革兰氏染色法12科五第六组.pptx

革兰氏染色法简介介基本步骤第一步：结晶紫使菌体着上紫色第二步：碘和结晶紫形成脂溶性大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。第四步：沙黄复染，增加脱色菌与背景的反差并区别于未脱色菌。革兰氏染色法是细菌学中最基本，最重要的鉴别染色技术。它是 1884 年由丹麦细菌学家Christain Gram建立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。2024/6/17 周一原理2024/6/17 周一G菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。影响因素一、培养菌的菌龄二、涂片的厚度三、媒染时间对结果的影响四、脱色时间对结果的影响五、干燥的温度六、固定的操作2024/6/17 周一影响因素影响因素革兰氏染色要求菌种被染色时处于对数增殖期，此时菌体的细胞壁的成分和结构最为典型,经革兰氏染液染色处理后,能典型正确地反映染色的结果，若菌体细胞未成熟或已老化,染色结果可能会出现完全相反的情况，造成假阳性或假阴性的产生。2024/6/17 周一二、涂片的厚度三、媒染时间四、脱色时间五、干燥的温度六、固定的操作一、培养菌的菌龄影响因素影响因素涂片时，先在载玻片上滴加一滴生理盐水，再用灼烧过且冷却的接种环取少量培养基上的细菌与玻片上的盐水相混合，从中央逐步向外围涂开，厚度以肉眼稍觉浑浊即可。若涂片太厚，菌体在中央集中，影响观察效果。若涂片太薄，菌体过于稀少，观察时难以找到视野。涂片菌膜过厚时，因大肠埃希菌密集成堆造成不易脱色或脱色不完全而常常呈 G+反应。2024/6/17 周一二、涂片的厚度三、媒染时间四、脱色时间五、干燥的温度六、固定的操作一、培养菌的菌龄影响因素影响因素对于 G-菌而言，媒染时间过长容易造成假阳性。可能与媒染时间过长使结晶紫复合物和细胞结合过紧有关。2024/6/17 周一二、涂片的厚度三、媒染时间四、脱色时间五、干燥的温度六、固定的操作一、培养菌的菌龄影响因素影响因素脱色是影响革兰氏染色的关键步骤。规范的乙醇脱色使G+菌细胞壁脱水,肽聚糖层网状结构孔径缩小,通透性降低,从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。但通透性降低不等于无通透性,不易被洗脱不等于不被洗脱。若脱色时间过长,G+菌也有可能被脱色,成为假阴性菌；若脱色时间不足,G-菌细胞壁的部分类脂质未被乙醇溶解,使结晶紫碘的复合物不能被洗脱出来成为假阳性菌。2024/6/17 周一二、涂片的厚度三、媒染时间四、脱色时间五、干燥的温度六、固定的操作一、培养菌的菌龄影响因素影响因素细菌涂片一般让它自然干燥，有时为了干燥快些，可以把涂片很小心地在酒精灯火焰上轻轻摆动，温度以不超过手背的耐受为限。若温度太高，细菌会发生菌体变形，影响结果观察。2024/6/17 周一二、涂片的厚度三、媒染时间四、脱色时间五、干燥的温度六、固定的操作一、培养菌的菌龄影响因素影响因素固定的目的是为了杀死细菌，使涂抹在玻片上的菌体很好地附着其上，防止被水冲掉，因为死的蛋白质比活的蛋白质着色力更强。因此固定时，玻片慢慢地在火焰上通过 2-3 次，使菌体受热附着在玻片上。当固定温度不够，菌体固着不够牢，则很易被洗脱。2024/6/17 周一二、涂片的厚度三、媒染时间四、脱色时间五、干燥的温度六、固定的操作一、培养菌的菌龄革兰氏染色辅助鉴别长期实践表明，革兰氏染色常因各种因素造成误差，引起结果不稳定，如菌龄不同，操作方法不当等。为了提高结果的准确性，可采用氢氧化钠拉丝反应作为辅助鉴别实验。本方法是：在干净的载玻片上滴 1 滴3g/dl NaOH，再从固体培养基上挑取一较大的菌落，把菌落放在 NaOH 液 滴 上，用 接 种 环 在液 滴 上 研 磨10-15s，然后将接种环提起，在黑色背景下观察；60s 内出现细丝为拉丝反应阳性，不出现细丝为拉丝反应阴性，同时与革兰氏染色结果作对照比较。氢氧化钠拉丝阴性的细菌符合革兰氏阳性，氢氧化钠拉丝阳性的细菌符合革兰氏阴性。2024/6/17 周一革兰氏染色改良方法快速法快速法1.在固定好的涂片上，滴加结晶紫液 2 滴，再加入 0.5mol/LNaHCO3 缓冲液 2 滴，摇动 35s 后冲洗。2.滴加碱性碘溶液几滴，摇动 35s 后冲洗。3.滴加脱色剂液几滴，摇动 35s 后冲洗。4.滴加碱性复红液几滴，摇动 35s 后冲洗，待干镜检。三步法三步法1.取少量菌种均匀涂片,干燥,固定;2.结晶紫 1min,水洗3.碘液 1min,水洗4.0.4复红酒精 30s,水洗5.干后镜检。2024/6/17 周一革兰氏染色改良方法方法方法类型型实验涂片数涂片数成功涂片数成功涂片数成功率成功率(%)制片制片时间(min)传统方法1108577.38快速法725880.64三步法888090.952024/6/17 周一革兰氏染色的意义1.鉴别细菌2.选择药物 3.与致病性有关：革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素，两者的致病作用不同。2024/6/17 周一参考文献1 俞树荣.微生物学和微生物学检验（第二版）M.北京:人民卫生出版社，2001：9104.2 周德庆.微生物学教程 M.北京:高等教育出版社,1993，18401.3 俞树荣.微生物学和微生物学检验（第二版）M.北京:人民卫生出版社，2001,9104.4 白菊萍.革兰氏染色技术的相关探讨研究，20122024/6/17 周一革兰氏染色法的机制和重要性Product by 邱钰文 周翔翔 麦剑芳 黄梧驭Thank you!