殖、凋亡的具有一定的调控作用，可能通过抑制上游蛋白LAM1、ITGA蛋白靶向激活 PI3K/Akt通路，下调 PI3K/Akt信号发挥抗肿瘤作用。参考文献1谭文莉,李从文,魏云林.楝酰胺类化合物的抗肿瘤活性探究进展J.基因组学与应用生物学,2021,40(4):1896-1903.2王辉,杨蕾,孔令义.洛克米兰醇对肝癌HepG2细胞的抗增殖作用及其机制研究J.中草药,2020,51(16):4208-4216.3惠友谊,薛敬东,翟延.基于 PI3K/Akt 通路探索中医药治疗肝 癌 机 制 的 研 究 概 述 J.环 球 中 医 药,2022,15(6):1095-1099.4韩晶晶,陈梦莹,岑娟,等.椭圆叶米仔兰化学成分及其生物活性J.中成药,2022,1(44):97-102.5Ren Z,Xu J,Bai Y,et al.Sintilimab plus a bevacizumab biosimilar(IBI305)versus sorafenib in unresectable hepatocellularcarcinoma(ORIENT-32):A randomised,open-label,phase 2-3 studyJ.Lancet Oncol,2021,22(7):977-990.6辛晓丽,玄敏,刘苓霜,等.基于生物信息学楝酰胺 A 抑制Jurkat细胞增殖的机制J.中成药,2020,42(3):774-778.7陈毅翀,赵毅.敲减MAC30通过PI3K/AKT抑制人乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡J.现代肿瘤医学,2019,27(18):3167-3171.8徐聪聪,陈浩.PI3K/Akt/mTOR信号通路在皮肤鳞状细胞癌中的研究进展J.中华皮肤科杂志,2022,55(3):264-267.9张小三,张一鸣,赵燕,等.PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达与食管癌淋巴结转移的关系J.癌症进展,2019,17(4):460-463.10 Dai C,Zhou X,Wang L,et al.Rocaglamide prolonged allograftsurvival by inhibiting differentiation of Th1/Th17 cells in cardiac transplantationJ.Oxid Med Cell Longev,2022,17(20):2048-2055.11 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