抗冻蛋白多维活性表征鉴定新进展.pdf

第 35 卷第 3 期 极地研究 Vol.35,No.3 2023 年 9 月 CHINESE JOURNAL OF POLAR RESEARCH September 2023 收稿日期 2022 年 9 月收到来稿,2022 年 11 月收到修改稿 基金项目 国家重点研发计划(2018YFC1406702)资助 作者简介 单妍妍,女,1998 年。硕士研究生,主要从事极地微生物、新型低温保护剂研究。E-mail: 通信作者 廖丽,E-mail:;胥义,E-mail: 抗冻蛋白多维活性表征鉴定新进展 单妍妍1,2 廖丽2 胥义1 陈波2(1上海理工大学,健康科学与工程学院,上海 200093;2中国极地研究中心(中国极地研究所),自然资源部极地科学重点实验室,上海 200136)摘要 抗冻蛋白(antifreeze protein)是一类能够控制冰晶、帮助生物免受低温损害的蛋白,具有多种优良的抗冻活性。本文全面讨论了抗冻蛋白多种抗冻活性(冰面结合活性、热滞活性、重结晶抑制活性、冰晶修饰活性和冰粘附活性),介绍了抗冻活性鉴定方法及其最新的进展。在此基础上,总结了抗冻蛋白研究存在的问题与挑战,并对其研究前景进行了展望。关键词 抗冻蛋白 冰面结合 热滞活性 重结晶抑制 冰晶修饰 doi:10.13679/j.jdyj.20220424 0 引言 极地虽然是地球上最寒冷、最主要的冰冻圈,但同样拥有丰富的生物多样性。极地环境中生存的动物、植物、微生物能耐受 0 以下低温,其生存奥秘之一在于可合成抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)。抗冻蛋白是一类能够跟冰晶结合并控制冰晶生长从而保护细胞免受冰冻损伤的特殊蛋白质,具备高度多样的进化来源、序列特征和结构特征1。除了在生物体内发挥作用,许多研究表明抗冻蛋白优良的抗冻活性使其在航天、食品、低温生物医学等2-4领域具有广泛的应用,因此抗冻蛋白具有重要的基础和应用研究价值。抗冻蛋白的生物活性多样,研究难度较大,活性的鉴定是深入认知抗冻蛋白机理、推动抗冻蛋白应用的基础。目前抗冻蛋白热滞活性和重结晶抑制活性的相关研究较多,而冰面结合活性、冰晶修饰活性和冰粘附活性的研究较少5。然而仅聚焦于抗冻蛋白部分抗冻活性的研究远远不够,全面的活性研究可以为抗冻蛋白的深入开发和应用提供参考和理论依据。近年来,越来越多的研究开始重视抗冻蛋白的全面抗冻活性6-7。抗冻活性多维表征对抗冻蛋白应用和机理等方面的研究具有非常重要的意义和价值。1 抗冻蛋白发现和抗冻活性研究历程 迄今为止,对抗冻蛋白的研究已有50多年,研究人员在鱼类、植物、昆虫、微生物等8-9物种中均发现了抗冻蛋白(图1a)。不同来源的抗冻蛋白在冰面结合活性、热滞活性(thermal retarda-tion)、重结晶抑制活性(recrystallization inhibi-tion)、冰晶修饰活性等方面均有差异10。抗冻蛋白活性的鉴定采用的方式较为特殊(如图1b 所示,具体测定方法在相关活性部分进行详述)。生物对低温环境的耐受最初的表现是热滞活性,科学家在南极冰鱼提取出抗冻蛋白并发现该蛋白对溶液冻结温度有滞后现象11。随着对抗冻蛋白的研究深入,冰面结合活性、重结晶抑 第 3 期 单妍妍等:抗冻蛋白多维活性表征鉴定新进展 491 制活性、冰晶修饰活性和冰粘附活性得到广泛关注。抗冻蛋白活性鉴定的方法也与时俱进,由传统简单的实验方案,逐步完善更替至今,已有较系统全面的方案与研究。图 1 抗冻蛋白的来源和抗冻活性研究。a)不同来源抗冻蛋白发现时间线;b)抗冻活性主要研究方法 Fig.1.Study on source of antifreeze protein and antifreeze activity.a)time of discovery of antifreeze proteins from different sources;b)main research methods of antifreeze activity 1.1 热滞活性 通常情况下,溶液中冰晶开始生长的温度被称为凝固点,冰晶开始融化的温度为熔点。抗冻蛋白吸附到冰晶表面后,在降温冷却过程中非依数的降低溶液凝固点,但几乎不影响融化过程,使溶液凝固点显著低于熔点,产生热滞后现象(图 2)。熔融温度与冻结温度之间的温度间隔称为滞后间隙,凝固点与熔点产生的差值为热滞值,又被称为热滞活性或抗冻活性12。根据不同生物的抗冻蛋白在等摩尔浓度下引起的热滞活性的高低,可将其分为两类:中度活性和高度活性。中度活性蛋白的热滞活性在 0.51.0,高度活性蛋白的热滞值在微摩尔(molmL1)的浓度下能够达到与中度活性蛋白相似的热滞值,仅在毫摩尔(mmolmL1)浓度下热滞值能达到 6 左右13。表征抗冻蛋白热滞活性方法主要包括毛细管单冰晶生长法、纳升渗透压法、差示扫描量热(DSC)法等。毛细管单冰晶生长法14是表征抗冻蛋白热滞活性的传统方法,先将毛细管的一端烧结,然后将抗冻蛋白注入毛细管中,并将毛细管 图 2 抗冻蛋白热滞活性(根据 Kim 等12修改)Fig.2.Thermal hysteresis activity of antifreeze protein(modified from Kim et al.12)用石蜡油密封住,先快速降温使样品冻结,再缓慢升温直至样品中仅保留 1 个单冰晶核,作为晶种。再对毛细管上单冰晶进行缓慢的升温和降温,低温显微镜观察并记录单冰晶的凝固点和熔点,计算出抗冻蛋白的热滞活性。随着科技进步与发 492 极地研究 第 35 卷 展,纳升渗透压法15是目前常用的表征抗冻蛋白热滞活性方法,用注射器将样品加入纳升渗透仪控温台上的样品口,调控温度并在显微镜下观察记录数据。和毛细管单冰晶生长法相似,低温控制台面中只孵育有 1 个单冰晶,通过记录融化温度和冻结温度,得到抗冻蛋白的热滞值。DSC法16利用仪器精密的测温程序,通过升温和降温测定样品的吸热和放热情况,得到样品的融化和冻结温度。具体做法是先设置程序进行降温和复温,记录样品固液共存状态时的温度范围。随后根据样品融化温度,设定保留温度,进行冻融循环过程,测出抗冻蛋白的热滞值。在耐寒生物中,热滞活性可防止细胞外产生冰晶穿过细胞膜,对细胞质产生机械损伤。耐寒生物生活的环境温度远低于其本身抗冻蛋白具有的热滞活性温度,抗冻蛋白的热滞活性无法防止整个生物体冻结,但可使冰点降低几摄氏度,这些温差便足够让耐寒生物得到缓冲,产生细胞外的“低温适应性”,进而在低温环境中存活17。昆虫和细菌来源的抗冻蛋白,具有极高的热滞活性,而植物来源抗冻蛋白热滞活性很低,但具有非常高的重结晶抑制效果18。这种现象可能与生物特性相关,昆虫在低温环境中,热滞活性产生作用降低冻结温度,让生物缓慢适应低温防止细胞过冷产生冰晶致死,而植物需要分泌抗冻蛋白以防止重结晶损伤细胞质,重结晶抑制活性对于植物生长存活更重要19-20。1.2 重结晶抑制活性 冰晶在温度波动过程中会出现小冰晶融化,解冻冷水量增加,进而冷水分子就会添加到现有冰晶上,使原有的小冰晶逐渐消失并聚集变成大冰晶,这一过程被称为冰重结晶21。抗冻蛋白的热滞活性防止生物被快速冷冻,而抗冻蛋白另一个重结晶抑制活性可以控制冰晶大小,减轻生物细胞膜冷冻过程产生的机械损伤。冰重结晶测量方法多种,只是略有不同,最初的重结晶抑制测量方法 夹板冷却法22是将样品在两个玻璃片中夹出薄溶液层,直接快速冷却成核,然后加热到低于样品熔点的某个温度,通常在84,置于显微镜下观察冰晶变化。在此基础上进一步优化的溅射法和蔗糖三明治检测法是目前测量重结晶抑制活性的主要方法23。“溅射法”是先将铝块置于干冰中预冷后,将10 L 样品从2 m 高度滴到预冷的铝块上,用预冷好的镊子小心地将铝块上形成的一层薄冰移到玻片,并放到冷台上,加热退火3060 min,用低温显微镜观察并记录冰晶生长情况。“蔗糖三明治检测法”是将样品溶于质量分数为30%45%蔗糖溶液,取1 L 样品用14 mm的玻片夹住,周围用油脂封闭,使用干冰对其快速降温后,将玻片置于冷台上加热退火,显微镜观察并记录冰晶生长情况。Image J软件分析记录冰晶图片,可获得晶粒平均大小和面积变化,定性和定量表征抗冻蛋白的重结晶抑制活性。抗冻蛋白的重结晶抑制活性和热滞活性分别赋予生物冻融耐受性和滞后冷冻,这两个性质是否相关一直存在争议24。植物来源的抗冻蛋白大都具有很高的重结晶抑制活性,能抑制细胞外基质的冰重结晶,但热滞活性很低25。一种北极细菌假单胞菌产生的两个抗冻蛋白在相同浓度时有相似热滞活性,但表现出的重结晶抑制活性差异很大26。南极线虫(Panagrolaimus davidi)来源的抗冻蛋白具有重结晶抑制活性,但热滞活性很低甚至没有27。具有高重结晶抑制活性的抗冻蛋白可能具有低热滞活性,也可能具有更高的热滞活性。抗冻蛋白的热滞活性会随着浓度升高而升高,而重结晶抑制活性多在低浓度下表现明显的抑制冰晶生长28-29。热滞活性和重结晶抑制活性之间并没有表现出明显的相关性。1.3 冰面结合活性 抗冻蛋白种类多样,独立进化,抗冻蛋白在大小、活性、氨基酸组成和结构上有很大不同,因此对其的归纳和观察很困难。对于这些结构和大小不同的抗冻蛋白,唯一的共同点就是可作为特殊的冰面粘合剂,吸附在冰面上调控冰晶成核和生长过程。不同结构的抗冻蛋白具有不同的冰结合位点(ice-binding site,IBS),抗冻蛋白的 IBS 具有不同的功能,与六棱柱的不同冰面结合发挥抗冻作用,对特定方向的特定冰面具有专一性30。最初,Knight 等31发现抗冻蛋白和冰吸附聚集会使冰表面变得浑浊,冰面看起来类似于磨砂玻璃。利用抗冻蛋白独有特性设计出冰蚀刻实验,以判断抗冻蛋白冰面结合特性。该方法使用“冷手指(cold finger)”孵育出一块半球形单冰晶,根 第 3 期 单妍妍等:抗冻蛋白多维活性表征鉴定新进展 493 据冰半球定位单冰晶的 c 轴和 a 轴,将半球浸入充满抗冻蛋白的稀释溶液中,观察在含有抗冻蛋白溶液中的半球形冰晶蚀刻的区域,可以判断出抗冻蛋白的冰吸附面(图 3)。冰蚀刻技术是最早鉴别冰面结合技术之一,有利于识别抗冻蛋白与冰晶结合平面方向。在传统冰蚀刻法基础上,加入荧光标记,荧光蛋白刻蚀法(fluorescence-based ice plane affinity,FIPA)是一种新改进的技术32-33,用于确定抗冻蛋白结合的冰面,能够直观地看到抗冻蛋白和冰面的结合方位,且大大缩短实验时间。图 3 荧光蛋白刻蚀法(FIPA)测定抗冻蛋白冰结合面(根据 Arai 等33修改)。a)荧光蛋白刻蚀法实验步骤;b)不同冰结合面和对应荧光刻蚀位点 Fig.3.Determining the ice-binding planes of AFP by Fluores-cence-based Ice Plane Affinity(FIPA)(modified from Arai et al.33).a)experimental procedure fluorescence-based ice plane affinity;b)different ice binding surfaces and corresponding fluorescence etching sites 鱼类来源的中度活性抗冻蛋白如冬季比目鱼(wfAFP,Pleuronectes americanus)和 长 吻 鱼(LpAFP,Brachyopsis rostratus)多与冰晶的锥面结合34,而昆虫、细菌等来源的高度活性抗冻蛋白,如黄粉虫(TmAFP,Tenebrio molitor)和南极细菌(MpAFP,Marinomonas primoryensis)均吸附在冰晶基面上33-34。越来越多的研究证明,结合冰基面的抗冻蛋白多具有特别高的热滞活性。1.4 冰晶修饰形态活性 冰结合面主要包括基面、主棱面、次棱面和锥面(图3b),大多数情况下,冰晶在除基面之外的所有平面均匀生长,形成扁平的圆盘形状。但由于每种抗冻蛋白的冰面结合方向不同,结冰速率不同,因此在含有抗冻蛋白的溶液中会形成不同的冰晶晶型34。中度活性抗冻蛋白多结合锥面,形成双锥体冰晶,并随着抗冻蛋白浓度增加和作用时间的延长,冰晶形态逐渐趋近于针状(例如AFGP35),昆虫、微生物等来源的高度活性抗冻蛋白多结合在基面和柱面,形成柠檬状(例如TmAFP31)、六角形(例如 MpAFP36)等形貌的冰晶(图4)。图 4 冰晶修饰形态活性(根据 Bar-dolev 等36修改)Fig.4.Modified ice crystal growth shapes activity(modified from Bar-dolev et al.36)观察冰晶修饰活性,一般将样品置于温度控制装置下,在显微镜下观察冰晶形态,使用纳升渗透压仪调控温度,观测抗冻蛋白单冰晶形态36,整个过程需要缓慢升温,控制形成单个或少量冰晶后,再缓慢降温或升温观察冰晶生长和融化方向和冰晶形态。不同形态的冰晶对细胞保护效果不同,Lee等37-38进 行 了 鱼 类 来 源(AFP)、细 菌 来 源(FfAFP)和真菌酵母来源(LeAFP)的 3 种抗冻蛋白低温保护细胞实验。实验结果显示 AFP对细胞保护效果最差,形成的双锥形冰晶会对细胞产生损伤;高浓度的 LeAFP 低温保护效果最好,形成的六角形冰晶能更好地保护细胞。有报道指出抗冻蛋白在低温保存过程中对细胞产生毒性,但这是该研究仅对鱼类来源的抗冻蛋白进行实验并得出的实验结论39。近期报道用昆虫来源的抗冻蛋白开展实验,发现在细胞内外的高度活性抗冻蛋 494 极地研究 第 35 卷 白均能显著改善细胞的冷冻保存情况40,说明能够高效保护细胞的抗冻蛋白不仅需要高热滞活性和重结晶抑制活性,冰面结合方向也有极大影响,如果形成尖锐冰晶则会对细胞产生更严重的机械损伤。1.5 冰粘附活性 冰粘附活性最初是使用微流控冷指装置(microfluidic cold finger,MCF)观察海洋单胞菌时被发现的。在装置中注入双蒸水,快速冷冻结冰,然后缓慢升温并保持在 0 左右,使除“冷手指”外的多数冰融化,然后将细菌注入,配合显微镜观察细菌活动情况并记录41。在南极细菌海洋单胞菌 Marinomonas pri-moryensis 中分离出来的 MpIBP,由 5 个不同的结构域组成(RR)。结构域(MpIBP-R)是此蛋白的主要组成部分(图 5),约占 MpIBP 大小的90%,该结构域由 120 个串联的包含 104 氨基酸残基的重复序列组成。在 5 个结构域中,只有第 4个结构域(MpIBP-R),具有冰结合活性,占整个蛋白质重量的 2%,MpIBP-R是 1 个单一的、Ca2+依赖的34 kDa大小的结构域,由13个包含约19 个氨基酸的重复序列构成,折叠成 1 个重复的-螺线管结构42。此外,位于该蛋白质 C 末端的第 5 个结构域 R包含几个毒素蛋白来源的重复单位,这些重复单位可能负责将 MpIBP 分泌出细胞,并将其锚定在细胞表面。在自然环境中这种抗冻蛋白是 1 种冰粘附素42,其抗冻蛋白结构域 MpIBP-R可以使宿主细菌与冰结合,使细菌保持在水体的上层,从而得到更丰富的氧气和营养物质。冰粘附作用实际上是由冰结合活性产生的,冰结合活性帮助部分含有抗冻蛋白的宿主细菌牢牢抓住冰面,使细菌更容易呼吸和吸收营养。图 5 冰粘附活性(根据 Bar-dolev 等41修改)Fig.5.Ice adhesion activity(modified from Bar-dolev et al.41)2 结语与展望 对抗冻蛋白的研究可帮助理解耐寒生物体如何具有低温保护能力。过去的几十年间,关于抗冻蛋白的冰面结合活性和抗冻蛋白作用性质的认识已经取得很大的进展,但仍存在诸如以下几方面尚未解决的问题。1.抗冻蛋白不同活性之间的关系,以及决定这些活性的机制,仍然需要进一步研究。从目前的结果看,热滞活性和抑制冰重结晶活性之间没有必然联系,但并不排除存在弱相关性。只有研究清楚是什么决定了抗冻蛋白的各种活性,才能为人工改造和定向进化出性能更优秀的抗冻蛋白提供理论指导,才能将抗冻蛋白推广到实际应用中,解决目前低温冷冻医学等领域的瓶颈问题。2.抗冻蛋白的活性对体内、体外抗冻效果的整体贡献仍然不够清晰。其中,热滞活性和抑制冰重结晶活性对实际抗冻效果、样品保存效果的贡献仍然存在着矛盾。其他活性,例如冰晶修饰活性等,是否在抗冻应用中也发挥了作用,这些活性和抗冻效果之间的关联,决定了抗冻蛋白的筛选方向和指标,有待进一步明确。目前抗冻蛋白的研究多集中在生物体外对蛋白发挥抗冻作用的方式,然而生物体内和生物体外发挥作用方式可能不同,蛋白在保护生物体免受冰晶伤害时,抗冻蛋白可能与生物体内其他机制协调、相互作用。关注抗冻蛋白在生物机体内作用过程的研究,对抗冻蛋白作用机理及应用方面的研究具有重要的参考价值。3.研究抗冻蛋白活性的方法和对结果解读的方式不统一,导致不同研究得出的结果很难直接进行比较。尤其是针对热滞活性的鉴定,不同方法得到的结果往往存在一定的差异,而对结果的表述方式和活性测量单位在现有的文献报道中各不相同。因此,未来需要建立抗冻蛋白活性表征的统一标准。4.缺乏抗冻蛋白与冰面结合在分子水平上的观测研究。许多研究验证了抗冻蛋白能吸附在冰晶上,且只要有冰晶存在,抗冻蛋白与冰面的结合不可逆转。宏观观测与理论模型和分子动力学相结合的方法,可以描绘出不同结构抗冻蛋白 第 3 期 单妍妍等:抗冻蛋白多维活性表征鉴定新进展 495 发挥抗冻作用的细节。目前,抗冻蛋白与冰面结合在分子水平上观测研究鲜有报道。冰-水界面细节过程研究极具挑战,需要聚焦跨学科交叉的研究,结合更多物理化学知识才可能观测到抗冻蛋白和冰面结合的过程,补充和验证这一领域的理论验证实验研究。参考文献 1 HE Z Y,LIU K,WANG J J.Bioinspired materials for controlling ice nucleation,growth,and recrystallizationJ.Accounts of Chemical Research,2018,51(5):1082-1091.2 MONALISA K,SHIBATA M,HAGIWARA T.Ice recrystallization behavior of corn starch/sucrose solutions:Effects of addition of corn starch and antifreeze protein IIIJ.Food Biophysics,2021,16(2):229-236.3 LIU Z,ZHENG X,WANG J J.Bioinspired ice-binding materials for tissue and organ cryopreservationJ.Journal of the American Chemical Society,2022,144(13):5685-5701.4 ZHANG Y Y,CAO Y,ZHENG H Y,et al.Ectopic expression of antifreeze protein gene from Ammopiptanthus nanus confers chilling tolerance in maizeJ.The Crop Journal,2021,9(4):924-933.5 ARAI T,YAMAUCHI A,YANG Y,et al.Adsorption of ice-binding proteins onto whole ice crystal surfaces does not necessarily confer a high thermal hysteresis 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