口腔溃疡动物模型造模方法及临床吻合度分析.pdf

2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 口腔溃疡动物模型造模方法及临床吻合度分析祝红，黄胜楠，苗明三（河南中医药大学中医药科学院 郑州 450046）摘要：本研究通过文献梳理和基于中西医临床病症特点赋值法对目前临床现有口腔溃疡动物模型进行评价分析，结果发现，与疾病西医吻合度较高的造模方法有化学烧灼法和免疫诱导法，中西医吻合度均较高的为免疫化学联用法和病证结合法。从口腔溃疡疾病发病机制、致病因素和模型复制的可操作性、便捷性、经济性和临床吻合度等多方面分析，免疫化学联合法为复制口腔溃疡疾病较为理想的选择，病证结合模型的最佳选择为相应的证候造模+免疫化学联用法。但可以发现口腔溃疡病证结合模型在临床中应用较少，且造模方法中缺少中医致病因素，模型成效判定所观测的指标也需进一步完善，建议后续口腔溃疡动物模型的构建应从增添如燥、火等致病外因和情志、体质等致病内因为主，成效评判标准也应从增添表观指标如动物精神、行为、疼痛等方面出发，在全方位采集模型动物宏观信息的基础上，运用正面评价为主联合逆向反证为辅的“以方测证”法复制出与临床中西医病症特点吻合度都高的口腔溃疡动物模型。关键词：复发性口腔溃疡 口疮 动物模型 病证结合 诊断标准doi:10.11842/wst.20220303003 中图分类号:R781.5 文献标识码:A口腔溃疡（Oral ulcer，OU）是一种具有高复发性、周期性和自愈性的常见口腔黏膜炎症性溃疡性疾病，以疼痛反复发作、久治难愈为主要临床特征，又称为复发性口腔溃疡（Recurrent oral ulcer，ROU）和口疮1-2。目前临床上已建立了多种口腔溃疡动物模型用于实验研究，以求探究口腔溃疡发病机理以及评价药物疗效，但多以病理性模型为主，很少有模型能完全复制疾病的自然进程。本研究在总结归纳口腔溃疡疾病中西医诊断标准的基础上，对中西医各项诊断要点进行赋值，分析目前临床常用口腔溃疡动物模型与该疾病中西医临床病症特点的吻合度，以此量化其模型复制程度，为临床口腔溃疡动物模型的选择提供较为准确直观的参考。1 口腔溃疡的中西医病因病机 1.1中医病因病机口腔溃疡属于现代医学病名，为口腔粘膜病中最常见的疾病，祖国医学将其称为“口糜”、“口疡”、“口疮”等3。素问 气交变大论篇 曰：“岁金不及，炎火乃行，民病口疮”，临床以疼痛反复发作，久治难愈为主要特征4。中医认为“脾胃伏火、口疮乃发”、“虚火上乘，发为口疮”，指出脾胃伏火、心火上炎、脾胃湿热、阴虚火旺为其主要病机，常见病因多为饮食失节、劳倦失宜、情志失调及外感六淫5。1.2西医病因病机现代研究认为，口腔溃疡是上皮的完整性发生破坏而引起的组织缺损，其病因目前尚不完全明确。有学者提出在遗传背景下，天气、生活、工作等环境因素、情志、心理等精神因素、包括饮食不当所造成的微量元素或维生素缺乏等刺激，均可导致机体免疫功能异常，引发口腔溃疡6-7。同时，临床经验总结和流行病学调查发现，该疾病的发生也与系统性疾病因素密切相关，如消化道疾病（包括胃溃疡、十二指肠溃疡、收稿日期：2022-03-03 修回日期：2022-08-02 国家中医药管理局标准化项目（GZY-FJS-2020-219）：中药外治共性技术规范研究，负责人：苗明三；河南省卫生健康委员会重大专项课题（20-21ZYZD02）：中药外治机制及临床外用技术规范研究，负责人：苗明三。通讯作者：苗明三，教授，博士，主要研究方向：中药药理学。1750 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究溃疡性结肠炎、局限性肠炎、肝胆疾病及寄生虫感染等）和内分泌紊乱（如月经紊乱）8。目前国内外尚无有效根治口腔溃疡的方法，西医一般以局部对症治疗为主如调节免疫、补充微量元素和维生素、促进溃疡创面修复等。2 口腔溃疡的中西医诊断标准及临床特点 2.1西医诊断标准参考 口腔黏膜病学9和 中西医结合口腔科学10拟定口腔溃疡西医诊断标准，见表1。根据课题组11前期提出的赋值方法对口腔溃疡各项指标进行赋值，临床表现为口腔溃疡最直接的临床诊断依据，为核心指标，符合、中任何一项赋值20%，共60%；病理指标能客观反映口腔溃疡的病变特点，为直接相关指标，符合、中任何一项赋值10%，共30%；实验室指标多特征性不强，临床诊断具有局限性，为间接相关指标，符合、中任何一项赋值2.5%，共10%。总分100%。2.2中医辨证分型及临床表现参考 口疮中医临床实践指南（2018）12和 中药新药临床研究指导原则13将口腔溃疡分为5型：心脾积热证、胃火炽盛证、阴虚火旺证、脾虚阴火证和脾肾阳虚证，具体分型见表2。进一步归纳总结口腔溃疡的主次症，并根据课题组11前期提出的赋值方法对其进行赋值，主症包括口腔黏膜溃疡红肿；口腔黏膜局部灼热疼痛，符合其中 1项赋值 30%；次症包括口热口干；心烦急躁；尿黄便干，符合一项赋值13.3%。总分100%。3 临床常见口腔溃疡动物模型分析 3.1材料与方法以“口腔溃疡+动物模型”，“口疮+动物模型”和“Oral ulcers+Animal model”为主题，检索CNKI、万方、维普、PubMed、Web of Science 等数据库 2000 年 1 月-2022年3月以来的所有实验性期刊文献，共纳入符合标准的相关文献149篇。3.2造模方法及临床吻合度分析口腔溃疡动物模型主要以化学烧灼法、免疫诱导法、机械创伤法等单因素法与免疫化学联合法等多因素造模方法为主，常选择家兔、大鼠、小鼠、豚鼠、金黄地鼠等为造模对象，一般选用雌雄各半的成年动物。根据2.1，2.2诊断要点赋分情况计算、量化常见口腔溃疡动物模型与中、西医诊断标准的吻合度，具体造模方法、实验动物、模型特征和临床吻合度见表3。表1口腔溃疡西医诊断标准诊断手段临床表现组织病理学检查实验室检查诊断指标口腔内任何部位，尤好发于上下唇内侧、两颊黏膜、口底及前庭沟等角化较差的区域；溃疡中央凹陷，边缘隆起并覆以黄白色伪膜，周围绕有红晕；疼痛明显（自发痛，冷、热、酸、辣触动刺激痛）黏膜上皮破溃、脱落，呈局限性坏死和水肿变性，表面被覆纤维素样渗出；结缔组织内大量淋巴细胞、浆细胞等炎性细胞浸润；毛细血管扩张，内皮细胞肿胀免疫功能检查；血液流变学测定；微量元素测定；内分泌测定表2口腔溃疡中医辨证分型及临床表现证型心脾积热胃火炽盛阴虚火旺脾虚阴火脾肾阳虚14主症溃疡局部灼热疼痛溃疡周围充血发红；口中灼热疼痛；牙龈红肿出血溃疡表浅，周围微红，易反复发作；隐痛或热痛溃疡多为灰白色，周边水肿，红晕色淡；隐隐作痛溃疡色白或暗，红肿不著，反复发作；隐痛次症口干渴；心烦失眠，焦虑不安；便干尿赤口臭口干，渴思凉饮；大便干结，小便黄赤口渴不欲多饮；手足心热；心悸失眠；盗汗；便干尿赤纳呆乏力；腹胀；大便偏稀倦怠乏力；形寒肢冷；食少便溏；下利清谷舌脉（参考）舌尖偏红，苔黄，脉数舌质红，舌苔黄而干，脉滑或数舌质红，少苔，脉细数舌质淡或淡红，苔薄白，脉沉细弱舌质淡，舌苔白滑或腻，脉沉迟治法（参考）清 心 泻 脾，导热下行清 胃 降 火，通腑泻热滋 阴 降 火，引火归元温 补 脾 胃，升阳散火甘 温 扶 阳，祛瘀利湿主要方剂及出处导赤散合泻黄散加减（宋代钱乙 小儿药证直诀）清胃散加减（金元李东垣 脾胃论）知柏地黄丸加减（清代吴谦 医宗金鉴）补中益气汤（金元李东垣 脾胃论）附子理中汤加减（南宋陈无择 三因极一病证方论）1751 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 表3口腔溃疡动物模型与临床诊断标准吻合度机械损伤法化学烧灼法免疫诱导法氧自由基损伤法细菌感染法镊子或手术器械划伤舌背/一侧或双侧颊黏膜15-165 mm金属棒加热后烧灼一侧或双侧颊黏膜17-180.3 cm NaOH晶体烧灼一侧或双侧颊黏膜/下唇靠口角黏膜处19-2090%或95%苯酚溶液浸渍一侧或双侧颊粘膜21-2350%醋酸24-25/40%冰醋酸浸渍一侧或双侧颊粘膜26-27免疫抗原乳化剂制备28-29：动物口腔黏膜组织匀浆与完全弗氏佐剂1：1振荡混匀免疫抗原乳化剂注射：动物口腔黏膜脊柱两侧选取两点皮内注射，每点0.1mL5 mmol/L甲基紫精（PQ）溶液扇形散点注射于动物颊囊黏膜固有层30-31白色葡萄球菌液（10 108 CFUmL-1）0.07 mL注射于动物唇黏膜形成脓疱32-33雄性Wistar大鼠金黄地鼠，雌雄各半/SD 大鼠，雌雄各半SD大鼠，雌雄各半雄性 SD 大鼠/SD 大鼠，雌雄各半/雄性新西兰兔雄性 Wistar 大鼠/雄性 SD 大鼠/新西兰兔，雌雄各半SD大鼠，雌雄各半/雄性新西兰家兔雄性金黄地鼠/SD 大鼠，雌雄各半雄 性 Wistar 大 鼠/日 本 大 耳 白兔，雌雄各半优点：方法操作简单，可用于观察机械创伤下溃疡的发生发展、治疗及愈合。缺点：应用具有局限性，仅用于创伤性溃疡的研究。优点：溃疡的大小面积易控制，适用于单纯创伤性溃疡治疗方法的初步筛选。缺点：机械造模的力量大小不易控制，易导致病损程度不同，同时刺激时间不同也会导致病损各有特点。优点：此法为研究口腔溃疡常用动物模型之一。动物成模率高，操作简便易行。缺点：化学药物多具有腐蚀性，安全性较低，操作不慎易导致药物外溢，造成动物口腔黏膜大面积溃疡。优点：建立的模型与人类ROU的发病机制相似，适用于研究ROU发生、发展的机制。缺点：制备过程复杂、耗时长，建模成功率不高，溃疡个数与出现的部位不易掌控。缺点：动物全身毒性反应较重，对室内温度要求较高（控制在20-22）。优点：方法简单，适用于研究氧自由基在口腔溃疡疾病中的发病机制。缺点：易引发合并感染，注入细菌的量需严格控制，同时由于动物存在个体差异，样本量需求大，不适用于口腔溃疡治疗方法的研究。优点：溃疡病变明显，形成部位固定，便于测量溃疡面积。符合西医诊断标准：；吻合度：70%符合中医诊断标准：主症吻合度：30%符合西医诊断标准：；吻合度：72.5%符合中医诊标标准：主症；次症吻合度：43.3%符合西医诊断标准：；吻合度：92.5%符合中医诊断标准：主症吻合度：60%符合西医诊断标准：；吻合度：92.5%符合中医诊断标准：主症吻合度：60%符合西医诊断标准：；吻合度：72.5%符合中医诊断标准：主症吻合度：30%符合西医诊断标准：；吻合度：85%符合中医诊断标准：主症吻合度：60%符合西医诊断标准：；吻合度：62.5%符合中医诊断标准：主症次症吻合度：43.3%符合西医诊断标准：；吻合度：60%符合中医诊断标准：主症吻合度：30%模型分类造模方法实验动物模型特征吻合度下转续表1752 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究放射法化疗法免疫化学联合法40病证结合法正电压 x 射线照射动物头部（中耳冠状平面直到锥体下方的鼻尖区域，其余身体在辐射场之外），辐照后小鼠放置加热垫上恢复34-36动物口腔黏膜内局部注射相应浓度的化疗药物如5 mgL-1顺铂1.25 mgkg-1、6 mgL-1L紫杉醇1.5 mgkg-1等37动物腹腔注射50 mgmL-1浓度的5-氟尿嘧啶60 mgkg-138-39免疫法：脊柱两侧选取两点皮内注射免疫抗原乳化剂（口腔黏膜组织匀浆与完全弗氏佐剂1：1），每点0.1 mL化学法：50%浓度冰醋酸浸渍动物下唇黏膜阴虚火旺型口腔溃疡41-42：采用黏膜皮下注射三碘甲状腺原氨酸或灌胃干姜附子肉桂水煎液构建阴虚火旺证；化学烧灼法如氢氧化钠晶体灼烧诱导口腔溃疡模型胃火炽盛型口腔溃疡43：党参黄芪水煎液灌胃构建胃火炽盛证；化学烧灼法如如氢氧化钠晶体灼烧颊黏膜诱导口腔溃疡模型脾胃湿寒型口腔溃疡44：采用大量破气耗气的寒凉药物如大承气汤灌胃构建脾胃阳虚证候；化学烧灼法如石炭酸浸渍颊黏膜诱导口腔溃疡模型雄性BALB/c小鼠/雄性Wistar大鼠/CH3小鼠雄性SD大鼠雄性Wistar大鼠/雄性金黄地鼠雄性SD大鼠雄性SD大鼠雌性Wistar大鼠雄性KM小鼠优点：适用于放射性溃疡的研究，操作简单易行。缺点：头颈部肿瘤患者为放射性溃疡好发人群，模型应用具有局限性。优点：操作简单，溃疡形成稳定，可重复性强，建立的化疗后口腔溃疡动物模型与临床接近，具有一定代表性。缺点：溃疡的形成部位和发生时间无法准确确定，同时药物种类、给药剂量及途径等尚且未有统一标准。优点：动物模型表现稳定，发病机制类似人类复发性口腔溃疡，可作为研究的理想实验模型。缺点：耗时长，操作复杂，不利于大样本实验。优点：模型同时具备中医证候特征和西医疾病特征，内外病因兼备，更接近疾病原型。缺点：造模周期较长，过程干扰因素偏多，若长期不加控制的干预，可能会偏离目标模型45。符合西医诊断标准：；吻合度：62.5%符合中医诊断标准：主症吻合度：30%符合西医诊断标准：；吻合度：52.5%符合中医诊断标准：主症吻合度：30%符合西医诊断标准：；吻合度：62.5%符合中医诊断标准：主症吻合度：30%符合西医诊断标准：；吻合度：82.5%符合中医诊断标准：主症；次症吻合度：86.6%符合西医诊断标准：；吻合度：72.5%符合中医诊断标准：主症；次症吻合度：70%符合西医诊断标准：；吻合度：82.5%符合中医诊断标准：主症；次症吻合度：86.6%符合西医诊断标准：吻合度：60%符合中医诊断标准：主症吻合度：60%续表模型分类造模方法实验动物模型特征吻合度4 讨论与展望 口腔溃疡是指唇、舌、颊、上颚等处黏膜发生单个或多个淡黄色或灰白色溃烂点，以黄、红、凹、痛为主要特征的口腔疾病46。虽然为良性自限性疾病，但恢复较慢、复发率高，因发作时疼痛剧烈而严重影响患者的正常生活47。近年来，临床上已建立了多种口腔溃疡动物模型用于实验研究，其制备思路主要从机体创伤、免疫力、氧自由基作用、病毒感染、内分泌紊乱、维生素以及锌、铜等微量元素缺乏等方面出发48。本文通过对临床相关口腔溃疡动物模型实验性文献的回顾性梳理，总结出目前常见口腔溃疡模型造模方法主要包括单因素造模法如机械创伤法、化学烧灼法、免疫诱导法、氧自由基损伤法、细菌感染法、放射法、1753 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 化疗法等和多因素造模方法如免疫化学联合法和病证结合法。动物模型的效度评价是动物模型研究中十分重要的一项环节，基于中西医临床病症特点这一方法可信度较高，尤其对于证候模型的评价更为全面49。因此笔者在总结拟定口腔溃疡中西医诊断标准的基础上，对其中西医诊断要点进行赋值，分析临床常用口腔溃疡动物模型的中西医吻合度。由表3可知，免疫诱导法、化学烧灼法中的NaOH晶体烧灼法和苯酚浸渍法具有较高的西医吻合度，分别为 85%、92.5%、92.5%。免疫法建立的口腔溃疡模型与人类ROU的发病机制极其相似，适用于研究复发性口腔溃疡发生、发展的机制，但此方法操作过程复杂且成模率不高，分析原因可能与抗原制备过程中多种不确定因素有关，如组织研磨程度、注射部位和剂量等50。化学烧灼法操作简便易行，造模成功率高，适合大规模动物实验，可作为某些促进口腔粘膜愈合的药物及抗炎药物的首要筛选模型，但在日常生活中此类化学药物很少接触到人类口腔黏膜，因此不能完全模拟ROU的发病过程。免疫化学法将免疫诱导法和化学烧灼法相结合，既克服了免疫诱导法成模率不高，以及溃疡个数与出现的部位不易掌控和化学灼烧法不具有免疫反应特征的缺点，又保留了二者症状及组织学改变与人类ROU相似的优点25，同时经分析发现该方法的中西医吻合度均较高，中医吻合度为86.6%，西医吻合度为82.5%。由此，从口腔溃疡疾病的致病因素、发病机制和模型复制的可操作性、便捷性、经济性、临床吻合度等多方面分析，免疫化学联合法应为复制口腔溃疡疾病较为理想的选择。病证结合动物模型同时具备中医证候特征和西医疾病特征，内外病因兼备，具有较高的中西医吻合度，以阴虚火旺证和胃热炽盛证吻合度最高，两者的西医吻合度分别为72.5%、82.5%，中医吻合度分别70%、86.6%。口腔溃疡证候造模常采用灌胃不同性味中药的方法，以温热性药材如干姜附子肉桂水煎液、党参黄芪水煎液等构建阴虚火旺证和胃火炽盛证，以破气耗气的寒凉药物如大承气汤构建脾胃阳虚证，可以发现造模方法过于单一，建议结合六淫邪气如燥、火等、情志因素如长期激怒法51和体质因素如过劳伤阴法52诱导相应的证候模型，所造的证候模型会更接近中医临床。综上所述，口腔溃疡病证结合模型的最佳选择为相应的证候造模+免疫化学联用法。病证结合动物模型在一定程度上代表了中医药动物模型的研究方向，评价该模型的指标主要包括疾病指标以及证候指标2个方面11。中医证候的评价是病证模型评价的关键，但目前对于病证结合口腔溃疡模型证候指标的评价还没有成熟完善的体系，主要通过观察模型动物的一般状态、宏观表征及行为学等确认中医证候属性，该方法具有一定的主观性，存在一定误差。在后续的模型评价中，应增添如动物精神、行为、疼痛等表观指标，在全方位采集模型动物宏观信息的基础上，运用正面评价为主联合逆向反证为辅的“以方测证”法筛选出符合临床诊疗特点的模型53，如胃火炽盛采用清胃散，阴虚火旺采用知柏地黄丸等方药进行反证，以期在模型评价的过程中推动模型的成熟构建，制备出与临床口腔溃疡疾病中西医吻合度较高的动物模型，为临床口腔溃疡的病因和发病机制的探讨以及临床新药的开发提供可靠依据。参考文献 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450046,China)Abstract:In this study,the current clinical animal models of oral ulcers were evaluated and analyzed through literature review and the assignment method based on clinical symptoms of traditional Chinese and Western medicine.The results found that chemical cautery and immune induction were the modeling methods that were highly consistent with Modern medicine.The combination of immunochemical method and disease-syndrome combination method with high degree of agreement between traditional Chinese and Modern medicine.From the analysis of the pathogenesis of oral ulcer disease,pathogenic factors and the operability,convenience,economy and clinical agreement of model replication,the combined immunochemical method is an ideal choice for replicating oral ulcer disease.The best choice for the corresponding syndrome modeling+immunochemical combination.However,it can be found that the combination model of oral ulcer disease and syndrome is seldom used in clinic,and there is a lack of TCM pathogenic factors in the modeling method.The indicators observed in the evaluation of model effectiveness also need to be further improved.It is recommended that the subsequent construction of oral ulcer animal models should start from adding Exogenous pathogenic factors such as dryness and fire are mainly caused by internal pathogenic factors such as emotion and constitution.The evaluation criteria for effectiveness should also be based on adding apparent indicators such as animal spirit,behavior,pain,etc.On the basis of comprehensively collecting macroscopic information of model animals,using the method of testing evidence by prescription,which is mainly based on positive evaluation and supplemented by reverse evidence,to reproduce an animal model of oral ulcer that is highly consistent with the characteristics of clinical symptoms of traditional Chinese and Modern medicine.Keywords:Recurrent oral ulcer,Aphthous ulcer,Animal model,Combination of disease and syndrome,Diagnostic criteria（责任编辑：李青）1756