老鹳草素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制.pdf

2023 年 9 月第 43 卷第 9 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Sept.2023 Vol.43 No.9 1063DOI:10.13463/ki.jlzyy.2023.09.018老鹳草素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制彭彩亮1，崔 璇2*，蒋 宁1，马熙凯2，郭梦雨2，王超龙2，陈 曦2，王首舜2（1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学研究生院，哈尔滨 150040）摘要：目的 探讨老鹳草素对心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制。方法 将 75 只 SPF 级雄性小鼠用随机数字表分为老鹳草素低剂量组（5 mol/L）、中剂量组（10 mol/L）、高剂量组（20 mol/L）、假手术组和模型组，各 15 只。观察小鼠心脏功能，检测心肌损伤标志物，观察各组大鼠心肌组织病理变化，检测心肌组织中核转录因子 E2 相关因子（nuclear transcriPtion factor E2-related factor，Nrf2）信号通路相关蛋白水平。体外培养 H9C2 细胞，检测 H9C2 细胞中自噬相关蛋白及 Nrf2 信号通路相关蛋白水平。结果 与假手术组相比，模型组心功能指标均下降；与模型组相比，老鹳草素低、中、高剂量组 LVEF、FS、LVWT、HR、LVSP 水平均升高（P0.05）；模型组肌红蛋白（myoglobin，Mb）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-Mb）、肌钙蛋白 I（cardiac troPonin I，cTnI）水平高于假手术组（P 0.05）；与假手术组相比，模型组 LC3-II/LC3-I 比值、Beclin-1 升高，P62、Nrf2、游离血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）蛋白水平降低（P 0.05）；与模型组相比，老鹳草素低、中、高剂量组 P62、Nrf2、HO-1 蛋白水平升高（P 0.05）；与对照组相比，H9C2 细胞模拟缺血/再灌注（SI/R）损伤后 LC3-II/LC3-I 比值、Beclin-1 升高，P62、Nrf2、HO-1 蛋白水平降低（P 0.05）。结论 老鹳草素可能通过激活 Nrf2 信号通路，抑制心肌细胞过度自噬，对心肌缺血再灌注损伤起到明显保护作用。关键词：老鹳草素；心肌缺血/再灌注损伤；自噬；Nrf2 信号通路；大鼠 中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1003-5699(2023)09-1063-05Effect and mechanism of geraniin on myocardial ischemia-reperfusion injury PENG Cailiang1,CUI Xuan2*,JIANG Ning1,MA Xikai2,GUO Mengyu2,WANG Chaolong2,CHEN Xi2,WANG Shoushun2 (1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;2.Graduate School of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of geraniin on myocardial ischemia-reperfusion injury.Methods A total of 75 male SPF mice were randomly divided into a low-dose geraniin group(5 mol/L),a medium-dose geraniin group(10 mol/L),a high-dose geraniin group(20 mol/L),a sham operation group and a model group,with 15 rats each group.The cardiac function of mice was observed,the myocardial injury markers were detected,the pathological changes of myocardial tissue were observed in rats in each group,and the protein level of nuclear transcription factor E2-related factor(Nrf2)signaling pathway in myocardial tissue was detected.H9C2 cells were cultured in vitro,and the levels of autophagy-related proteins and Nrf2 signaling pathway-related proteins in H9C2 cells were detected.Results Compared with the sham operation group,the cardiac function indexes of the model 基金项目：黑龙江中医药大学科研基金项目（2019MS03）；黑龙江省自然基金面上项目（H2017065）；黑龙江省中医药管理局课题（ZYW2022-088）作者简介：彭彩亮（1985），男，博士研究生，主治医师，主要从事针药治疗心脑血管疾病研究*通信作者：崔 璇，电子信箱-实验研究1064 2023 年 9 月第 43 卷第 9 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Sept.2023 Vol.43 No.9 group were all decreased;compared with the model group,the levels of LVEF,FS,LVWT,HR and LVSP in the low-,medium-,and high-dose geraniin groups were all increased(P0.05),the levels of myoglobin(Mb),creatine kinase isoenzyme(CK-Mb),and cardiac troponin I(cTnI)in the model group were higher than those in the sham operation group(P0.05).Compared with the sham operation group,the ratio of LC3-II/LC3-I and Beclin-1 in the model group were increased,while the protein levels of P62,Nrf2,and free heme oxygenase-1(HO-1)were decreased(P0.05).Compared with the model group,the protein levels of P62,Nrf2 and HO-1 in the low-,medium-,and high-dose geraniin groups were increased(P0.05).Compared with the control group,the ratio of LC3-II/LC3-I and Beclin-1 were increased after simulated ischemia/reperfusion(SI/R)injury,while the protein levels of P62,Nrf2 and HO-1 were decreased(P0.05).Conclusion Geraniin may inhibit the excessive autophagy of cardiomyocytes by activating the Nrf2 signaling pathway,and play a significant protective role in myocardial ischemia-reperfusion injury.Keywords:geraniin;myocardial ischemia/reperfusion injury;autophagy;Nrf2 signaling pathway;rats 心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）仍然是全球死亡率最高的疾病之一。心肌缺血后血流再恢复可以缓解缺血症状，但可能会加重由心肌缺血/再灌注损伤（MI/RI）引起的心肌损伤。心肌缺血/再灌注损伤过程中的氧化应激、炎症反应等机制引起严重的心脏疾病如心脏功能障碍、心律失常，此外，还可引起心肌细胞坏死1-2。自噬是细胞对多种应激的保护机制之一，在心肌缺血/再灌注损伤过程中起重要作用，被认为是新的调控靶标3-4。Nrf2 信号通路可通过诱导细胞保护基因来保护细胞免受氧化应激。研究表明，Nrf2 信号通路与心肌缺血再灌注有关5。老鹳草素是老鹳草中的一种具有显著抗氧化活性的多酚化合物，具有抗高血压、抗氧化等作用6-8。本研究通过实施体内外实验，探讨老鹳草素对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及潜在机制。1 材料和方法1.1 实验材料 SPF 级雄性 C57BL/6 小鼠 75 只，8 周龄，体质量（242）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。本研究通过动物伦理委员会批准（hljzy202001201）。H9C2 细胞购自中国科学院细胞库。老鹳草素购自美国 Sigma 公司（20200816）；CK-Mb、Mb、cTnI 检测试剂盒，购自基蛋生物科技有限公司（20210205）；抗体-actin、LC3II、LC3I、Beclin1、P62、Nrf2、HO-1 均购自美国 Cell Signaling Technology 公司（20210318，20210219，20200115，20200402，20200317，20200425，20200502）。BCA 试剂盒购自碧云天生物技术公司（20210327）。Gel Doc XR 型凝胶成像系统（美国 Bio-Rad 公司）；BL-420F型生物信号采集系统（成都泰盟）；OlymPus CX31 正置显微镜（日本 OlymPus 公司）；2135 型组织切片机（德国徕卡公司）。1.2 给药和建模 将 75 只 SPF 级雄性小鼠用随机数字表分为低剂量组（5 mol/L）、中剂量组（10 mol/L）、高剂量组（20 mol/L）、假手术组和模型组，各 15 只。根据文献方法12结扎左冠状动脉前降支制备心肌缺血/再灌注损伤模型（缺血 30 min，再灌注2 h，以心电图 QRS 波加大和 ST 抬高作为建模成功的标准）和心肌缺血/再灌注损伤加不同剂量老鹳草素组，假手术组小鼠除不结扎外其他处理相同；老鹳草素处理组小鼠腹腔注射给药；假手术组和模型组给予等量生理盐水；每日 1 次，连续 7 d。末次给药后小鼠禁食、麻醉后连接心电图。气管造口完成后，连接呼吸机。结扎小鼠的左冠状动脉 30 min，然后再灌注120 min。1.3 心功能检测 再灌注 2 h 后，超声心动图检查各组小鼠的左心室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（FS）、左心室壁厚度（LVWT）、心率（HR）、左室收缩压（LVSP）水平。1.4 检测心功能标志物 心功能监测结束后，各组各取10只小鼠，取5 mL股动脉血，3 000 r/min 离心15 min（离心半径 12 cm），取上清液于-80 储存，检测Mb、CK-Mb、cTnI 水平，采用 ELISA 法严格按照试剂说明书操作，重复 3 次。1.5 苏木素-伊红（HE）染色观察心肌病理变化 心功能损伤标志物检测结束后，处死小鼠，将 50 只小鼠开胸取出心脏，滤纸吸干水分和血迹，沿房室沟剪去左右心房、主动脉和肺动脉、右心室，留取左心室，从左心室中部横轴切下部分心肌组织（厚度约0.5 cm）于4%多聚甲醛中固定72 h。经脱水、透明、石蜡包埋、切片（厚度 4 m）后进行 HE 染色，乙醇脱水、二甲 2023 年 9 月第 43 卷第 9 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Sept.2023 Vol.43 No.9 1065苯透明、中性树胶片封片后置于显微镜下观察心肌病理变化。1.6 细胞处理方法 H9C2 细胞购自中国科学院细胞库。按照标准细胞操作流程，用含 10%胎牛血清的DMEM 培养液培养，即为对照组，模拟缺血/再灌注（SI/R）组的细胞用含有酚红的 Hanks 液，置于低氧（1%O2）培养箱中培养 3 h 后，更换成正常培养液，在普通培养箱中继续培养6 h。老鹳草素治疗（老鹳草素加 SI/R）组在模拟缺血/再灌注处理前 30 min 用老鹳草素（终浓度为100 nmol/L9）处理细胞。自噬抑制剂 3-MA预处理组（3-MA加老鹳草素加SI/R）在模拟缺血/再灌注处理前1 h用3-MA（终浓度为 5 mol/L10）处理细胞。老鹳草素处理（Nrf2 SiRNA 加老鹳草素加 SI/R）组在模拟缺血/再灌注处理前 48 h 用浓度为 5 mol/L 腺病毒 SiRNA11转染细胞沉默 Nrf2，模拟缺血/再灌注处理前 30 min 用老鹳草素（终浓度为100 nmol/L）处理细胞。1.7 Western blot 检测 从 H9C2 细胞中提取总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒测量浓度。电泳分离蛋白，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂乳封闭后，将聚偏二氟乙烯膜与下列抗体在 4 孵育过夜：兔抗P62（Abcam，中国；1:500）、兔抗LC3I（Abcam，中国；1:500）、兔抗 LC3II Beclin1（Abcam，中国；1:500）、兔抗Nrf2（Abcam，中国；1:500）、兔抗 HO-1（Abcam，中国；1:500）、-actin一抗（Abcam，中国；1:500），Tris 缓冲盐水冲洗后，将这些膜与 HRP 标记过的 IgG二抗（1:500）继续孵育 1 h。ECL 试剂显示条带。1.8 统计学方法 数据处理采用SPSS 22.0软件进行。计量资料以均数 标准差（sx）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。2 结果2.1 老鹳草素对各组小鼠左心功能的影响 见表 1。表 1 各组小鼠心脏功能指标水平比较（sx，n=10）组别HR/（beat/min）LVSP/（mm Hg）LVEF/%FS/%LVWT/min假手术组406.4231.89133.2413.6159.116.5827.624.120.900.05模型组201.1229.88#59.0112.15#23.317.25#8.122.52#0.560.06#老鹳草素低剂量组225.3626.35 76.4511.8228.347.2210.122.10.630.04老鹳草素中剂量组295.1630.05 98.1211.7239.678.1116.543.00.750.08老鹳草素高剂量组305.1621.25112.348.9243.569.6119.542.60.820.03 注：与假手术组比较，#P 0.05；与模型组比较，P 0.05；与老鹳草素低剂量组比较，P 0.05；与老鹳草素中剂量组比较，P 0.052.2 老鹳草素对各组小鼠血清 CK-Mb、Mb、cTnI 的影响 见表 2。表2 各组小鼠CK-Mb、Mb、cTnI含量比较（sx，n=10）组别CK-Mb/（U/L）Mb/（U/L）cTnI/（ng/L）假手术组 22.325.87 26.898.640.100.08模型组106.899.78#150.5210.26#0.820.05#老鹳草素低剂量组 86.437.65132.348.230.520.02老鹳草素中剂量组 70.538.72 85.348.960.320.06老鹳草素高剂量组 50.236.92 65.677.260.220.04 注：与假手术组比较，#P 0.05；与模型组比较，P 0.05；与老鹳草素低剂量组比较，P 0.05；与老鹳草素中剂量组比较，P 0.052.3 老鹳草素对各组小鼠心肌病理变化的影响 光镜下可见，假手术组心肌结构整齐，心肌间质未见炎性细胞浸润，心肌细胞无肿胀。模型组小鼠心肌细胞肿胀，心肌结构紊乱，大量炎性细胞浸润心肌间质。老鹳草素低剂量组心肌结构部分整齐，炎性细胞浸润部分减轻，心肌细胞肿胀部分减轻。老鹳草素中剂量组心肌结构较整齐，炎性细胞浸润明显减轻，心肌细胞肿胀明显减轻。老鹳草素高剂量组心肌结构整齐，炎性细胞少许浸润，心肌细胞无肿胀。如图 1。2.4 老鹳草素对心肌缺血/再灌注损伤小鼠心肌组织中的自噬相关蛋白的影响 与假手术组相比，模型组LC3-II/LC3-I 比值、Beclin-1 升高，P62 水平降低（P0.05）；与模型组相比，老鹳草素低，中，高剂量组图 1 心肌组织 HE 染色（200）假手术组模型组老鹳草素低剂量组老鹳草素中剂量组老鹳草素高剂量组1066 2023 年 9 月第 43 卷第 9 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Sept.2023 Vol.43 No.9 P62 水平升高，并呈现剂量依赖性升高。与模型组相比，老鹳草素低，中，高剂量组 LC3-II/LC3-I 比值、Beclin-1 降低，并呈现剂量依赖性降低。见图 2。注：与假手术组比较，#P 0.05；与模型组比较，P 0.05；与低剂量组比较，P 0.05；与中剂量组比较，P 0.05图2 老鹳草素对心肌缺血/再灌注损伤小鼠心肌组织中的自噬相关蛋白的影响2.5 老鹳草素对心肌缺血/再灌注损伤小鼠心肌组织中的 Nrf2 信号通路的影响 与假手术组比较，模型组Nrf2、HO-1蛋白水平降低（P0.05）；与模型组比较，老鹳草素低，中，高剂量组 Nrf2、HO-1 蛋白水平均升高（P 0.05）。并呈现剂量依赖性升高。见图 3。注：与假手术组比较，#P 0.05；与模型组比较，P 0.05；与低剂量组比较，P 0.05；与中剂量组比较，P 0.05图3 老鹳草素对心肌缺血/再灌注损伤小鼠心肌组织中的Nrf2信号通路的影响2.6 老鹳草素对缺氧/复氧诱导损伤中 H9C2 细胞的自噬相关蛋白的影响 与对照组比较，H9C2 细胞 SI/R损伤后LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1升高，P62降低（P0.05）；与 SI/R 组比较，老鹳草素加 SI/R 组 LC3-II/LC3-I 比值、Beclin-1 降低、P62 升高（P 0.05）；与老鹳草素加 SI/R 组比较，自噬抑制剂 3-MA 预处理组LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1降低，P62升高（P0.05）。见图 4。2.7 老鹳草素对缺氧/复氧诱导损伤中 H9C2 细胞的保护通过 Nrf2 信号通路 与对照组比较，H9C2 细胞SI/R 损伤后 Nrf2、HO-1 蛋白水平降低（P 0.05）；而与 SI/R 组比较，老鹳草素加 SI/R 组 Nrf2、HO-1 蛋白水平升高（P0.05）；与老鹳草素加 SI/R组比较，Nrf2 SiRNA 加老鹳草素加 SI/R 组 Nrf2、HO-1 蛋白水平降低（P 0.05）。见图 5。注：与 control 比较，#P 0.05；与 SI/R 比较，P 0.05；与老鹳草素加 SI/R 比较，P 0.05图 4 老鹳草素对缺氧/复氧诱导损伤中 H9C2 细胞的自噬相关蛋白的影响 注：与 control 比较，#P 0.05；与 SI/R 比较，P 0.05；与老鹳草素加 SI/R 比较，P 0.05图 5 老鹳草素对缺氧/复氧诱导损伤中 H9C2 细胞的 Nrf2信号通路的影响3 讨论 介入治疗是快速恢复缺血性心脏病心肌缺血的重要治疗方式之一，但仍有可能发生心肌缺血/再灌注损伤13。Mb、CK-Mb、cTnI 是心肌损伤的标志物14。本实验结果显示，心肌缺血/再灌注损伤小鼠的LVEF、FS、LVWT、HR、LVSP水平降低（P0.05），血清 Mb、CK-Mb、cTnI 水平升高；心肌细胞肿胀，心肌间质大量炎性细胞浸润，而在心肌缺血/再灌注损伤建模之前予以不同浓度老鹳草素处理可以逐渐显著改善以上情况。本研究结果首次揭示老鹳草素对小鼠心肌缺血/再灌注损伤具有改善作用。自噬是细胞自动降解自身受损的细胞器和蛋白质的过程15。在持续缺血缺氧或再灌注状态下，自噬表达过度增强，不利于细胞存活16。微管相关蛋白3（LC3）被认为是自噬标志分子 17。Beclin-1 是自噬的正调节因子 18。P62 蛋白与 LC3 相互作用，其蛋白水平与自噬水平成反比19-20。本结果提示老鹳草素通过调控自噬抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤。研究报道 Nrf2 信号通路参与自噬的调节 21。机体 2023 年 9 月第 43 卷第 9 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Sept.2023 Vol.43 No.9 1067在外界有害刺激下，导致 Nrf2 活化并进入细胞核，启动抗氧化蛋白的转录和表达22。HO-1 是 Nrf2 信号通路中的关键靶蛋白23。本研究结果提示，老鹳草素通过 Nrf2 信号通路减轻心肌缺血/再灌注损伤小鼠心肌损伤。综上所述，老鹳草素可能通过激活Nrf2信号通路，抑制心肌细胞过度自噬，对心肌缺血再灌注损伤起到明显保护作用，这是老鹳草素药理作用的新发现，为临床防治心肌缺血/再灌注损伤提供新的方法。参考文献：1GAO T,YANG P,FU D,et al.The protective effect of allicin on myocardial ischemia-reperfusion by inhibition of Ca2+overload-induced cardiomyocyte apoptosis via the PI3K/GRK2/PLC-/IP3R signaling pathwayJ.Aging(Albany NY),2021,13(15):19643-19656.2ZHOU R,JIA Y,WANG Y,et al.Elevating miR-378 strengthens the isoflurane-mediated effects on myocardial ischemia-reperfusion injury in mice via suppression of MAPK1J.American Journal of Translational Research,2021,13(4):2350-2364.3 郭蕊,宋慧芳,康毅.醉茄素 A 通过调节自噬缓解心肌细胞缺血/再灌注(缺氧/复氧)损伤 J.中国病理生理杂志,2021,37(8):1361-1366.4 陈乘波,陈天宝,许友榜.川芎嗪通过 JAK2/STAT3 信号通路调节线粒体自噬减轻心肌缺血再灌注损伤的机制研究 J.中国免疫学杂志,2021,37(7):819-823.5CUI Q,YAN L.Tripartite motif-containing protein 16 protects against myocardial ischemia/reperfusion injury by affecting the Keap1/Nrf2 axisJ.Cell and Tissue Research,2021,386(2):349.6 罗燕平,戚微岩,吴小东,等.老鹳草素的研究进展 J.药物生物技术,2016,23(3):279-282.7LI J N,LI Z M,GAO Y,et al.Protective effect and mechanisms of geraniin on D-galactosamine-induced liver injury in miceJ.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2019,25(15):116-121.8ZHANG F,REN Z,GAO Y,et al.Study on the hepatopro-tective effect of geranium on carbon tetrachloride-induced liver injury in mice based on TLR-4/NF-B signaling pathwayJ.Journal of China Medical Materials,2018(41):2906.9SIM M O,JANG J H,LEE H E,et al.Antioxidant effects of Geranium nepalense ethanol extract on H2O2-induced cytotoxicity in H9c2,SH-SY5Y,BEAS-2B,and HEK293J.Food Science&Biotechnology,2017,26(4):1045-1053.10 王笑,张恒,李媛媛,等.肉桂醛预处理对 H9C2 心肌细胞缺氧复氧损伤后自噬的影响 J.中药药理与临床,2021,37(3):30-34.11 刘景诗.冠脉转染 Nrf2 基因对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及机制的研究 D.长沙:中南大学,2010.12 杨柳,苑亚静,吴越.重楼皂苷通过抑制 NF-B 信号通路减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤 J.中华危重病急救医学,2019(6):746-749.13ACHARJEE S,TEO K K,JACOBS A K,et al.Optimal medical therapy with or without percutaneous coronary intervention in women with stable coronary disease:A pre-specified subset analysis of the Clinical Outcomes Utilizing Revascularization and Aggressive druG Evaluation(COURAGE)trialJ.The American Heart Journal,2016(173):108-117.14FRENCH J,BRIEGER D,JUERGENS C,et al.Troponin measurements,myocardial infarction diagnoses and outcomes.An analysis of linked data from New South Wales,AustraliaJ.Internal Medicine Journal,2020,50(5):550-555.15LIU C,CHEN G,CHEN Y,et al.Danlou tablets inhibit atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice by inducing macrophage autophagy:The role of the PI3K-Akt-mTOR pathwayJ.Frontiers in Pharmacology,2021(12):724670.16WAN D F,PAN S S,TONG Y S,et al.Exercise preconditioning promotes autophagy to cooperate for cardioprotection by increasing LC3 lipidation-associated proteinsJ.Frontiers in Physiology,2021(12):599892.17GAO C,WANG R,LI B,et al.TXNIP/Redd1 signaling and excessive autophagy:A novel mechanism of myocardial ischemia/reperfusion injury in miceJ.Cardiovascular Research,2020,116(3):645-657.18XU H D,QIN Z H.Beclin 1,Bcl-2 and autoPhagyJ.Advances in Experimental Medicine and Biology,2019,12(6):109-126.19CHEN M Y,YADAV V K,CHU Y C,et al.Hydroxychloroquine(HCQ)modulates autophagy and oxidative DNA damage stress in hepatocellular carcinoma to overcome sorafenib resistance via TLR9/SOD1/hsa-miR-30a-5p/Beclin-1 axisJ.Cancers,2021,13(13):3227.20CHEN S J,HSEU Y C,GOWRISANKAR Y V,et al.The anti-melanogenic effects of 3-O-ethyl ascorbic acid via Nrf2-mediated-MSH inhibition in UVA-irradiated keratinocytes and autophagy induction in melanocytesJ.Free Radical Biology&Medicine,2021(173):151-169.21BARTOLINI D,DALLAGLIO K,TORQUATO P,et al.Nrf2-p62 autophagy pathway and its response to oxidative stress in hepatocellular carcinomaJ.Translational Research,2018(193):54-71.22LIU H,ZHU S,HAN W,et al.DMEP induces mitochondrial damage regulated by inhibiting Nrf2 and SIRT1/PGC-1 signaling pathways in HepG2 cellsJ.Ecotoxicology and Environmental Safety,2021(221):112449.23 张莉,王露,肖涵,等.抑制 Fyn 可激活 Nrf2 信号通路减轻大鼠脑出血后氧化应激损伤 J.第三军医大学学报,2019,41(21):2035-2042.（责任编辑：张海洋 收稿日期：2022-04-26）