实验五、蛋黄中卵磷脂的提取、纯化与鉴定.doc

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实验五：蛋黄中卵磷脂的提取、纯化与鉴定
一、实验目的
n 掌握从鲜鸡蛋中提取卵磷脂的方法与原理。
n 卵磷脂鉴定的方法与原理。
n 加深了解磷脂类物质的结构和性质。
二、实验内容
磷脂是一类含有磷酸的脂类，机体中主要含有两大类磷脂，由甘油构成的磷脂称为甘油磷脂（phosphoglyceride）；由神经鞘氨醇构成的磷脂，称为鞘磷脂（sphingolipid）。其结构具有由磷酸相连的取代基团（含氨碱或醇类）构成的亲水头（hydrophilic head）和由脂肪酸链构成的疏水尾（hydrophobic tail）。在生物膜中磷脂的亲水头位于膜表面，而疏水尾位于膜内侧。磷脂是重要的两亲物质，它们是生物膜的重要组分、乳化剂和表面活性剂。
磷脂依照氨基醇的不同可分：（1）磷脂酰胆碱（卵磷脂）（PC），分布：植物主要有大豆等，动物主要有脑、精液、肾上腺、红细胞，蛋卵黄（8-10%）。其主要作用是控制肝脂代谢，防止脂肪肝的形成；（2）、磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）（PE），参与血液凝结；（3）、磷脂酰丝氨酸（PS）；（4）、 磷脂酰肌醇（PI）；（5）、 磷脂酰甘油（PG）；（6）、二磷脂酰甘油（心磷脂）。
蛋黄磷脂属动物胚胎磷脂，含有大量的胆固醇和甘油三酯及许多人体不可缺少的营养物质和微量元素。卵磷脂是生命的基础物质，人类生命自始至终都离不开它的滋养和保护。卵磷脂存在于每个细胞之中，更多的是集中在脑及神经系统、血液循环系统、免疫系统以及肝、心、肾等重要器官。卵磷脂也被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”。蛋黄卵磷脂可将胆固醇乳化为极细的颗粒，这种微细的乳化胆固醇颗粒可透过血管壁被组织利用，而不会使血浆中的胆固醇增加。
三、实验原理、方法和手段
原理一：卵磷脂是生物体组织细胞的重要成分，主要存在于大豆等植物组织以及动物的肝、脑、脾、心、卵等组织中，尤其在蛋黄中含量较多(10%左右)。卵磷脂和脑磷脂均溶于乙醚而不溶于丙酮，利用此性质可将其与中性脂肪分离开；卵磷脂能溶于乙醇而脑磷脂不溶，利用此性质又可将卵磷脂和脑磷脂分离。
原理二：卵磷脂为白色，当与空气接触后，其所含不饱和脂肪酸会被氧化而使卵磷脂呈黄褐色。卵磷脂被碱水解后可分解为脂肪酸盐、甘油、胆碱和磷酸盐。甘油与硫酸氢钾共热，可生成具有特殊臭味的丙烯醛；磷酸盐在酸性条件下与钼酸铵作用，生成黄色的磷钼酸沉淀；胆碱在碱的进一步作用下生成无色且具有氨和鱼腥气味的三甲胺。这样通过对分解产物的检验可以对卵磷脂进行鉴定。
四、实验组织运行要求
根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验进行”的组织运行模式。
五、实验条件
1、实验材料：鲜鸡蛋
2、仪器与器皿：蛋清分离器、恒温水浴锅、蒸发皿（每组一个）、漏斗（每组一个）、铁架台、磁力搅拌器（每组一个）、天平、25mL量筒（每组一个）、100mL量筒（每组一个）、干燥试管（每组四支）、玻棒2支、小烧杯大小各2个。
3、试剂：95％乙醇（每组50mL）、乙醚（每组20mL）、丙酮（每组30mL）、ZnCl2、无水乙醇（每组40mL）、滤纸（2张）、10%氢氧化钠（每组30mL）、3% 溴的四氯化碳溶液（每组10mL）、红色石蕊试纸（每组二张）、硫酸氢钾（每组10mL）、钼酸铵溶液（每组10mL, 钼酸铵试剂将6g 钼酸铵溶于15mL 蒸馏水中，加入5mL 浓氨水，另外将24mL 浓硝酸溶于46mL的蒸馏水中，两者混合静置一天后再用）。
六、实验步骤
1）、卵磷脂的提取
方法一、蛋黄10g放入洁净的带塞三角瓶中，加入95%乙醇40ml，搅拌15min后，静置15min；然后加入10ml的乙醚，搅拌15 min后，静置15min；过滤；滤渣进行二次提取，加入乙醇与乙醚(体积比为3：1)的混合液30ml，搅拌、静置一定时间；第二次过滤，合并二次滤液，加热浓缩至少量，加入一定量丙酮除杂，卵磷脂即沉淀出来，即得到卵磷脂粗品。
方法二、称取10g 蛋黄于小烧杯中，加入温热的95%乙醇30mL，边加边搅拌均匀，冷却后过滤。如滤液仍然混浊，可再次过滤至滤液透明。将滤液置于蒸发皿内，于水浴锅中蒸干（或用加热套蒸干，温度可设140℃左右），所得干物即为卵磷脂。
（为了减少或尽可能不用乙醚，实验采用方法二）
2）、卵磷脂的纯化
取一定量的卵磷脂粗品，用无水乙醇溶解，得到约10% 的乙醇粗提液，加入相当于卵磷脂质量的10% 的ZnCl2水溶液，室温搅拌0.5h；分离沉淀物，加入适量冰丙酮（4℃）洗涤，搅拌1h，再用丙酮反复研洗，直到丙酮洗液为近无色止，得到白色腊状的精卵磷脂；干燥；称重。
3）、卵磷脂的溶解性试验
卵磷脂的溶解性：取干燥试管，加入少许卵磷脂，再加入5mL 乙醚，用玻棒搅动使卵磷脂溶解，逐滴加入丙酮3～5mL，观察实验现象。
4）、卵磷脂的鉴定
4.1 三甲胺的检验
取干燥试管一支，加入少量提取的卵磷脂以及2～5mL 10%氢氧化钠溶液，放入水浴中加热15min，在管口放一片红色石蕊试纸，观察颜色有无变化，并嗅其气味。将加热过的溶液过滤，滤液供下面检验。
4.2 不饱和性检验
取干净试管一支，加入10滴上述滤液，再加入1～2滴3% 溴的四氯化碳溶液，振摇试管，观察有何现象产生。
4.3 磷酸的检验
取干净试管一支，加入10滴上述滤液和5～10滴95%乙醇溶液，然后再加入5~10滴钼酸铵试剂，观察现象；最后将试管放入热水浴中加热5～10min，观察有何变化。
4.4 甘油的检验
取干净试管一支，加入少许卵磷脂和0.2g 硫酸氢钾，用试管夹夹住并先在小火上略微加热，使卵磷脂和硫酸氢钾混熔，然后再集中加热，待有水蒸气放出时，嗅有何气味产生。
七、思考题与作业
1) 卵磷酯的用途？
卵磷脂是生命的基础物质，存在每个细胞中，更多的是集中存在于脑及神经系统、血液循环系统、免疫系统以及肝、心、肾等重要器官中。卵磷脂也被称为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”。蛋黄卵磷脂可将胆固醇乳化为极细的颗粒，这种微细的乳化胆固醇颗粒可透过血管壁被组织利用，而不会使血浆中的胆固醇增加。具体的功能有：
(1) 保护肝脏：磷脂中的胆碱对脂肪有亲和力，若体内胆碱不足，则会影响脂肪代谢，造成脂肪在肝内聚集，形成脂肪肝甚至发炎肿胀。卵磷脂不但可以用于预防脂肪肝，还能促进肝细胞再生，也可降血清胆固醇含量，防止肝硬化并有助于肝功能的恢复。
（2）健康心脏： 卵磷脂能调节胆固醇在人体内的含量、有效降低固醇，高血脂对心脏人冠心病的发病率，对心脏健康有积极作用。
（3）有益大脑：对人的记忆力和婴儿智力发育很重要。
（4）清洁血管：卵磷脂具有乳化、分解油脂的作用，可增血液循环，改善血清脂质，清除过氧化物，使血液中胆固醇及中性脂肪含量降低，减少脂肪在血管内膜损伤。服用卵磷脂对高血脂和高胆固醇具有显著的功效，因而可预防和治疗动脉硬化症。
（5）调整血糖：磷脂不足会使胰脏机能下降，无法分泌充分的胰岛素，不能有效地将血液中的葡萄糖运送到细胞中。服用卵磷脂对糖尿病的恢复相当显著。
（6）消融结石：体内过多胆固醇会发生沉淀，从而形成胆结石，胆结石90%是由胆固醇组成。胆汁中主要成分是卵磷脂，可将多余的胆固醇分解，消化及吸收，使胆汁中的胆固醇保持液体状。
（7）神经发育： 卵磷脂可促进大脑神经系统与脑容积的增长、发育。
（8）养颜润肤： 人体内含有许多毒素，含量过高会随血液循环沉积皮肤上卵磷脂能分解体内过多的毒素，并经肝脏和肾脏的处理排除体外。卵磷脂还有一定的亲水性，并有增加血红素的功能，能为皮肤提供充分的水分和氧气，使皮肤变得光滑柔润。
（9）延缓衰老：脑部的神经传导物质（乙酰胆碱）减少是引起老年痴呆的主要原因，乙酰胆碱是神经系统信息传递时的必要化合物。且“胆碱”是卵磷脂的基本成分，卵磷脂的充分供应将保证机体内有足够的胆碱与人体中的乙酰结合为“乙酰胆碱”，从而成为大脑提供充分的信息传导物质，大脑能直接从血液中摄取卵磷脂及胆碱，并很快转化为乙酰胆碱。
（10）调剂心理：经常补充卵磷脂，可使大脑神经及时得到营养补充，保持健康的工作状态，利于消除疲劳，激化脑细胞，改善因神经紧张引起的急躁、易怒，失眠等症。
2）医药工业中制备卵磷酯的方法？
(1)方法一：溶剂法（纯度较低且不适合大规模工业化生产）
该工艺利用卵磷脂在不同溶剂中的溶解度差异来萃取卵磷脂。如：先将蛋黄与丙酮充分混匀，静置后充分去丙酮层，将所余物料与乙醇充分混匀，静置后取出乙醇层，蒸发脱去乙醇后即得卵磷脂产品。
（2）方法二：乙醇溶剂萃取+超临界二氧化碳萃取法（纯度较高且比较适合大规模工业化生产）第一步用有机溶剂（乙醇）萃取蛋黄粉，得到中性脂质、卵磷脂和乙醇的液体混合物，用减压蒸馏将乙醇除去，得到含磷脂的蛋黄脂质。第二步用SC_C将蛋黄脂质中的中性脂质除去，最后剩下的就是高纯度的卵磷脂。
3）本实验有哪些步骤可以改进？
（1）做卵磷脂的溶解性试验时，丙滴加的量适当增加，现象会比较明显。
（2）利用95%乙醇粗提取卵磷脂时，可以分三次提取，效果较佳。
（3）三甲胺的检验时，氢氧化钠溶液的浓度或者用量可尝试改变，以使检验现象比较明显。
4）文字与照片记录实验过程的重要性？
可以使实验过程更加直观，使实验思路更加清晰，实验结果更明了。
5）通风橱的重要性？（可以不作答）
八、实验报告
实验步骤
一 卵磷脂的提取：
（用蛋清分离器分离出蛋黄，取10g左右的蛋黄）
（加入温热的95%乙醇30mL，边加边搅拌均匀）
（过滤）(将滤液置于蒸发皿内,用加热套蒸干，温度可设140℃) （所得干物即为卵磷脂，为黄色物质）
二 卵磷脂的纯化：
（取一定量的卵磷脂粗品，无水乙醇溶解，得到约10% 的乙醇粗提液，加入相当于卵磷脂质量的10% 的ZnCl2水溶液）室温搅拌0.5h；分离沉淀物（留下黄色的沉淀物）冰丙酮（4℃）洗涤，搅拌1h再用丙酮反复研洗，洗液为近无色止得到白色腊状的精卵磷脂；干燥；称重。
三 卵磷脂的溶解性试验；
取干燥试管，加入少许卵磷脂，再加入5mL 乙醚，用玻棒搅动使卵磷脂溶解，逐滴加入丙酮3～5mL
实验现象：加入丙酮后可明显看到烧杯中会不断形成白色絮状物质生成，到了一定的量也后，沉淀不会再增加）
四 卵磷脂的鉴定：
41． 三甲胺的检验
取干燥试管一支，加入少量提取的卵磷脂以及2～5mL 10%氢氧化钠溶液，放入水浴中加热15min，在管口放一片红色石蕊试纸，观察石蕊试纸变蓝，气味有一种腥味。

4.2 不饱和性检验
取干净试管一支，加入10滴上述滤液，再加入1～2滴3% 溴的四氯化碳溶液，振摇试管，
实验现象；出现分层，溴的四氯化碳在下面，呈油滴状
4.3 磷酸的检验
取干净试管一支，加入10滴上述滤液和5～10滴95%乙醇溶液，然后再加入5~10滴钼酸铵试剂，观察现象；最后将试管放入热水浴中加热5～10min，
实验现象：加热前溶液浑浊，加热后溶液变澄清了
甘油的检验
取干净试管一支，加入少许卵磷脂和0.2g 硫酸氢钾，用试管夹夹住并先在小火上略微加热，使卵磷脂和硫酸氢钾混熔，然后再集中加热，待有水蒸气放出时，嗅有何气味产生。

实验现象
有刺激难闻的气味产生，像是烤猪皮味
九、注意事项
1）注意安全：本实验中的乙醚、丙酮及乙醇均为易燃药品。氯化锌具腐蚀性。
2）实验过程要细致，培养耐心。
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