质粒提取原理和方法.doc_咨信网zixin.com.cn

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. 质粒DNA提取的原理及方法碱裂解法质粒DNA提取原理质粒DNA提取主要包括以下几个方面：如何将细胞裂解释放质粒DNA，如何将质粒DNA和基因组DNA分离开来，如何去除RNA污染，如何去除蛋白质和其它杂质。质粒提取方法中，最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。其原理是：强碱性条件下，质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来，并发生变性。在pH中性，并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复性，仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，在去垢剂SDS作用下，染色体DNA与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，通过离心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。 BIOMIGA公司质粒DNA纯化系列试剂盒，采用碱裂解法质粒提取原理，在高盐环境下，采用硅胶膜特异性的吸附质粒DNA，而蛋白质不被吸附，最后用低盐洗脱液将DNA从膜上洗脱下来，方法简单，快速，质量好，收获量高。影响质粒提取的因素影响质粒提取的因素有很多种，如质粒拷贝数，宿主菌株的种类，细菌的培养时间、培养基种类、培养条件等等。质粒拷贝数质粒DNA最终收获量取决于质粒的拷贝数和质粒的大小。BIOMIGA 公司质粒DNA提取系列试剂盒，操作步骤适用于高拷贝数质粒的纯化，对于低拷贝质粒纯化提取，应加大起始菌液量的体积，并且相应地增加各种缓冲液的用量。下表给出一些常用质粒载体的拷贝数：质粒种类复制起点拷贝数 1 mL菌液质粒DNA收获量(µg) pSC101 pSC101 5 0.1-0.2 pACYC P15A 10-12 0.4-0.6 pSuperCos pMB1 10-20 0.4-1 pBR322 pMB1 15-20 0.6-1 pGEMR Muted pMB1 300-400 6-7 pBluescriptR ColE1 300-500 6-8 pUC Muted pMB1 500-700 8-12 宿主菌株宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株，如JM101, JM110, HB101, TG1以及它们的衍生菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放出来的核酸酶的作用下，将会显著影响最终收获量，或者纯化到的质粒容易降解，推荐客户将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a进行质粒纯化。如果从含内源核酸酶的宿主菌株中纯化质粒DNA，请用试剂盒附送的核酸酶去除溶液，去除核酸酶的污染。或选用HP系列试剂盒进行质粒的纯化。下表给出一些常用的宿主菌株种类： EndA- Strains of E. Coli DH5α DH1 DH21 JM106 JM109 SK2267 SRB XLO TOP10 DH10B JM103 JM107 SK1590 MM294 Stbl2™ XL1-Blue BJ5182 DH20 JM105 JM108 SK1592 Select96™ Stbl4™ XL10-Gold EndA+ Strains of E. Coli C600 JM110 RR1 ABLE® C CJ236 KW251 P2392 BL21(DE3) HB101 TG1 TB1 ABLE® K DH12S™ LE392 PR700 BL21(DE3) pLysS JM101 JM83 TKB1 HMS174 ES1301 M1061 Q358 BMH 71-18 All NM strains All Y strains 菌液培养 BIOMIGA 公司质粒DNA提取系列试剂盒，标准操作适用于在LB培养基中培养12~16小时，OD600在2.0~3.0的菌液质粒DNA的提取。如果使用丰富培养基，如TB，2 x YT培养基，请保证OD600不超过3.0。菌液过量，将会影响最终的收获量和纯度。培养方式如果用于质粒小提，请从固体培养基平板上挑取新鲜单菌落，接种到加入筛选抗生素的培养基中，震荡培养12~16小时。如果用于中提、大提或超大提，请按照以下方式制备菌液：挑取单克隆，接种到1~5mL培养基中，进行初摇，然后按照1:1000的比例进行放大培养，培养瓶中培养基的体积最好不要超过培养瓶的1/4体积。抗生素浓度的选择对含有抗性的质粒载体，在进行筛选或培养时应加入相应的抗生素。各种抗生素的工作浓度请参照下表：抗生素溶解性保存条件严紧型质粒松弛型质粒氨苄青霉素 50 mg/mL(溶于水) -20℃ 20 µg/mL 60 µg/mL 羧苄青霉素 50 mg/mL溶于水 -20℃ 20 µg/mL 60 µg/mL 氯霉素 34 mg/mL溶于无水乙醇 -20℃ 25 µg/mL 170 µg/mL 卡那霉素 10 mg/mL溶于水 -20℃ 10 µg/mL 50 µg/mL 链霉素 10 mg/mL溶于水 -20℃ 10 µg/mL 50 µg/mL 四环素 5 mg/mL溶于无水乙醇 -20℃ 10 µg/mL 50 µg/mL 质粒质量鉴定纯化到的质粒DNA一般可以通过以下三种方式进行质量鉴定。琼脂糖凝胶电泳检测理想条件下，经碱裂解法纯化到的质粒DNA，应该只出现超螺旋一条带。但在质粒提取过程中机械力，强碱溶液的作用等原因，纯化到的质粒常常会出现三条带，甚至有时候会出现四条带(变性超螺旋)，不管是哪种形式的超螺旋，经单酶切后，呈现一条带，则说明提取结果正常，没有基因组污染。酶切鉴定纯化到的质粒，进行进一步的酶切操作，鉴定质粒的大小。紫外分光光度计检测纯化到的质粒，稀释一定的倍数，通过测定OD280，OD260，OD230，计算收获量和纯度。OD260/OD280在1.7~1.9之间，说明质粒纯度较好。如果洗脱时用去离子水洗脱，测光吸收时，pH值和离子浓度会影响光吸收值，比值会偏低，但并不表示纯度低。 7 / 7

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