枯草芽孢杆菌J-15次生代谢产物对棉田土壤细菌群落的影响.pdf

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 4 期 2023 年 8 月Vol.18,No.4 Aug.2023 基金项目:新疆维吾尔自治区重点实验室开放课题(2020D0410);国家自然科学基金资助项目(32160074);新疆维吾尔自治区高校科研计划项目(XJEDU2021I023)第一作者:游佳(1998),女,硕士研究生,研究方向为应用生物化学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:#共同通信作者(Co-corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20221118002游佳,赵灏冉,赵晶晶,等.枯草芽孢杆菌 J-15 次生代谢产物对棉田土壤细菌群落的影响J.生态毒理学报,2023,18(4):338-348You J,Zhang H R,Zhao J J,et al.Effects of secondary metabolites ofBacillus subtilisJ-15 on soil bacterial community in cotton fields J.Asian Journalof Ecotoxicology,2023,18(4):338-348(in Chinese)枯草芽孢杆菌 J-15 次生代谢产物对棉田土壤细菌群落的影响游佳1,赵灏冉1,赵晶晶1,张琪2,张经博1,美合日古丽米吉提1,李金玉1,胡嘉莉1,赵和平2,古丽巴哈尔阿巴拜克力1,#,赵惠新1,*1.新疆师范大学生命科学学院新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室,乌鲁木齐 8300542.北京师范大学生命科学学院抗性基因资源与分子发育北京市重点实验室,北京 100875收稿日期:2022-11-18 录用日期:2023-01-13摘要:棉花黄萎病是导致棉花减产的主要土传病害之一,在前期工作中筛选到1 株对棉花黄萎病病原菌 大丽轮枝菌(Ver-ticillium dahliae)具有较强拮抗作用的枯草芽孢杆菌 J-15 菌株。为了揭示施用枯草芽孢杆菌 J-15 次生代谢产物(secondary me-?tabolites ofBacillus subtilisJ-15,SMs)对棉田土壤细菌群落多样性的影响规律。将含有大丽轮枝菌的盆栽分为 2 组,室温黑暗?环境下进行培养,模拟该代谢产物施入土壤的情况,其中实验组为添加 0.33 mg mL-1SMs 至土壤最大含水量,对照组为添加等量的去离子水。分别在0、10、30 和60 d 取样,采用 Soil DNA Kit 试剂盒提取土壤微生物的总 DNA,利用高通量测序技术分析棉田土壤细菌群落结构。根据 Alpha 多样性分析可知,SMs 处理土壤后的 Shannon、Simpson、Chao1 和 Ace 指数与对照组均无显著差异,说明 SMs 对土壤中细菌群落的丰富度和多样性无明显影响。根据群落结构分析可知,SMs 处理土壤 10、30 和60 d 后,变形菌门和硬壁菌门的相对丰度略微上升,但差异均不显著。属水平上,SMs 处理土壤 10 d 和 30 d 后,假单胞菌属和芽孢杆菌属的相对丰度略有上升,但差异均不显著。这说明在土壤中施用 SMs 虽在一定程度上改变了土壤中细菌群落结构但影响却并不显著。由此推断 SMs 对棉田土壤细菌群落结构及多样性无显著影响,为开发利用枯草芽孢杆菌 J-15 进行农业上的生物防治提供了依据。关键词:枯草芽孢杆菌;细菌群落;棉田土壤;高通量测序技术文章编号:1673-5897(2023)4-338-11 中图分类号:X171.5 文献标识码:AEffects of Secondary Metabolites of Bacillus subtilis J-15 on Soil BacterialCommunity in Cotton FieldsYou Jia1,Zhao Haoran1,Zhao Jingjing1,Zhang Qi2,Zhang Jingbo1,Meiheri GuriMighti1,Li Jinyu1,Hu Jiali1,Zhao Heping2,Gulibahar Ababakli1,#,Zhao Huixin1,*1.Xinjiang Special Environmental Species Protection and Regulation Biology Laboratory,School of Life Sciences,Xinjiang Normal U-niversity,Urumqi 830054,China2.Beijing Key Laboratory of Resistance Gene Resources and Molecular Development,School of Life Sciences,Beijing Normal Univer-sity,Beijing 100875,China第 4 期游佳等:枯草芽孢杆菌 J-15 次生代谢产物对棉田土壤细菌群落的影响339 Received 18 November 2022 accepted 13 January 2023Abstract:Cotton verticillium wilt is one of the leading soil-borne diseases that reduce cotton yield.In the previouswork,a strain ofBacillus subtilisJ-15 with a strong antagonistic effect againstVerticillium dahliae,the pathogen ofcotton verticillium wilt,was screened to reveal the effect of the application of secondary metabolites ofBacillussubtilisJ-15(SMs)on the diversity of the bacterial community in cotton field soil.To simulate the application of?this metabolite into the soil,pot plants containingVerticillium dahliaewere divided into two groups and cultured atroom temperature in the dark.0.33 mgmL-1SMs were added to the experimental group to maximize soil watercontent,while the same amount of deionized water was added to the control group.Samples were taken on days 0,10,30,and 60,respectively.The total DNA of soil microorganisms was extracted using the Conway Centurys SoilDNA Kit kit.The bacterial community structure of cotton field soil was analyzed by high-throughput sequencingtechnology.According to the Alpha diversity analysis,the Shannon index,Simpson index,Chao1,and Ace index ofSMs-treated soil were not significantly different from the control group,indicating that SMs had no significant im-pact on the richness and diversity of the bacterial community in soil.According to community structure analysis,the relative abundance of Proteobacteria and Scleroderma increased slightly after 10,30,and 60 d of soil treatmentby SMs.However,the difference is insignificant.At the genus level,the relative abundance ofPseudomonasand?Bacillusincreased slightly after 10 and 30 d of SMs treatment.However,the difference is negligible.The results?demonstrated that although the application of SMs in soil changed the bacterial community structure in the soil to acertain extent,the effect was insignificant.On this basis,it is concluded that SMs have no substantial impact on thestructure and diversity of the soil bacterial community in cotton fields,providing a basis for the development and u-tilization ofBacillus subtilisJ-15 in agricultural biological control.Keywords:Bacillus subtilis;bacterial community;cotton field soil;high throughput sequencing technology 由病原菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliaeKleb)?致使的棉花黄萎病造成了棉花的严重减产甚至绝收,危害了全国棉花生产业的发展,是棉花病虫害中危害最严重的土传病害,被称为“棉花的癌症”1。并且由于我国棉花的种植地域和种植方法的单一,随着耕作时间的延长,使得大丽轮枝菌导致的棉花黄萎病的危害性也在不断加重2-4。目前在棉花的生产中用于防治棉花黄萎病的方法主要有作物轮作法、培养抗性品种法、化学农药法、生物防治以及综合防治法。而随着绿色经济的发展,利用生防菌和生防菌的抑菌代谢产物来进行生物防治的绿色防控技术已逐步成为农业生产中的研究热点5。针对植物土传病害的生物防治主要就是通过筛选出自然界中存在的有益微生物,利用生防菌的菌体本身或其代谢产物的直接作用防治各种植物病原菌6,或者是通过改变土壤中微生物的群落结构以此来防治植物病害7。目前在防治棉花黄萎病上应用较多的生防菌就是芽孢杆菌和假单胞菌等生防菌8-9。例如李芮9的相关专利中,发现假单胞菌 841P-3 对棉花黄萎病有着极其显著且绿色安全的防治效果;胡彦婷10通过基因组测序,发现枯草芽孢杆菌 BSD-2 能够分泌如脂肽、Tas A 及溶素等多种抑菌代谢产物,以此来高效抑制棉花黄萎病病原菌的生长。随着各类生防菌剂的逐渐成熟,许多生防菌剂都在逐渐应用到农田和温室大棚中。但是并非所有天然来源的生防菌剂都是安全无害的,仍有部分的生防菌剂是存在一定毒性的,因此需要进行生防菌剂的安全性评价。同时虽然目前发现的大部分生防菌剂都来源于田间土壤或者植物本身,但是在施用生防菌剂进行防治的过程中以人为的形式将大量外源的生防菌剂施入到田间土壤,很有可能会不同程度影响到土壤原有的微生物群落结构和生态功能,并对土壤稳定的微生态系统产生一定影响11。而土壤微生物中细菌作为含量最多、作用强度和影响最大的微生物,在土壤中起着十分重要的作用12。在土壤环境发生变化的同时,细菌群落结构的多样性及丰富度就会受到影响,而土壤中细菌群落结构的多样性及丰富度与植物真菌病害的发生关系密切12。尹丹韩等13研究发现施入生防菌哈茨木霉T4 的发酵液后会对黄瓜根际周围的土壤细菌群落340 生态毒理学报第 18 卷产生显著影响,并持续一段时间。李全胜等14研究发现施用水分散粒剂 H14 可以提高棉花棉田土壤细菌群落的物种丰富度和多样性,增加有益菌属的相对丰度,有利于棉花的健康生长。因此在应用生防菌剂前必须对生防菌剂对土壤中细菌微生态的潜在影响展开相应研究。目前,筛选并分离能够拮抗棉花黄萎病病原菌的菌株和抑菌物质的研究较多,但对患病的棉花棉田土壤施用生防菌次生代谢产物后,通过观察土壤中细菌群落结构变化,来揭示抑菌物质安全性的研究还较为少见。枯草芽孢杆菌 J-15 是由本实验室筛选获得的 1 株可以高效拮抗棉花黄萎病病原菌的生防细菌15,后期通过对其发酵液的分离纯化,制备出了其次生代谢产物。利用其代谢产物能高效拮抗棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌,吴梦君等16的实验证实该菌株在实验室盆栽条件下对棉花黄萎病有着良好的生防作用,可以作为棉花黄萎病生物防治的抑菌物质。而枯草芽孢杆菌 J-15 虽然具有良好的生物防治潜能,但是其次生代谢产物却又可能具有一定的细胞毒活性,并对土壤微生物产生危害。因此本研究以不施菌剂的清水组作为对照组,以施用枯草芽孢杆菌 J-15 次生代谢产物(secondary metabo-lites ofBacillus subtilisJ-15,SMs)粗提液作为处理?组,采用 Illumina HiSeq 测序平台,分析 SMs 粗提液对土壤中细菌群落的影响,以期作为评价该次生代谢产物对土壤微生物安全性的一条依据,为利用SMs 进行棉花黄萎病的生物防治提供理论指导和依据。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 菌株及主要试剂枯草芽孢杆菌 J-1515由本实验室从患病棉花棉田土壤筛选得出并保存,其次生代谢产物提取自本实验室自主筛选得出的枯草芽孢杆菌 J-15。土壤微生物 DNA 提取试剂盒为康维世纪的Soil DNA Kit 试剂盒。1.2 J-15 次生代谢产物粗提液的制备采用平板划线法分离纯化出枯草芽孢杆菌 J-15的单菌落,挑取其单菌落接种于 20 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中,培养至对数生长期,制备其种子液。将种子液以 1%接种量转接于牛肉膏蛋白胨液体培养基中,培养 18 h,得到其发酵液。以 4、12 000 r min-1条件,离心30 min 后,弃去菌体沉淀,取上清。将 J-15 上清液用浓盐酸将其 pH 值调节至1.5,置于 4 冰箱过夜。再以 4、12 000 rmin-1的条件,离心 30 min 后,弃上清,取沉淀,并将沉淀溶解在一定量的无菌水中,调节 pH 值至 7,所得溶液用 4 倍体积的冰浴丙酮抽提 3 h,离心除去沉淀,取上清,旋转蒸发。所得溶液氯仿萃取 3 h 后取上层水相,旋转蒸发残余氯仿,最后通过 0.22 m 无菌滤膜过滤获得 SMs 粗提液,并冷冻干燥。以无菌水为溶剂,配制 0.33 mg mL-1SMs 溶液备用17。1.3 土壤样品的采集从新疆玛纳斯实验棉田采样。采样方法选用随机取样法,随机挑选 5 个点采样,采集 0 20 cm 厚度的土层,采样时需避开棉花根际,采样后将样品充分混合,存于密封袋中带至实验室。使用 2 mm 的土壤筛除杂质。1.4 土壤样品的处理试验分别设置两个大组。处理组(SMs):添加100 mL 0.33 mgmL-1SMs 粗提液至土壤,达到其最大含水量;对照组(CK):添加等量的灭菌后的去离子水。土样均为 100 g,置于室温黑暗培养,以此模拟 SMs 溶液在大田中的试验情况。实验培养的过程中采取称重法定期测量土壤中的含水量,保持 2个组中的土壤含水量相同,分别在 10、30 和 60 d时,采用三点垂直取样法取样,并将取样土壤充分混合备用。处理组分别命名为 SMs-0、SMs-10、SMs-30和 SMs-60,每组均设 3 次重复;对照组分别命名为CK-0、CK-10、CK-30 和 CK-60,每组均设3 次重复。1.5 土壤微生物 DNA 的提取利用康维世纪的 Soil DNA Kit 试剂盒,参照其说明书提取土壤 DNA。土壤样品的 DNA 提取完成后,以电压 100 V、时间 40 min 的条件,采用 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。1.6 16S rDNA 基因的 PCR 扩增以提取的土壤 DNA 为 PCR 模板,扩增细菌的16S rDNA 区 域,引 物(338F:5-ACTCCTACGG-GAGGCAGCA-3,806R:5-GGACTACHVGGGT-WTCTAAT-3)18。PCR 的扩增程序:98 预变性 2min;98 变性 30 s,50 复性 30 s,72 延伸 5min,共计 30 个循环19。在检测过 8 组土壤样品的PCR 产物后,送至北京百迈克公司进行高通量测序。1.7 数据处理与分析利用 Illumina HiSeq 的高通量测序平台,通过PCR 扩增产物构建出测序文库并质检,对质检合格的测序文库进行高通量测序。将高通量测序得到的第 4 期游佳等:枯草芽孢杆菌 J-15 次生代谢产物对棉田土壤细菌群落的影响341 原始数据转化为原始的测序序列。对测序获得的原始测序序列进行预处理,首先使用 Trimmomaticv0.33 软件,对原始测序序列中的 Raw Reads 进行过滤;然后使用 cutadapt 1.9.1 软件去除引物序列,得到高质量 Reads;然后使用 FLASH v1.2.7 软件,拼接土壤样品中高质量的 Reads,得到优化序列,最后使用UCHIME v4.2 软件,去除优化序列中的嵌合体。利用北京百迈克公司提供的百迈克云平台对最终有效的测序数据进行 OTU 聚类、物种注释、丰度分析,以此来揭示对照组和实验组中物种的组成,再进一步通过 Alpha 多样性分析(Alpha diversity)、Beta多样性分析(Beta diversity)和群落结构分析20等,分析对照组和处理组样品之间的差异。利用 SPSS软件和 Sigma Plot 12.0 软件进行数据分析和图片制作。2 结果(Results)2.1 土壤细菌测序信息根据高通量测序土壤样品共测得 1 680 362 对Reads,其中经过质检筛选、拼接过滤以及去除引物序列后共产生1 436 797 条优化序列,优化序列去除嵌合体后的最终有效序列数为1 412 445 条,其中单个样品获得的优化序列数至少为 667 44,平均产生68 419 条优化序列。如表 1 所示,所有的土壤样品有效率均在 83%以上。有效序列的平均长度分布在 418 420 bq 之间,且在 419 bq 分布最多。测序质量值 Q20 皆96%,Q30 皆94%,表明测序质量较高,测序数据准确。2.2 OTU 聚类分析结果8 组土壤样品覆盖率均99.8%(表 2),说明本次测序可以较为全面地反映出土壤细菌群落多样性和丰富度。在序列相似度为 97%的水平上划分出分类单元(OTUs),共获得 1 670 个 OTUs。全部 OTUs共划分为 27 个门,85 个纲,129 个目,232 个科,422个属,330 个种。韦恩图(Venn)(图 1)直观地表示了对照组(CK)和处理组(SMs)之间土壤细菌群落的OTUs 数目以及 2 组之间的相似性和特异性。CK和 SMs 的土壤样本分别检测到 1 657 和 1 641 个OTUs,其中共有的 OTUs 数目为 1 628 个,共有的OTUs 在 CK 中占 98.25%,在 SMs 中占 99.21%,说明 CK 和 SMs 中优势菌门相似。但是 CK 特有OTUs 个数(29 个)多于 SMs(13 个),说明加入 SMs会使细菌群落差异减小。图 1 土壤细菌群落的韦恩图注:CK 表示对照组(添加等量的灭菌去离子水);SMs 表示处理组(添加 100 mL 0.33 mg mL-1枯草芽孢杆菌 J-15 次生代谢产物粗提液至土壤,达到其最大含水量)。Fig.1 Venn diagrams of soil bacterial communityNote:CK refers to the control group(add the same amount of sterilizeddeionized water);SMs represents the treatment group(add 100 mL0.33 mg mL-1crude extract of secondary metabolites ofBacillussubtilisJ-15 to the soil to reach its maximum water content).表 1 样本序列数统计Table 1 Sample sequence statistics样品Sample优化序列Clean tags有效序列Effective tags平均序列长度/bpAverage length/bpQ20/%Q30/%Effective/%CK-068 795.5300.5266 988.585.56420097.090.0694.50.183.70.2SMs-069 148.5799.7467 230255.97420097.170.0594.630.0884.090.35CK-1069 356.67634.6668 236556.87419.330.5897.080.0794.490.1185.170.69SMs-1069 473.33936.0668 040.671 334.59419197.120.0694.540.1184.861.64CK-3067 532829.7566 696844.6419.330.5896.910.0994.180.1583.481.12SMs-3067 423.3339.766 880.33112.43419.330.5896.910.0294.170.0383.590.24CK-6067 600.67610.0565 917.332 824.27419096.970.0594.250.0582.483.63SMs-6068 444.67844.6567 915.33808.96419096.970.0494.280.0684.90.67342 生态毒理学报第 18 卷2.3 细菌 Alpha 多样性分析通过比较 Chao1、Ace、Shannon、Simpson 等多种Alpha 多样性指数,反映了对照组和处理组共 8 组土壤样品的物种丰富度及物种多样性。Chao1 指数反映的是样品中所含 OTUs 数目,其指数越大说明样品中所含物种越多。Ace 指数反映的是样本中物种组成的丰富度和均匀度,其指数越大表示该环境的物种越丰富,各物种分配越均匀21。而 Shannon指数则是用来估算样品中微生物的多样性指数之一,Shannon 值越大,说明群落多样性越高。Simpson 指数反映的则是优势种在群落中的地位和作用,若一个群落中优势种占的多,其他非优势物种所占的比例则会减少,所以 Simpson 指数值较大,则说明群落多样性较低,该指数与其他多样性指数均呈负相关,即 Shannon 指数越大时,Simpson 指数就会越小22。如表2 所示,8 组土壤样品中 Chao1指数和 Ace 指数都较大,说明 8 组样品中的细菌群落皆有较高的丰富度。且 8 组土壤样品的 Shannon指数都较大,Simpson 指数都较小,说明 8 组样品中细菌群落皆有着较高的多样性。但比较对照组和处理组的 Alpha 多样性指数,发现 SMs 处理土壤不同时间后 Shannon、Simpson、Chao1 和 Ace 指数均与对照组无显著差异,说明 SMs 对土壤中细菌群落的丰富度和多样性无显著影响,即 SMs 的施用没有显著改变土壤细菌的丰富度和多样性。2.4 细菌 Beta 多样性分析Beta 多样性分析比较的是不同生态系统之间多样性,也就是样品间的差异,是通过利用各样本之间优化序列间的序列距离来计算样本间距离,以此反映样本间是否具有显著的群落差异23。根据 PCA主成分分析结果(图 2)可看出,主成分 1(PC1)和主成分2(PC2)分别占比 47.81%和 22.88%,0 d 与其他时间阶段相比,两者在坐标轴上的距离较远,说明 0 d与其他时间段的细菌群落结构差异较大;除此之外SMs 处理土壤不同时间后的处理组与其对照组在坐标轴上距离都比较接近,说明 SMs 处理土壤不同时间后的处理组与其对照组的细菌群落结构相似性都较高,即施用 SMs 没有显著改变土壤细菌的群落结构。同时利用置换多元方差分析,根据样本间的 Bi-nary Jaccard 距离,分析了对照组与 SMs 处理组的组间组内差异解释度,并使用置换检验进行显著性统计。根据置换多元方差分析的分析结果(图 3)可知,对照组与 SMs 处理组之间没有显著性差异,说明加入 SMs 并不会显著改变土壤细菌的群落结构。除此之外,处理组的组内差异小于对照组的组内差异,说明了加入 SMs 可以使细菌群落差异减小,与OTUs 聚类分析的结果相同。图 2 SMs 处理土壤不同时间细菌的主坐标分析结果Fig.2 Principal coordinate analysis of bacteria in soiltreated with SMs at different time表 2 SMs 处理土壤样品不同时间的细菌丰富度和多样性指数Table 2 Bacterial richness and diversity index of soil samples treated with SMs at different time样品Sample覆盖率/%Coverage/%OTU 数目OTU numberACE 指数ACE indexChao1 指数Chao1 indexSimpson 指数Simpson indexShannon 指数Shannon indexCK-00.99820.00011 31621 358.765.181 372.45.480.0130.00065.510.03SMs-00.99820.00011 28038.51 325.2242.251 334.7958.680.01460.0035.390.14CK-100.99810.00051 35292.681 398.82106.351 420.3685.870.00960.00215.760.12SMs-100.99860.00011 34252.841 375.1256.291 388.3261.240.01050.00175.710.11CK-300.99850.00021 36937.291 403.8540.941 415.0436.860.00740.00085.940.05SMs-300.99770.00151 3401351 417.2675.721 413.4293.240.01990.02235.550.74CK-600.99880.00031 34966.711 373.7273.521 383.8774.80.00510.00026.10.04SMs-600.9980.00141 333101 320.0266.421 182.97329.440.01170.01225.620.92第 4 期游佳等:枯草芽孢杆菌 J-15 次生代谢产物对棉田土壤细菌群落的影响343 图 3 SMs 处理土壤样品的置换多元方差分析结果Fig.3 Replacement multiple variance analysis resultsof soil samples treated by SMs2.5 SMs 处理土壤不同时间对细菌群落结构的影响2.5.1 门水平的群落结构分析应用统计学方法对土壤样品中的细菌进行门水平上的群落结构分析,如图 4 所示,8 组土壤样品中排名前十的土壤细菌群落的主要门皆是变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Ac-tinobacteria)、硬 壁 菌 门(Firmicutes)、芽 单 胞 菌 门(Gemmatimonadetes)、疣 微 菌 门(Verrucomicrobia)。其中在 8 组土壤样品中变形菌门的相对丰度均占有绝对优势,平均相对丰度为 46.60%。除此之外,酸杆菌门和拟杆菌门在 8 组土壤样品中的平均相对丰度也皆10%,平均相对丰度分别为 13.83%和12.76%。SMs 处理土壤 10、30 和 60d 后,变形菌门和硬壁菌门的相对丰度相较于对照组皆有上升趋势,拟杆菌门、绿弯菌门和放线菌门相较于对照组则有下降趋势,但差异均不显著。其余主要门的相对丰度有所变化却影响不大。说明 SMs 处理土壤后对土壤中的细菌群落结构有一定影响但不显著。2.5.2 属水平的群落结构分析应用统计学方法对土壤样品中的细菌属水平上的群落结构分析,如图 5 所示,8 组土壤样品中排名前十的土壤细菌群落的主要属皆为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、溶杆菌属(Lysobacter)、芽单胞菌科?(uncultured bacterium_f_Gemmatimonadaceae)、蒂莫内马赛菌属(Masilia)、噬几丁质菌科(uncultured bac-?terium f_Chitinophagaceae)、uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、砂单胞菌属(Arenimonas)、假单胞菌属?(Pseudomonas)、RB41、芽孢杆菌属(Bacillus)。其中?鞘氨醇单胞菌属的相对丰度在 8 组土壤细菌样品中均占有绝对优势,平均相对丰度为 10.94%。除此之外 SMs 处理土壤 10 d 和 30 d 后,黏球菌属、蒂莫内马赛菌属和噬几丁质菌科的相对丰度相较于对照组略有下降,而假单胞菌属和芽孢杆菌属的相对丰度相较于对照组则有所上升,但差异均不显著。其余主要属的相对丰度有所变化,但变化幅度不大。再次说明了 SMs 处理土壤后对土壤中的细菌群落结构有一定影响但不显著。与门水平上的细菌群落分析结果趋于一致。由图 5 可知,鉴定出的结果中排名前十且相对丰度(1%)的属中有未鉴定出的属,也占有一定的比例,它们分别为芽单胞菌科中的一属、噬几丁质菌科中的一属以及细菌中的一属,这表明土壤样品中可能存在一部分细菌的新类群。2.6 SMs 处理土壤不同时间细菌聚类分析选取丰度排名前二十的属按照上述 8 组样品的分组情况进行各样品间细菌物种丰度相似性的聚类分析,生成聚类热图,直观反映了 SMs 处理土壤不同时间后细菌在属水平上群落组成的相似性和差异性。横坐标代表 8 组土壤样品,纵坐标表示相对丰度排名前二十的属,聚类分析结果见图 6,通过纵向比较可以看出 0 d 与其他时间阶段相比,0 d 时取样的样品优势属较多,物种之间的相对丰度差异较大,其他时间阶段取样的样品优势属较少,物种之间的相对丰度差异较小。通过横向比较可以看出各个时间段样品的优势属各不相同;相同时间段的处理组与对照组,样品优势属的差异性也不大,即 SMs 处理土壤对细菌群落的多样性和复杂度影响不大。3 讨论(Discussion)在施用生防微生物及其代谢产物防治各种植物病害前,通过研究生防微生物及其代谢产物对土著微生物群落的影响,进行初步安全性评价已成为国际共识24。土壤是微生物可以健康生长的繁殖场所,因为土壤中含有可以让微生物生长繁殖所需要的一切物质条件,因此有着“微生物的天然培养基”之称25。而土壤中的微生物主要有细菌、真菌、放线菌、藻类和原生动物。它们皆与土壤肥力密切相关,在自然界的物质循环中起着重要作用26。土壤越肥沃,微生物种类和数量越多,而土壤中的细菌占土壤344 生态毒理学报第 18 卷图 4 SMs 处理土壤不同时间细菌物种分布图(门)Fig.4 Distribution of bacterial species in soil treated with SMs at different times(phylum)图 5 SMs 处理土壤不同时间细菌物种分布图(属)Fig.5 Distribution of bacterial species in soil treated with SMs at different times(genus)第 4 期游佳等:枯草芽孢杆菌 J-15 次生代谢产物对棉田土壤细菌群落的影响345 图 6 SMs 处理土壤不同时间细菌属水平聚类分析热图Fig.6 Heatmap of cluster analysis of bacterial genus in soil treated with SMs at different times微生物总量最多,在土壤微生物中占据着主要地位,其细菌群落的多样性和丰富度则反映了土壤的活性27-28。利用两者可有效分析 SMs 对土壤细菌群落影响,以此评估 SMs 的安全性。通过对 SMs 处理过的土壤样品中的细菌 16SrDNA(V3+V4)区域测序分析,根据 OTUs 聚类分析结果、Alpha 多样性和 Beta 多样性分析结果,可知SMs 对土壤中细菌群落的丰富度和多样性均无显著影响。本研究结果与刘雪娇等29发现施用贝莱斯芽胞杆菌3A3-15 时,对土壤细菌整体的丰富度和多样性没有显著差异的研究结果基本一致。比较不同时间段下 SMs 处理土壤细菌主要门相对丰度可知,8 组土壤细菌样品中相对丰度较高的前 3 个门是变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes),且变形菌门的相对丰度在 8 组土壤样品中均占有绝对优势。在SMs 处理土壤 10、30 和 60 d 后,变形菌门和硬壁菌门的相对丰度略有提高,而拟杆菌门、绿弯菌门和放线菌门的相对丰度略有下降,但差异均不显著,其余主要门的相对丰度变化则不大。变形菌门属于土壤中的益生菌,可以参与土壤中的物质循环,甚至可以降解土壤中的化学污染30。在 SMs 处理土壤后,其相对丰度的略微上升。这说明 SMs 处理土壤后对土壤中的细菌群落结构有一定影响但不显著。由土壤样品中的细菌属分类水平上的群落结构分析可知,鞘氨醇单胞菌属的相对丰度在所有土壤细菌样品中皆占有绝对优势。而研究发现,具有高代谢能力的鞘氨醇单胞菌属,可以通过降解芳香化合物,来保护环境31。除此之外绝大多数的假单胞菌属和芽孢杆菌均属于植物根际促生菌,对植物根际吸收土壤元素起着重要作用32-33。本研究在 8 组土壤样品中均检测到了假单胞菌属和芽孢杆菌属,且相对丰度均1%。同时 SMs 处理土壤 10 d 和30 d 后,假单胞菌属和芽孢杆菌属相对丰度均有所上升,但差异均不显著。其余主要属的相对丰度有所变化,但变化幅度不大。说明 SMs 并没有显著影346 生态毒理学报第 18 卷响到农业生产的土壤细菌群落结构,为后期开发利用枯草芽孢杆菌 J-15 进行农业上生物防治提供了依据。本研究通过高通量测序技术检测了 SMs 对土壤细菌群落的影响,结果说明