梅毒实验室诊断方法.doc

. 梅毒实验室诊断梅毒的实验室诊断方法主要有显微镜检查法和血清学检测法。一、显微镜检查法（一）暗视野显微镜检查【基本原理】梅毒硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损的渗出液涂片，以及淋巴结穿刺液涂片等，在暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。【仪器材料】1暗视野显微镜。2钝刀（刮勺）、载玻片、盖玻片、注射器具、无菌生理盐水。【标本采集】1皮肤黏膜组织液：无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物，钝刀轻刮、挤压皮损表层，取渗出液与预先滴加在载玻片上的生理盐水混合后加盖玻片镜检。2淋巴液：无菌操作下穿刺淋巴结，注入生理盐水并反复抽吸23次，取少量的淋巴液直接滴于载玻片上，加盖玻片镜检。【操作步骤】1加镜油：在暗视野显微镜的聚光器上滴加镜油。2聚光：将标本玻片置载物台上，上升聚光器使镜油接触载玻片底面。3镜检：在镜下观察，寻找有特征形态和运动方式的梅毒螺旋体。【结果判读】11111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111、告111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111梅毒螺旋体在暗视野显微镜镜下表现为纤细、白色、有折光的螺旋状微生物，长520mm，直径小于0.2mm，有612个螺旋，具有旋转、蛇行及伸缩等三种特征性的运动方式。暗视野显微镜下发现有上述特征的螺旋体为阳性结果。【结果报告】1阳性：见到上述特征的梅毒螺旋体。2阴性：未见到上述特征的梅毒螺旋体。【临床意义】1暗视野显微镜检查阳性,可确诊梅毒。2螺旋体检查是诊断早期现症梅毒的最好方法，世界卫生组织指定为性病实验室必备项目之一。3如未见到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性，应复查和血清学检查。【注意事项】 1. 取材时尽量避免出血，以免影响镜下观察。2. 取材后应立即置暗视野显微镜下观察。3. 镜下观察时应注意与其他螺旋体相鉴别。（二）镀银染色检查【基本原理】 梅毒螺旋体具有亲银性，可被银溶液染色，从而可以在镜下观察到梅毒螺旋体。 【仪器材料】1显微镜。2罗吉氏固定液、鞣酸媒染剂、Fontana氏银溶液。【标本采集】1. 皮肤黏膜组织液：无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物，钝刀轻刮、挤压皮损表层，取渗出液涂片。2淋巴液：无菌操作下穿刺淋巴结，注入生理盐水并反复抽吸23次，取少量的淋巴液直接滴于载玻片上。【操作步骤】1涂片干燥：将标本涂于干净载玻片作一薄片，于空气中自然干燥。2固定：用固定液将涂片固定23分钟。3洗涤：用无水乙醇洗涤玻片上的油污。4媒染：加媒染剂于涂片上，微加热产生蒸汽，染30秒。5银染：水洗，加银染液于涂片上，微加热产生蒸汽，染30秒。6镜检：水洗、待干，用油镜检查。【结果判读】显微镜下见到染成棕褐色的梅毒螺旋体为阳性结果。【结果报告】1阳性：见到染成棕褐色梅毒螺旋体。2阴性：未见到染成棕褐色的梅毒螺旋体。【临床意义】同暗视野显微镜检查法。【注意事项】应注意与其他螺旋体加以鉴别。二、血清学检测法（一）非梅毒螺旋体抗原血清试验非梅毒螺旋体抗原血清试验，包括性病研究实验室（VDRL）试验、快速血浆反应素（RPR）环状卡片试验、甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）等。n VDRL试验【基本原理】梅毒螺旋体感染人体后，宿主会产生抗类脂抗原的抗体（反应素），与一定比例的心磷脂、卵磷脂及胆固醇混合物抗原反应，可检测梅毒患者血中的抗类脂抗原的抗体。【仪器材料】1. 水平旋转仪、显微镜。2. 试剂盒：VDRL抗原原液、VDRL缓冲液、抗原滴管及针头、带直径14mm漆圈的玻璃反应板、VDRL试验结果参照图片。3. 30mL平底玻璃小瓶、生理盐水。【标本采集】1. 血清：抽取静脉血，室温静止凝固后，分离新鲜血清。也可采用冻存的血清。2. 脑脊液：采用腰椎穿刺术获得，应由相关专业人员操作。 【操作步骤】1. VDRL抗原配制。2. VDRL玻片定性试验 （1）灭活：血清标本56灭活30分钟。 （2）吸样：吸取0.05mL血清放入反应板圈中，将血清涂布到整个圈内。 （3）加抗原：用标准针头加入1滴抗原。 （4）反应：将反应板置水平旋转仪上旋转4分钟，(1805)次/分钟，立即置低倍显微镜下观察。3.VDRL定量试验（1）加稀释液：在圈内加入0.05mL生理盐水（根据需要确定稀释度）。 （2）样本稀释：吸取0.05mL样本与各圈中盐水作系列稀释并涂布整个圈内。 （3）以下步骤同定性试验（2）（4）。【结果判读】凝集反应强度分级：3 4：大的或中等大小的絮状物，液体清亮2：絮状物较小，液体较清亮1：絮状物较小，均匀分布，液体混浊：抗原复合物颗粒稍粗：抗原颗粒均匀、细小【结果报告】1定性试验：（1）阳性：镜下可见14的絮状凝集物。（2）阴性：不产生凝集反应。2定量试验：滴度：镜下可见絮状凝集物的血清最高稀释倍数。【临床意义】对一期、二期、潜伏期和晚期梅毒患者的敏感性分别为78%、100%、96%和71%。脑脊液VDRL阳性对神经梅毒有诊断意义。【注意事项】 1VDRL用抗原需当天配制。2试验反应完毕，应立即观察结果。n RPR试验 【基本原理】 RPR试验是VDRL试验的一种改良方法。该法在心磷脂、卵磷脂和胆固醇等组成的抗原中加入活性炭颗粒，与待检血清（浆）中的反应素结合，形成肉眼可见的黑色絮状物。 【仪器材料】1水平旋转仪。2RPR试剂盒：RPR抗原、直径为18mm圆圈的反应卡片、抗原滴管、针头。【标本采集】1血清：抽取静脉血，室温静止凝固后，分离新鲜血清。也可采用冻存的血清。2血浆：各种抗凝剂制备的血浆。 【操作步骤】 1定性试验 （1） 加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内。 （2）加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头每毫升（601）滴加1滴抗原。 （3）反应：将卡片置水平旋转仪旋转8分钟（1005）转/分钟。立即在亮光下观察结果。2定量试验 （1）稀释液准备：在圈内加入0.05mL生理盐水（根据需要确定稀释度），勿将盐水涂开。 （2）加样：吸取0.05mL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。 （3）同定性试验（2）（4）。 【结果判读】凝集反应强度分级：3 4：圆圈内出现中到大的黑色絮状物，液体清亮 2：圆圈内出现小到中的黑色絮状物，液体较清亮 1：圆圈内出现小的黑色絮状物，液体混浊 ：圆圈内仅见碳颗粒集于中央一点或均匀分散 【结果报告】1定性试验：（1）阳性：出现14强度的凝集反应。（2）阴性：不产生凝集反应。2定量试验：滴度：出现凝集反应的血清最高稀释倍数。【临床意义】1RPR试验适用于梅毒筛查、疗效观察、复发或再感染的检查。2对未经治疗的一期、二期和潜伏梅毒患者的敏感性分别为86%、100%和98%。【注意事项】试验应在2329环境中进行。n TRUST试验TRUST试验是用甲苯胺红颗粒代替RPR试验中的碳颗粒作为指示物，所以阳性结果为红色絮状物。其基本原理、仪器材料、标本采集、操作步骤、结果判读、结果报告、临床意义及注意事项等与RPR试验基本相同。（二）梅毒螺旋体抗原血清试验 梅毒螺旋体抗原血清试验是以梅毒螺旋体为抗原的特异性的抗原抗体反应，用以检测梅毒抗体，常用的方法有梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）、梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）、梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）和梅毒螺旋体蛋白印迹试验（TP-WB）等方法。 n TPPA试验 【基本原理】TPPA试验是用超声裂解梅毒螺旋体制备的抗原，致敏明胶粒子，其致敏粒子与待检血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可见的凝集。【仪器材料】 1. 微量震荡器。2. 试剂盒：“A”溶解用液、“B”标本稀释液、“C”致敏粒子、“D”未致敏粒子、“E”质控血清。 3U型反应板。【标本采集】 同RPR试验。【操作步骤】 1试剂准备：试验前将待检样本和试剂应恢复到室温。 2加稀释液：每份样本做4孔，加B液至反应孔内，第1孔100L，第24孔各25L。 3样本稀释：取血清25L加至第1孔，混匀后取25L至第2孔，连续倍比稀释至第4孔，最后1孔混匀后弃去25L。4加对照液：第3孔加D液25L，第4孔加C液25L。 5混合：将反应板置震荡器震荡30秒。 6反应：置湿盒内，孵育2小时后，或放4冰箱过夜观察结果。【结果判读】观察凝集反应强度，分级如下：4： 粒子光滑覆盖整个孔底，有时边缘有折叠 3： 粒子光滑覆盖大部分孔底 2： 粒子光滑聚集覆盖孔底，周围有一细胞环 1： 粒子光滑集聚覆盖孔底，周围有一明显细胞环 ： 粒子沉集孔底，中央形成一小点 ： 粒子紧密沉积孔底中央 【结果报告】1阳性：未致敏粒子不出现凝集（第3孔），血清180以上稀释与致敏粒子产生14凝集反应。2. 阴性：未致敏粒子和致敏粒子均不产生凝集反应。【临床意义】1. TPPA可作为非梅毒螺旋体抗原血清试验(如RPR等)初筛阳性标本的确证试验。2梅毒患者经过抗梅治疗后，TPPA试验仍可阳性，故TPPA试验阳性不能作为疗效观察的指标。3TPPA阳性不能区分既往感染和现症感染，应结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果进行诊断。【注意事项】 1. 试验结果为“可疑”时，应选用其他的试验方法进行复验。 2. 如未致敏粒子出现凝集反应，样本进行吸收后再进行试验，或改用其他试验方法。n TPHA试验 【基本原理】 TPHA试验用超声裂解的梅毒螺旋体菌体为抗原，致敏经醛化、鞣化的羊或禽类红细胞，与抗梅毒螺旋体抗体反应，产生肉眼可见的抗原抗体凝集。 【仪器材料】1. 微量震荡器。2TPHA试剂盒：“A”溶解用液、“B”标本稀释液、“C”致敏粒子、“D” 未致敏粒子、“E”质控血清。 3. U型反应板。【标本采集】同RPR试验。 【操作步骤】 1试剂准备：试验前试剂恢复到1525。 2加稀释液：加B液至反应板，第1孔25mL，第2孔100mL，第35孔各加25mL。 3样本稀释：取血清25mL加至第1孔，混匀后取25mL至第2孔，混匀后取25mL至第3孔，混匀后弃去25mL，再从第2孔取25mL至第4孔，混匀后取25mL至第5孔，混匀后弃去25mL。 4加对照液：第3孔加D液（未致敏细胞）75L，第4、5孔加C液（致敏细胞）各75mL 。 5混合：将反应板置震荡器震荡30秒。 6反应：置湿盒内，1525孵育4小时，或放4冰箱过夜观察结果。 【结果判读】同TPPA试验。【结果报告】 同TPPA试验。【临床意义】同TPPA试验。【注意事项】有些采用禽类红细胞为载体的TPHA试验，血清不用吸收，可直接进行试验。n FTA-ABS试验 【基本原理】以完整的梅毒螺旋体作为抗原，与经吸收剂吸收的梅毒血清抗体反应形成抗原抗体复合物，再加入荧光素（FITC）标记的抗人免疫球蛋白，形成带有荧光的抗原抗体复合物，在荧光显微镜下螺旋体显出苹果绿色荧光。 【仪器材料】1荧光显微镜。2试剂盒：梅毒螺旋体抗原片、吸收剂、荧光素标记抗体、阳性对照血清、PBS缓冲液、固定剂。 3.血清稀释板。【标本采集】同VDRL试验。【操作步骤】1. 血清灭活：将血清标本于56灭活30分钟，备用。2. 血清稀释：待检血清用吸收剂1：5稀释，阳性血清及阴性血清分别用PBS缓冲液和吸收剂1:5稀释。置37湿盒内，30分钟。3. 加样：每次试验必须设PBS缓冲液、吸收剂、PBS液15稀释阳性和阴性血清及吸收剂1：5稀释阳性和阴性血清共6个对照涂片。每个涂片分别加入10L稀释后的血清或缓冲液，置37湿盒内，30分钟。4. 洗涤：用PBS- Tween-80液洗玻片2次，每次5分钟，最后用蒸馏水洗一次，冷风干燥。5. 加荧光抗体：每个涂片加10L按要求稀释的荧光抗体,置37湿盒内30分钟。6. 洗涤：同步骤4。7. 封片镜检：用固定剂封片，读片。【结果判读】1. 阳性对照：无论PBS缓冲液还是吸附剂稀释，荧光强度应相同。2. 阴性对照和空白对照：不产生荧光。【结果报告】1. 阳性：荧光镜下见到不同程度发绿色荧光的螺旋体。2. 阴性：无荧光或密螺旋体微显淡绿色。【临床意义】1.FTA-ABS是梅毒螺旋体抗原血清学试验的“金标准”。2对未经治疗的一期、二期、潜伏梅毒和晚期梅毒患者的敏感性分别为84%、100%、100%和96%，特异性均可达97%。 3. 其他同TPPA试验。【注意事项】1. 抗原片每次洗涤要干净，避免其他杂质影响判读结果。2. 试验需有高质量荧光显微镜和技术熟练的操作人员。n TP-ELISA试验 【基本原理】TP-ELISA试验是用包被在固相板条上经超声裂解、纯化处理或重组的梅毒螺旋体抗原，与待检血清中的梅毒特异性抗体结合，再与酶标记的抗人免疫球蛋白单克隆抗体反应，形成抗原抗体复合物而使底物显色。 【仪器材料】1. 酶标仪、洗板机。2试剂盒组成：96孔反应板、标本稀释液、洗涤液、酶结合物、底物液、终止液、阳性对照、阴性对照。【标本采集】同RPR试验【操作步骤】1.加稀释液：取标本稀释液加到反应板孔内。 2.孵育：分别加入阳性、阴性对照和待检血清，置37孵育一定时间, 洗板。3.加酶结合物：加酶结合物，置37孵育一定时间, 洗板。4.加显色剂：加底物，37避光孵育。5.终止反应：加终止液，酶标仪测OD（光密度）值。 【结果判读】1每次试验的阳性、阴性对照应在规定的数值范围内2根据阳性、阴性OD值设定阈值（cut-off值）。【结果报告】1阳性：标本OD值大于或等于cut-off值。2阴性：标本OD值小于cut-off值。【临床意义】（1）适用于流行病学调查或大样本量标本的检测。（2）ELISA阳性不能区分既往感染和现症感染，应结合非梅毒螺旋体抗原血清试验(如RPR等)结果进行诊断。【注意事项】 1.不同批号试剂不能混用。 2.温度和时间必须严格控制。 TP-WB试验【基本原理】 用超声粉碎的梅毒螺旋体或梅毒螺旋体重组的不同抗原，印迹至硝酸纤维膜条上。通过酶联反应，可检测梅毒血清中多种特异抗原成分的抗体。【仪器材料】1. 水平摇床。2. 试剂盒:硝酸纤维膜条、酶标抗体、阳性质控血清、阴性质控血清、底物液、终止液、标准阳性反应带结果参比图谱。【标本采集】 同RPR试验【操作步骤】 1反应：每反应槽加2.0mL工作缓冲液，浸湿膜条5分钟，加入0.02mL待检样本，置水平摇床上(50转/分)，1825反应45分钟。 2洗涤：弃去反应槽中液体，加入 2.0mL工作缓冲液，置水平摇床洗涤3次，每次5分钟。 3加酶结合物： 加入酶标抗体，置水平摇床反应30分钟。 4洗涤：同步骤2。5显色：每槽加2.0mL底物，置水平摇床上反应810分钟。6终止: 待阳性对照带显色清晰，加入1.0 mL终止剂2分钟后弃去槽中液体，用蒸馏水洗2次，用镊子取出反应条，置滤纸上。【结果判读】1根据阳性结果参比图谱判定结果。 2. 将试验的硝酸纤维膜条上端标记线与参比标记线对齐。3观察45KD、17KD及15.5KD带区显色带。【结果报告】 1阳性： 45KD、17KD及15.5KD带区均出现显色带。2阴性： 45KD、17KD及15.5KD三个条带均未显色。【临床意义】1同TPPA试验2可以用于检测IgM或IgG抗体。 【注意事项】 1洗涤要充分，否则易造成试验膜条带背景的颜色偏深。2硝酸纤维膜条有对照反应条带，在试验中应显示，如未显示，则试验无效。3当45KD、17KD及15.5KD中只有一个或两个条带出现明显色带为可疑结果，需重新试验。n 快速免疫层析法【基本原理】利用免疫层析原理，采用吸附有显色标记的梅毒螺旋体重组抗原的滤纸条，快速检测标本中的梅毒螺旋体抗体。【仪器材料】 试剂盒：测试板、一次性滴管。【标本采集】同RPR试验，可用全血。【操作步骤】1加样：用一次性滴管滴加一定量标本于加样孔中。2加缓冲液：立即加入一定量的缓冲液。3观察结果：规定时间内判读结果。【结果判读】1. 观察质控条带,判断试验有效性，如没有出现质控条带，说明试验无效，需重复试验。2观察标本条带。【结果报告】1阳性: 出现标本条带和质控条带。2阴性：无标本条带，出现质控条带。【临床意义】1可以用于标本的快速筛查。2快速检测阳性不能区分既往感染和现症感染，应结合非梅毒螺旋体抗原血清试验(如RPR等)结果进行诊断。【注意事项】1试剂盒从冷藏环境中取出时，应平衡至室温后方可使用。2本试验方法存在一定的假阳性和假阴性。三、其它方法（一）梅毒IgM抗体的检测与其它细菌及病毒感染一样，在梅毒中特异性IgM抗体的合成是第一次感染后的体液免疫应答。在梅毒中螺旋体IgM抗体出现在早期梅毒患者中，在潜伏期及晚期患者也能发现。在自发痊愈的患者中IgM水平下降的速度比治疗痊愈的患者慢。IgM分子大使其不能通过胎盘屏障及完整无损的血脑屏障。因此若在新生儿血中检测到IgM抗体是儿童产前感染的诊断标志；如在患者的完整无损的血脑屏障的脑脊液（CSF）中出现，则表示患有活动性神经梅毒。在最近未接受治疗的患者血液中或CSF中出现抗梅毒IgM抗体均表示需要治疗。测定IgM抗体方法的基本原理是采用分离柱，使血清中的IgM和IgG按其分子量大小在分离过程中的沉降速度不同，将IgM和IgG分别收集，再进行FTA-ABS等试验。亦可采用抗IgM单克隆抗体的酶标法、蛋白质印迹法等进行检测。目前测定IgM抗体的方法的敏感性还很不理想，但是检查到IgM抗体则有助于对以下病例中的试验结果更可靠的解释：先天性梅毒、早期一期梅毒、晚期梅毒、非梅毒螺旋体试验的血清阳转前的早期感染患者的判愈试验及有梅毒史或其它螺旋体感染史患者的再感染。 （二）胎传梅毒(或先天梅毒)的实验室诊断具有下列实验室四个指标之一，可诊断为胎传梅毒(或先天梅毒)：暗视野检查梅毒螺旋体阳性；患儿非梅毒螺旋体血清抗体滴度持续上升；患儿非梅毒螺旋体血清学定量试验结果比母亲高4倍（低于或等于该值并不排除胎传梅毒）；患儿检出19S-IgM抗体。（三）神经梅毒的实验室诊断1神经梅毒的实验室诊断标准包括：梅毒血清学检查阳性；脑脊液细胞计数或蛋白测定结果异常；脑脊液VDRL试验阳性。2脑脊液VDRL试验是神经梅毒的标准试验，阳性结果可诊断为神经梅毒，但该试验存在假阴性。3脑脊液的FTAABS试验阴性可排除神经梅毒，但特异性不高，可能产生假阳性。4脑脊液检查内容 （1）细胞计数：正常时白细胞数应小于3106/L，若白细胞数大于10106/L，提示中枢神经系统有炎症现象。（2）蛋白质量测定：总蛋白质量正常为0.10.4g/L，神经梅毒可稍升高，或高达1.02.0g/L。9 / 9