健脾解毒汤对脾虚湿盛证银屑病样大鼠皮肤屏障功能调控机制研究.pdf

健脾解毒汤对脾虚湿盛证银屑病样大鼠皮肤屏障功能调控机制研究左永杰许孟月李 斌祖丽娅吐尔地 姚文汇刘红霞(.新疆医科大学第四临床医学院新疆 乌鲁木齐.新疆医科大学附属中医医院新疆 乌鲁木齐)摘要 目目的的 探讨细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶(/)信号通路在健脾解毒汤调控脾虚湿盛证银屑病大鼠皮肤组织水通道蛋白()表达中的作用 方方法法按照随机数字表法将 只 级雄性 大鼠分为空白组、模型组、甲氨蝶呤组、健脾解毒汤低剂量组、健脾解毒汤中剂量组、健脾解毒汤高剂量组、健脾解毒汤低剂量 抑制剂组、健脾解毒汤中剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组、健脾解毒汤低剂量 抑制剂组、健脾解毒汤中剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组每组 只除空白组外其余组大鼠采用咪喹莫特外涂和大黄配方颗粒剂灌胃方法构建脾虚湿盛证银屑病样皮损复合模型 造模成功后甲氨蝶呤组给予甲氨碟呤片./灌胃健脾解毒汤低、中、高剂量组分别给予./、./、./健脾解毒汤灌胃健脾解毒汤低、中、高剂量 抑制剂各组均给予 抑制剂 腹腔注射和相应剂量的健脾解毒汤灌胃健脾解毒汤低、中、高剂量 抑制剂各组均给予 抑制剂 腹腔注射和相应剂量的健脾解毒汤灌胃空白组和模型组给予等量的生理盐水灌胃和腹腔注射均 次/连续 灌胃结束后观察大鼠皮肤组织病理学形态 法检测皮肤组织中、/、/、蛋白表达情况 结结果果 模型组皮损部位表皮增生肥厚表皮内及角质层内较多中性粒细胞浸润真皮浅层内血管扩张慢性炎细胞散在或灶状浸润各药物组皮肤组织病变程度均较模型组轻健脾解毒汤高剂量组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组病变程度更轻 与空白组比较模型组大鼠皮肤组织中 蛋白相对表达量明显降低()/、蛋白相对表达量均明显升高(均.)与模型组比较甲氨蝶呤组、健脾解毒汤各剂量组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组 蛋白相对表达量均明显升高(均 .)/、蛋白相对表达量均明显降低(均 .)且健脾解毒汤高剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组 蛋白相对表达量较其他药物组升高更明显(均.)蛋白相对表达量较其他药物组降低更明显(均.)/蛋白相对表达量较甲氨蝶呤组和健脾解毒汤低、中剂量组降低更明显(均.)结结论论 健脾解毒汤可能是通过抑制/信号通路的激活上调 蛋白表达从而使体内水液分布均衡恢复皮肤屏障功能而发挥治疗银屑病的作用关键词 银屑病健脾解毒汤脾虚湿盛证细胞外信号调节激酶 丝裂原活化蛋白激酶水通道蛋白:./.中图分类号 文献标识码 文章编号 ()作者简介 左永杰女在读博士研究生研究方向为皮肤病的中西医结合治疗通信作者 刘红霞 :.基金项目 国家自然科学基金项目()现代中西医结合杂志 ()(.):()/()().()././././.(.)/(.)(.)/(.)()/(.)./.:银屑病是一种遗传与环境共同作用诱发、免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性疾病与易感基因、皮肤屏障损伤和免疫异常等有关临床上表现为边界清楚的红斑、丘疹和斑块 上覆银白色 鳞屑 皮肤屏障损伤后表皮细胞过度增殖、角化不全以及真皮层的淋巴细胞浸润会进一步损害皮肤屏障功能使得肌肤失养病情加重、反复 目前研究认为水通道蛋白()与银屑病发病密切相关银屑病皮损组织中 表达减少促使患者皮肤处于缺水状态皮肤表现为干燥失养皮肤屏障现代中西医结合杂志 ()功能下降 首届岐黄学者刘红霞教授结合新疆的气候、饮食及证候特点提出“健脾祛湿法”治疗银屑病的学术思想 以法类方的“健脾解毒汤”治疗银屑病取得良好的临床疗效 团队前期研究发现健脾解毒汤可以促进脾虚湿盛证银屑病小鼠表皮颗粒层细胞分化抑制其有丝分裂 可改善银屑病皮损缓解“肌肤甲错”症状其作用机制可能与调节 淋巴细胞亚群、/通路及炎症因子肿瘤坏死因子 ()、干扰素 ()、白细胞介素()、白细胞介素()水平有关 本研究基于皮肤屏障功能探讨了健脾解毒汤是否通过细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶(/)信号通路调控脾虚湿盛证银屑病大鼠皮肤组织 的表达而发挥治疗作用以进一步明确其作用机制 实验材料与方法 实验动物 级雄性 大鼠 只 周龄体重 由新疆医科大学动物饲养中心提供动物合格证号:(新)采用新疆医科大学动物饲养中心提供的标准颗粒饲料常规分笼饲养饲养温度()相对湿度 自然光照实验前适应性饲养 周 主要药物健脾解毒汤由土茯苓 、绵萆薢 、黄柏 、苦参 、连翘 、生薏苡仁、茯苓 、炒白术 、白花蛇舌草 、丹参、炙甘草 组成水煎剂由新疆医科大学第四附属医院制剂室提供 大黄配方颗粒剂江阴天江药业有限公司/袋 咪喹莫特乳膏四川明欣药业有限责任公司生产国药准字 主 要 试 剂 及 仪 器 抑 制 剂(美国 公司批号:)、/通路抑制剂(美国 公司批号:)苏木素染液(福州迈新生物技术开发有限公司批号:)伊红染液、中性树胶(北京中杉金桥生物技术有限公司批号分别为 、)裂解液(博士德生物批号:)蛋 白 酶 抑 制 剂(博 士 德 生 物 批 号:)山羊抗兔 (批号:)山羊抗小鼠 (批号:)(.)(批 号:)(批号:)(义 翘 神 州 批 号:)抗体、抗体、()()抗体、/抗体、()抗体(批 号 依 次 为、)手动单道移液器(德国 公司批号:)电子天平(批号:)台式低速离心机(上海飞鸽仪器有限公司 批号:)酶标仪(美国 )凝胶成像系统(上海天能)实验方法 将雄性 大鼠随机分为空白组、模型组、甲氨蝶呤组、健脾解毒汤低剂量组、健脾解毒汤中剂量组、健脾解毒汤高剂量组、健脾解毒汤低剂量 抑制剂组、健脾解毒汤中剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组、健脾解毒汤低剂量 抑制剂组、健脾解毒汤中剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组每组 只 除空白组外其余组大鼠先参考文献方法建立银屑病样皮损模型:大鼠背部备皮范围 将 咪喹莫特.局部涂抹于背部剃光的皮肤处连续涂抹 然后依据“苦寒之药损其脾胃”观点参考文献建立脾虚湿盛证模型:/大黄配方颗粒剂 /(次)灌胃 次/连续 造模结束后按照中药药理研究方法学中由人和动物的体表面积计算法计算出的给药剂量甲氨蝶呤组给予甲氨碟呤片 /灌胃健脾解毒汤低、中、高剂量组分别给予./、./、./健脾解毒汤灌胃健脾解毒汤低、中、高剂量 抑制剂各组均给予 的 腹腔注射同时给予相应剂量的健脾解毒汤灌胃健脾解毒汤低、中、高剂量 抑 制 剂 各 组 均 给 予 /的 腹腔注射同时给予相应剂量的健脾解毒汤灌胃空白组和模型组给予等量的生理盐水灌胃和腹腔注射 灌胃和腹腔注射均 次/连续 检测指标及方法 皮肤状态观察各组大鼠背部皮肤状态并拍照 皮肤组织病理形态末次灌胃结束后处死各组大鼠收集背部皮损组织用固定液固定组织标本常规石蜡包埋、切片 染色后在光镜下观察现代中西医结合杂志 ()皮损组织病理形态 皮损组织中、/、/、蛋 白 表 达 情 况 采 用 法检测:取出保存在液氮中的皮肤组织经液氮研磨后将约 皮肤组织加入到预冷的.离心管中然后加入 裂解液充分混匀 放置 后 下 /离心 收集上清液 采用 法测定蛋白浓度进行电泳、转膜 脱脂奶粉封闭加入()、()、()、()、()、()一抗 孵育过夜加入二抗室温下孵育 法显色以 为内参蛋白运用凝胶成像系统分析灰度值计算空白组、模型组、甲氨蝶呤组、健脾解毒汤低剂量组、健脾解毒汤中剂量组、健脾解毒汤高剂量组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组各目的蛋白相对表达量 统计学方法运用 .软件对数据进行统计学分析计量资料多组比较采用单因素方差分析两两比较采用 检验.为差异有统计学意义 结 果 各组大鼠灌胃结束后背部皮肤状态空白组大鼠背部皮肤未见红斑鳞屑模型组大鼠背部皮肤可见紫红色斑块表皮肥厚隆起较厚鳞屑甲氨蝶呤组和健脾解毒汤低、中、高剂量组大鼠背部皮肤可见淡红色斑块细碎鳞屑健脾解毒汤低剂量 抑制剂组、健脾解毒汤中剂量 抑制剂组、健脾解毒汤低剂量 抑制剂组、健脾解毒汤中剂量 抑制剂组大鼠背部皮肤可见深红色斑块表皮微隆起片状鳞屑健脾解毒汤高剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组大鼠背部皮肤可见淡红斑无明显鳞屑皮损与正常平齐 见图 各组大鼠皮肤组织病理学形态空白组表皮未见明显增生角质层较薄表皮突平坦真皮层内少量慢性炎细胞浸润无明显血管扩张模型组表皮增生肥厚显著角化不全伴角化过度表皮突延长部分表皮细胞间水肿表皮内及角质层内较多中性粒细胞浸润真皮浅层内血管扩张慢性炎细胞散在或灶状浸润与模型组比较各药物组皮肤组织病变程度均减轻健脾解毒汤高剂量组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组的皮肤组织病变程度均显著减轻且健脾解毒汤高剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组病变程度稍轻于健脾解毒汤高剂量组 见图 各组大鼠皮肤组织中、/信号通路相关蛋白表达情况与空白组比较模型组蛋白相对表达量明显降低(均 .)/、蛋白相对表达量均明显升高(均.)与模型组比较甲氨蝶呤组、健脾解毒汤低剂量组、健脾解毒汤中剂量组、健脾解毒汤高剂量组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组 蛋白相对表达量均明显升高(均 .)/、蛋白相对表达量均明显降低(均.)且健脾解毒汤高剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组 蛋白相对表达量均明显高于其他药物组(均.)健脾解毒汤高剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组 蛋白相对表达量均明显低于其他药物组(均.)健脾解毒汤高剂量组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组、健脾解毒汤高剂量 抑制剂组 /蛋白相对表达量均明显低于甲氨蝶呤组、健脾解毒汤低剂量组、健脾解毒汤中剂量组(均 .)且健脾解毒汤高剂量 抑制剂组 /蛋白相对表达量均明显低于健脾解毒汤高剂量 抑制剂组和健脾解毒汤高剂量组(均 .)见图 及图 讨 论健脾解毒汤是刘红霞教授临证多年治疗银屑病的经验方方中土茯苓、萆薢为君共同发挥祛湿解毒通络之功白术、茯苓、薏苡仁为臣三药相使为用一燥一渗运利结合使水湿除而脾气健白花蛇舌草、连翘、黄柏、苦参及丹参为佐药合用共奏清热解毒、燥湿止痒之功甘草药性平和通行十二经脉可解毒、补虚、调和诸药为使药全方配伍刚柔相济散收同施共奏健脾解毒、润燥止痒之效且健脾益气除湿而不伤津 既往临床研究表明健脾解毒汤可有效治疗脾虚湿盛证寻常型银屑病银屑病发病机制复杂近年来研究发现角质形成细胞异常增生和分化、皮肤屏障功能受损刺激炎症因子释放等皮肤屏障功能失调因素均参与了银屑现代中西医结合杂志 ()图 空白组和银屑病各组大鼠灌胃结束后取样前背部皮肤表现病的发生发展其中各种表皮结构蛋白如 作为维持皮肤屏障功能的主要生化结构与银屑病的发生发展关系密切 本实验结果表明脾虚湿盛证银屑病样大鼠皮肤组织出现明显病理改变皮肤组织中 蛋白呈现异常低表达不同剂量健脾解毒汤干预后大鼠皮肤病变程度均减轻皮肤组织中 蛋白表达量明显上调且健脾解毒汤高剂量组改善更明显 提示健脾解毒汤改善脾虚湿盛证银屑病样大鼠皮肤组织屏障功能的作用与上调皮肤组织中水通道蛋白的表达有关 信号通路是细胞中炎症反应的关键通路具有将细胞外的刺激信号转导至细胞内并引起细胞应激、分化、增殖、凋亡的作用/、是 信号通路的重要成员分别具有调控细胞生长与分化和调节炎症与细胞凋亡等应激反应的作用 有研究表明 的表达与 信号通路的激活密切相关 本实验结果发现脾虚湿盛证银屑病样大鼠皮肤组织中 /、蛋白异常高表达不同剂量健脾解毒汤干 预 可 不 同 程 度 地 下 调 /、蛋白表达其中高剂量健脾解毒汤干预后 /、蛋白下调更明显 而高剂量健脾解毒汤分别与 抑制剂和/通 路 抑 制 剂 联 合 作 用 后 /、蛋白表达进一步下调 蛋白表达进一步上调提示/信号通路参与了健脾解毒汤对脾虚湿盛证银屑病样大鼠皮肤组织 表达的调节作用综上所述脾虚湿盛证银屑病样大鼠出现明显皮肤屏障功能异常健脾解毒汤能够通过抑制/信号通路的激活而上调脾虚湿盛证银屑病样大鼠皮肤组织中蛋白表达促进现代中西医结合杂志 ()图 空白组和银屑病各组大鼠皮肤组织病理学形态(染色)现代中西医结合杂志 ()图 空白组和银屑病各组大鼠皮肤组织中、/、/、蛋白印迹图图 空白组和银屑病各组大鼠皮肤组织中、/、/、蛋白相对表达量皮肤的水合作用从而改善皮肤的干燥程度修复皮肤的屏障功能 本实验进一步验证了健脾方药具有修复皮肤屏障功能的作用但由于中药具有多组分、多通路、多靶点作用等特点仍需对其有效成分及作用机制进行深入研究利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 中华医学会皮肤性病学分会银屑病专业委员会.中国银屑病诊疗指南:简版.中华皮肤科杂志():.():现代中西医结合杂志 ().汪海珍张予晋杨志波.润肤保湿软膏对血虚风燥证银屑病皮肤屏障功能干预作用及机制的研究.湖南中医药大学学报():.():.张成会刘朝霞刘红霞.刘红霞教授从脾胃论治疗银屑病的辨证经验.中华中医药杂志():.刘朝霞张成会刘红霞.刘红霞教授运用健脾祛湿、滋阴除湿法治疗皮肤病的辨证思路.中华中医药杂志():.李鹏英郭菲丰靓等.健脾解毒汤对小鼠银屑病模型作用的实验研究.中国临床药理学杂志():.李鹏英刘红霞.健脾解毒汤对小鼠表皮细胞分化的实验研究.中国中西医结合皮肤性病学杂志():.李鹏英丰靓刘红霞.中药 号方联合健脾解毒汤治疗寻常型银屑病脾虚湿盛证的疗效观察及对外周血 淋巴细胞的表达影响.中华中医药学刊():.刘朝霞魏建华姚尚萍等.调控/通路探讨健脾祛湿法治疗寻常型银屑病的机制.中国中西医结合皮肤性病学杂志():.底婷婷王燕赵京霞等.脾虚加重咪喹莫特诱导的银屑病样皮损模型的炎症反应机制研究.北京中医药():.陈奇.中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版社:.郭菲刘朝霞刘红霞.健脾解毒汤治疗脾虚湿盛证银屑病的临床研究.新疆医科大学学报():.():.庞勤何黎.信号传导通路与相关皮肤病.皮肤病与性病():.李姿慧王键蔡荣林等.参苓白术散通过/信号通路干预溃疡性结肠炎大鼠结肠组织、的表达.中成药():.():.().():.收稿日期 (上接第 页).:?.():.():.():.()().():.郭庆玲.炎症小体在自身免疫甲状腺炎发病机制中的作用及机制研究.沈阳:中国医科大学.李阿楠.白介素 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