抗PD-L1单抗促免疫细胞活化参与动脉粥样硬化.pdf

网络出版时间：网络出版地址：抗炎免疫药理学抗 单抗促免疫细胞活化参与动脉粥样硬化李忠莎，李婧玉，魏思萌，李月，李琦，陈畅（重庆大学附属三峡医院临床转化研究中心，重庆 ；哈尔滨医科大学药学院药理学教研室，哈尔滨医科大学附属肿瘤医院生物治疗中心，黑龙江 哈尔滨 ）收稿日期：，修回日期：基金项目：国家自然科学基金面上项目（）作者简介：李忠莎（），女，硕士生，研究方向：动脉粥样硬化治疗，：；陈畅（），男，博士生，教授，博士生导师，研究方向：动脉粥样硬化治疗，通信作者，：文献标志码：文章编号：（）中国图书分类号：；摘要：目的研究抗 单抗对高脂饮食诱导的 小鼠动脉粥样硬化（，）发生发展的影响。方法将 只 小鼠随机分为正常组、高脂组、正常 抗 单抗组和高脂 抗 单抗组，通过高胆固醇饲料喂养建立 模型。实验动物饲养 周后，分离各组实验动物血管（主动脉根部至胸主动脉），进行油红 染色。酶联免疫吸附法（）检测血清中总胆固醇（）、三酰甘油（）、高密度脂蛋白（）、低密度脂蛋白（）和炎症因子（、）水平。流式细胞计数检测淋巴细胞（、和 ）、和 细胞比例。结果与高脂组相比，给予抗 单抗后促血管壁脂质累计并上调血清 、和 含量，但是对 无影响。高脂饲养条件下给予抗 单抗促 、和 细胞活化。除此之外，高脂饲养条件下给予抗 单抗还具有活化 和 细胞的作用。检测发现，高脂饲养条件下给予抗 单抗上调血清中炎症因子含量（、）。结论高脂饲养条件下给予抗 单抗促 发生发展的机制与免疫活化有关。关键词：动脉粥样硬化；抗 单抗；免疫细胞；免疫活化；炎症因子；炎症反应开放科学（资源服务）标识码（）：动脉粥样硬化（，）发病机制尚未完全明确。近年研究发现由免疫细胞活化所介导的炎症反应在 的进程中具有重要的意义 。提示抑制机体免疫系统活化所诱发的炎症反应具有延缓 进程的潜在临床应用价值 。细胞程序性死亡配体 （，）又称 ，属于 家族中的型跨膜糖蛋白，通过与 细胞膜上的 结合，抑制 细胞增殖和活化，在维持机体免疫稳定中发挥关键作用 。然而，表达与 临床病理学特征和预后的关系尚存在争议。本研究通过体内外实验证实抗 单抗促免疫细胞活化加重 。通过探讨 功能改变与 的相关性，为 的发生发展相关病理机制研究提供新方向。同时也为合并有心血管疾病的肿瘤患者的免疫治疗提供指导建议。材料与方法 实验动物及细胞 遗传背景的载脂蛋白 基因敲除小鼠（）购自南京君科生物工程有限公司，雄性，清洁级，周龄，体质量（）。实验动物饲养于哈尔滨医科大学药理学实验动物中心。本实验通过哈尔滨医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准（）。材料与试剂抗 单抗（，中国）、油红 染料（，武汉塞维尔公司）；染料（，武汉塞维尔公司）。（）、（）、（）、（）和 （）试剂盒均购自赛培生物（武汉）。总胆固醇（，）、三酰甘油（，）、高密度脂蛋白（，）和低密度脂蛋白（，）均购自南京建成。（）抗体、（）抗体和 （）抗体均购自 。高脂饲料购自北京科奥（蔗糖 ，猪油 ，胆固醇 ，胆酸钠 ，酪蛋白 ，磷酸氢钙 ，石粉 ，预混料 ，基础饲料中国药理学通报 ；（）：）。仪器倒置显微镜（日本 ），微型低速离心机（中国奥盛仪器），水平摇床（北京恒奥生物）酶标检测仪（美国 ），涡旋振荡器（中国科大创新）。小鼠模型制备及取材 只 小鼠随机分成 组，普通饲料喂养组（，），高脂饲料喂养组（，），普通饲料喂养并给予抗 单抗组（，腹腔注射，一周 次），高脂饲料喂养给予抗 单抗组（，腹腔注射，一周 次）。喂养 周后，使用二氧化碳过量麻醉法处死小鼠。快速分离动脉（包括左右颈总动脉、左锁骨下动脉、主动脉至腹主动脉）。油红 染色将组织样本置入包埋盒中，流水冲洗 ，取出沥净，将样本浸泡于 异丙醇中后，使用油红 染液浸染 ，取出样本并放入 异丙醇中浸泡分化，直到脂质斑块呈现红色而周围组织呈现白色，取出并沥干，放在底板上，拍照。收集各组实验动物血清，离心 ，分离血清，保存。按试剂盒说明检测 、和 ，于 处测定吸光度。流式细胞计数取 抗凝血，加入 红细胞裂解液，避光孵育 ，离心 ，弃上清，重悬 次。加入 、和 荧光单克隆抗体，混匀，室温避光孵育 。流式细胞仪检测 、和 的含量。淋巴细胞分离各组实验动物眼球取血并置于加入肝素抗凝的离心管内，离心管中缓慢加入适量淋巴细胞分离液，离心 ，可见离心管从上到下分为 层：血浆层（淡黄色）、淋巴细胞层（白膜层）、分离液层（透明）、红细胞与粒细胞层（红细胞沉淀），吸取白膜层细胞到另一离心管中，重悬细胞，离心 ，弃掉上清，重复操作后，弃掉上清，使用 重悬沉淀。统计学分析使用专业软件 、及 进行数据处理与分析。使用 进行统计学分析，所有数据结果均用珋 表示，两组间比较使用 检验。结果 抗 单 抗 促 小 鼠 小鼠高脂饲养条件下腹腔注射抗 单抗，周后检测血清脂质含量。结果发现，与正常组比较，小鼠高脂饲养后血清 、明显升高。正常饲养条件下给予抗 单抗抑制血清 含量而促 含量升高（）。与高脂组相比，高脂饲养条件下给予抗 单抗明显升高血清 、和 含量，但是对 没有影响（）。油红 结果提示，正常饲养条件下给予抗 单抗具有促血管壁脂质沉积的作用，但是这一作用并不具有明显的病理意义。而高脂饲养条件下给予抗 单抗则明显促血管壁脂质沉积（）。：，（珋 ，）；：（珋 ，）；中国药理学通报 ；（）小鼠高脂饲养给予抗 单抗促细胞活化 信号转导途径在调控机体免疫细胞活化中具有重要的作用。应用流式细胞计数检测各组实验动物全血 细胞含量。结果发现，正常组、高脂组、正常 组、高脂 组的 细胞含量分别为 、。结果说明，给予抗 单抗具有诱导免疫细胞活化的作用。由 和 细胞组成。在检测了 全 血 和 细 胞 含 量 发 现，小鼠正常饲养条件下给予抗 单抗促 含量升高，但是对 细胞含量没有影响（）。小鼠高脂饲养后 和 细胞含量较正常饲养均明显增加。而高脂饲养条件下给予抗 单抗后 和 细胞含量明显升高（）。小鼠高脂饲养给予抗 单抗促 和 细胞活化 和 细胞在 形成过程中同样具有重要的作用。通过检测了血液中这两种细胞的含量发现，与正常组比较，小鼠正常及高脂饲养条件下给予抗 单抗均明显促 和 细胞活化（）。小鼠高脂饲养给予抗 单抗促炎症因子释放炎症因子释放与免疫细胞活化密切相关。本研究通过 检测血清中炎症因子的含量变化。结果发现，与正常组相比，小鼠正常饲养条件下给予抗 单抗具有促 、升高的作用。而 小鼠高脂饲养条件下给予抗 单抗明显促进 、的释放（）。讨论 是一种慢性退行性病变，其病变范围广，累及各大、中动脉，常伴有明显的血管壁脂质累积并于病变血管局部形成明显粥样斑块 ，斑块破裂引起管腔内血栓形成是造成心肌梗死和中风的主要原因 。研究证实，免疫细胞活化及炎症因子的释放并参与 的整个过程，在 发生发展的早期，在多种酶及活性物质参与下，血管壁及管腔内原有免疫环境改变，氧化形成氧化型 而获得免疫原性 ，最终诱导免疫细胞活化。在体内多种细胞膜表面广泛表达 ，这与体内 细胞活性调控密切相关。有研究发现，在淋巴细胞表面同样检测到 的表达 。本研究证实，小 鼠高脂饲养条件下给予抗 单抗处理后，（珋 ，），；，中国药理学通报 ；（）（珋 ，）；，；（珋 ，），；，；血浆脂质含量升高，血管壁有明显的脂质累积。提示高脂饲养条件下给予抗 单抗具有加重 的作用，这可能与促机体免疫活化有关。有研究报道，在 斑块中检测到 和 高度活化 。这表明 细胞参与了 进展 。本研究通过构建 小鼠 模型发现，高脂喂养条件下实验动物体内 细胞数量没有改变，给予抗 单抗后也同样如此。但是在高脂饲养条件下给予抗 单抗后 细胞数量升高而 细胞数量下降，提示免疫活化参与 的发生发展 。和 含量的改变可能是诱发斑块不稳定的原因之一。本研究发现，高脂饲养条件下给予抗 单抗后促进 和 细胞的活化。然而有意义的是，常规饲养条件下给予抗 单抗后同样促进 和 细胞的活化。研究证实内皮细胞（，）作为抗原递呈细胞向 细胞递呈抗原，是抑制免疫细胞于损伤局部黏附浸润的关键因素 。本实验证实，高脂饲养条件下给予抗 单抗通过免疫活化促进 的进展。结合我们的研究结果及对已有研究的分析，我们推测 表面 功能的改变通过弱化 信号转导途径进而弱化对 细胞活化调控，最终促进机体 细胞活化参与 。目前，针对 的靶向性阻断，在多种肿瘤的前期临床试验中均显示出明显的疗效优势 。同时，对罹患肿瘤并伴有 的患者来说，虽然给予抗 单抗具有明显的抗肿瘤作用，但在活化机体免疫系统杀伤肿瘤的同时还会对斑块的形成以及斑块的稳定性造成明显的影响。因此，如何在最大化利用抗 单抗抑制肿瘤细胞增殖的同时还兼顾其他系统病变将成为提高实体瘤免疫治疗的关键。综上所述，高脂饮食条件下给予抗 单抗通过活化免疫细胞及促炎症因子释放，加重 发生发展。提示 功能调控作为治疗 潜在治疗靶点的效用。尽管本实验取得一定的实验结果，但是抗 单抗通过何种下游调控机制影响 细胞活化还需要更加深入的研究。参考文献：，（）：中国药理学通报 ；（），：，（）：，：，（）：罗纲，向露，姚平，等 槲皮素调控巨噬细胞胆固醇稳态改善载脂蛋白 敲除小鼠动脉粥样硬化 中国药理学通报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（，；，）：，（）（），（），（），（）（，）（）（，），（，）（），：；中国药理学通报 ；（）