葡聚糖凝胶层析实验报告.doc

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葡聚糖凝胶层析实验报告
一、实验目的
1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；
2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理
凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等 。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂
1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤
1、装柱
将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样
装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集
打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测
收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析
1、实验结果：
序号
2
4
6
8
10
12
14
吸光度A
0．051
0.045
0.051
0.071
0.195
0.127
0.067
序号
16
18
20
22
24
26
28
吸光度A
0.055
0.039
0.066
0.027
0.053
0.049
0.011
2、蛋白质样品洗脱曲线：

收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：
流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。
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