miRNA的作用机制及功能研究进展.doc

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中国科学 C辑:生命科学 2009年 第39卷 第1期: 109 113 109 《中国科学》杂志社 SCIENCE IN CHINA PRESS MicroRNA作用机制研究的新进展 赵爽 刘默芳 中国科学院上海生命科学研究院 生物化学与细胞生物学研究所 分子生物学国家重点实验室 上海 200031 联系人 E-mail: 收稿日期: 2008-09-04 接受日期: 2008-11-28 国家重点基础研究发展计划批准号: 2005CB724603和国家自然科学基金批准号: 30770474资助项目 摘要 microRNAmiRNA是一种非蛋白质的新型基因表达调控因子 对真核生物基因表达起非常重要的调控作用. 关于miRNA的功能及作用机制方面的研究是当前生命科学研究的前沿热点 研究人员陆续提出了一些假说模型 诸如翻译起始抑制、翻译起始后抑制、mRNA降解、P小体Processing Body SGStress Granules颗粒扣押靶mRNA等来阐述miRNA 如何抑制其靶基因的表达. 此外 最近还有文献报道了一些全新的miRNA作用方式 如去抑制和miRNA 激活作用等. 本文将简要介绍一些miRNA作用机制研究的新进展及相关作用模型. 关键词 miRNA 负调控 去抑制 正调控 P小体 SG颗粒 准确的基因表达调控对生物体的生长发育和功能至关重要 基因表达调控异常是疾病发生的主要原因. 在过去的数十年间 对基因表达调控的研究主要集中在蛋白质转录因子介导的基因表达调控方面. 研究发现 它们通过激活或抑制基因转录控制基因的表达 在基因组信息转化为分子效应和生物效 应过程中发挥着重要的作用. 最近 在动、植物及病毒等生物中发现了一系列小分子非编码RNA small noncoding RNA 包括miRNAmicroRNA siRNA small interfering RNA piRNApiwi-interacting RNA和esiRNA endogenous siRNA等 它们分别在转录水平、转录后水平及表观遗传水平等方面控制基因的表达 组成了RNA 调控网络 调控包括细胞增殖、分化和凋亡等一系列生理进程 影响生物体的生长发育 并与多种人类疾病的发生密切相关1. 这些小分子RNA的发现 揭示了真核生物一种新的基因表达调控方式. miRNA是小分子非编码RNA家族的重要成员. miRNA与siRNA共用生成途径和作用途径中多种蛋白质因子. 但二者也有一些明显的区别 如siRNA主 要是由外源提供的小分子RNA 通过引发靶mRNA的切割负调控靶基因的表达 而miRNA是基因组编码的内源性小分子RNA 通常在翻译水平负调控靶 mRNA的表达. miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ或/和Ⅲ 转录23. 动物miRNA加工成熟一般需要两个RNase Ⅲ家族酶——Drosha和Dicer参与. 最近发现AgoAr- gonaute蛋白在miRNA加工成熟中也发挥作用4. miRNA调控是通过RNA诱导基因沉默复合物RNA- induced silencing complex RISC完成的 复合物的核心成员是Ago 家族蛋白 还有一些功能未知、非RISC核酸酶活性必需的蛋白成分 如FXRP RNA 解旋酶等 也存在于复合物中56. 通常认为 miRNA与Ago1结合 组成miRNA效应器复合物miRNA- RISC miRISC 执行靶mRNA翻译抑制 而siRNA与Ago2结合 组成siRISC 执行靶mRNA降解7. 最近有人对这种miRNA/siRNA分选模型进行了校正 认为miRNA/siRNA都可以被Ago1或Ago2结合89 这为miRNA介导切割提供了可行性. 过去认为Dicer生产的miRNA: miRNA双链 miRNA作为向导链被组装入miRISC 互补链miRNA则被迅速降解. 但最 赵爽等: MicroRNA作用机制研究的新进展 110 近研究发现 虽然miRNA种类不如对应的miRNA丰富 但它们常常以适当的生理水平存在 并同样可以被Ago蛋白结合10. miRNA主要是通过5′端被称为种子序列Seed Sequence的7 nt序列与位于靶mRNA 3′UTR的miRNA调控元件miRNA Regulatory Element MRE相互作用 识别靶mRNA11. 一些靶mRNA 的其他特征 如MRE附近富含AU序列、靶mRNA与miRNA的1316位碱基配对、MRE距离终止密码子15 nt以外、不位于长3′UTR的中间、邻近共表达miRNA的识别位点等 可增加miRNA的作用效率12. miRNA与靶mRNA之间的配对程度决定了miRISC抑制靶mRNA的方式: 高度配对的miRNA 如大部分植物miRNA 将通过类似于siRNA的作用机制 导致靶mRNA切割和降解 相反 在动物中大部分miRNA与靶mRNA不完全配对 则可能是通过翻译抑制发挥作用. 在过去的几年间 研究者陆续提出了一些不同的、甚至互相矛盾的假说模型 来解释miRNA如何抑制其靶基因表达. 但对miRNA准确的作用机制 目前还没有统一的观点. 本文将简述miRNA 作用机制研究的新进展及miRNA的一些新功能. 1 miRNA翻译起始抑制机制 关于miRNA翻译起始抑制机制目前主要有3种观点: 第一种观点认为miRNA可能通过抑制全能性核糖体的组装而阻断翻译起始13. 因为研究发现被miRNA沉默的mRNA没有或鲜有偶联完整的核糖体 部分研究者认为miRNA可能通过抑制全能性核糖体的组装而阻断翻译起始13. 这种观点被至少两个新近的证据支持: Thermann等人14在一个体外研究中发现 果蝇的miR-2抑制全能性核糖体的前体-48S翻译复合物的组装 该复合物添加60S亚基后即形成全能性核糖体 Chendrimada等人15发现 EIF6是一种可以抑制核糖体40S和60S亚基结合、阻断80S全 能性核糖体形成的蛋白 与Ago/RISC直接相互作用 并且在哺乳动物和线虫中 缺失EIF6影响miRNA介导基因沉默. 然而 RISC是否通过与EIF6相互作用诱导40S和60S核糖体解聚还有待于进一步的研究. 第二种观点根据miRNA 抑制要求靶mRNA m7G 帽子的存在 认为miRISC 可能抑制翻译起始复合物的形成1316. 这个假说最近也找到了一些新证据: 研究者在一个体外系统中发现 增加eIF4F复合物含有m7G 帽子结合蛋白、翻译起始因子eIF4E水平可回复miRNA翻译抑制17 与之一致的是 另一个研究组18发现 Ago2中间结构域类似于eIF4E 具有结合m7G 帽子的活性 推测经miRNA招募到靶mRNA 3′UTR的Ago2 与起始复合物eIF4E/G竞争结合m7G帽子 从而抑制翻译起始复合物的形成. 此外 miRNA还可能通过阻止polyA结合蛋白poly A binding protein PABP 与mRNA结合影响翻译起始. Wakiyama等人19发现 miRNA引起靶mRNA脱腺嘌呤反应deadenylation 导致 mRNA的polyA尾巴缩短 但mRNA的稳定性似乎并不受影响 只是polyA 尾巴缩短使PABP结合mRNA受阻 从而影响了翻译起始. 2 miRNA翻译起始后抑制 虽然上述证据支持miRNA抑制翻译起始 但也有研究发现 一些被miRNA抑制的mRNA与翻译活跃性的多核糖体偶联 说明有一些miRNA的抑制作用不是发生在翻译起始2021. 此外 Petersen等人22发现 经内部核糖体进入位点Internal Ribosome En-try Site IRES起始、不依赖于mRNA m7G帽子的翻译也可以被miRNA抑制 这进一步证明miRNA抑制是发生在翻译起始之后. 虽然这些研究证明了miRNA沉默作用确实是发生在翻译起始后、新生多肽完成前 但关于miRNA究竟如何在翻译起始后发挥抑制作用 目前还没有一致的结论. 研究者推测 miRNA可能引起新生多肽链的翻译同步降解21 或者是在翻译延伸过程中 miRNA引发大量的核糖体脱落及高频次的翻译提前终止 产生的不完整多肽产物则被迅速降解22. 3 miRNA介导mRNA衰减 Wu等人23首先发现 miRNA可以诱导与之不完全配对靶mRNA的衰减 下调靶mRNA的水平. 这种miRNA诱导mRNA衰减的作用机制被随后的证据所支持24 如在斑马鱼的早期胚胎发育中 miR-430控制母本mRNA的代谢 表明miRNA介导的mRNA衰减机制具有生理学意义25. 与之一致的是 Ago蛋白被发现定位于细胞中降解mRNA的RNA颗粒RNA 中国科学 C辑: 生命科学 2009年 第39卷 第1期 111 granules 如P小体processing bodies中 这些RNA颗粒中包含常规的mRNA降解酶 如脱腺嘌呤酶、脱帽酶、核酸外切酶等 提示这些mRNA降解酶可能参与miRNA介导的mRNA衰减2627. 此外 miRISC的核心成分——Ago家族蛋白有多种异构体 其中一些成员的内切酶活性也可能协助miRNA介导的mRNA的切割和/或衰减2428. 总之 这些证据都表明 miRNA可以直接或间接介导靶mRNA的降解 这改变了最初认为的miRNA调控仅翻译抑制作用的观点. 4 RNA颗粒扣押、降解或储存靶mRNA 胞浆的RNA 颗粒 如P小体和SGStress Gran-ules颗粒 在转录后水平的基因表达调控中具有重要的作用 它们是细胞储存处于翻译抑制状态mRNA 的场所. 在此 mRNA被降解或/和释放重新进入翻译机器29. P小体含有多种mRNA衰减机器的组分 被认为是细胞的mRNA代谢场所 SG 颗粒特异性地在受胁迫条件下形成 因此被命名为胁迫颗粒Stress Granule. 从组成成分看来 SG颗粒更倾向于沉默mRNA翻译 而不降解mRNA. P小体和SG颗粒常常彼此并列 动态关联 二者含有一些相同的组分 如帽子结合蛋白eIF4E 和翻译抑制子rck/p54 但它们的成分并不完全相同 暗示可能有功能差别. 因为发现它们与miRNA作用相关联 可能是miRNA的胞内作用场所 这两种RNA颗粒最近受到特别关注. 一些证据表明 在miRNA存在下 miRISC中的核心组分及与miRISC结合的mRNA定位于P小体和SG颗粒中262730. 而且 有证据表明 P小体的形成与RNA 沉默相关联 抑制P小体的形成将抑制miRNA介导的翻译抑制 反过来 抑制RISC也同样抑制P小体的形成 更值得注意的是 一些研究证明 siRNA/miRNA都可以在哺乳动物细胞和果蝇细胞中诱导P小体的形成31. 鉴于P小体和SG颗粒的内在联系 可以推测P小体和SG颗粒可能执行相互联系但又不同的功能. 推测被miRISC结合的mRNA进入P小体和SG颗粒中 即被这些RNA颗粒中的翻译抑制子剥夺了与核糖体和翻译机器结合的可能性 从而使mRNA处于翻译抑制状态 达到了基因沉默的目的. 但是 扣押的mRNA下一步命运如何尽管不少的证据支持miRNA介导靶mRNA的衰减 但也发现 在很多情况下 miRNA仅降低了靶基因的蛋白水平 靶基因的mRNA水平却无明显变化. 这使得我们有理由推测 在靶mRNA被扣押到RNA颗粒解除翻译后 可能随即会进行一个mRNA 衰减或储存的分拣步骤. P小体和SG颗粒极有可能分工执行mRNA降解和储存功能. 在某些胁迫条件下 miRISC结合的mRNA是否有可能首先被送到SG 颗粒 被抑制翻译和临时储存 然后在细胞估算mRNA确实已过量后再转运到富含mRNA代谢酶的P小体中进行降解事实上 在miRNA存在下 Ago蛋白与SG颗粒呈动态联系 SG颗粒中的酶发挥翻译沉默而不是mRNA衰减的作 用30. 还有研究发现 一些诱导SG颗粒形成的胁迫作用确实减少了P小体的形成和mRNA衰减32. 但目前还不清楚miRISC偶联mRNA在胁迫条件下聚积到SG颗粒中的生理作用是什么. 5 miRNA正调控和去抑制 最近的研究发现了一些新型的miRNA作用方 式 如miRNA正调控和去抑制等. 首先 Vasudevan实验室33�6�535发现 miRNA不总是基因表达的负调控因子 在一些条件下 miRNA也上调基因表达. 他们发现 在细胞周期过程中 miRNA效应在抑制作用和活化作用间摆动. 在静态细胞中G0期 miRNA活化翻译和上调基因表达 而在其他细胞循环/增殖期则继续发挥抑制作用35. miRNA激活作用与富含腺嘌呤/尿嘧啶元件AU rich element ARE相关33. ARE是miRNA活化翻译的信号 在miRNA指导下 miRISC复合物成员如Ago FXRP被招募到ARE上 激活翻译、上调基因表达34. ARE元件是一种mRNA不稳定元件 位于mRNA 3′UTR 严重影响其宿主mRNA的稳定性. 研究已发现ARE元件介导的mRNA 衰减调控与miRNA介导的mRNA衰减调控有多种联系36. 另外 最近研究发现 在一些条件下 miR-10a也正调控基因表达. miR-10a结合到核糖体蛋白mRNA 5′UTR 促进其翻译 提高核糖体蛋白合成 从而刺激核糖体生成 进而正调控总蛋白质的合成37. 研究发现 miRNA的抑制作用是可逆的 一些RNA 结合蛋白可能在这一过程中发挥重要作用38. 在人体细胞中观察到 胁迫条件下 被miRNA 抑制 赵爽等: MicroRNA作用机制研究的新进展 112 的mRNA可以去抑制 重新进入翻译机器 HuR 一个ARE元件结合蛋白 可能通过促进miRISC-靶mRNA复合体解离和P小体解聚 去除miRNA的抑制作用39. 另一个RNA结合蛋白Dnd1 在生殖系细胞中与miRNA紧密联系 它可能通过结合在mRNA的U丰富区U-rich mRNA region 屏蔽miRNA的结合位点 阻止miRNA接近靶mRNA 解除miR-430家族的抑制效应40. 最近 Sandberg等人41还报道了一种逃避miRNA抑制的新方式. 他们发现 一些在增殖细胞中表达的mRNA 3′UTR保守性地缩短 导致miRNA的靶位点减少 从而避免了miRNA的负调控作用. 本实验室对miR-155与它的一个靶基因在部分乳腺癌中同时高表达的原因进行了调查 发现在一个乳腺癌样本中 该mRNA与miR-155种子序列配对的第8位A可能通过RNA编辑被转变成I/G 导致该靶基因不再受miR-155的抑制 提示RNA编辑也可能在miRNA的去抑制中发挥作用未发表资料. 总之 这些新的miRNA调控方式 改变了我们过去将miRNA等同于基因表达负调控因子的观点 提示miRNA的调控作用具有多样性 可能被动态调 节. 这些新的miRNA作用方式扩大和加深了我们对miRNA调控作用的认识和理解. 6 小结和展望 众多的证据表明 在不同条件下 miRNA确实以 不同的作用机制抑制靶基因表达. 然而 目前还不知道miRNA究竟是如何选择沉默的机制或通路的 这可能由特定的miRNA和靶基因 或特定的组织和细胞来决定的 也可能受控于不同的信号通路. 同样 还有以下问题需要回答: miRISC中其他成分和辅助因子的作用是什么 miRISC结合的靶mRNA是如何分选为衰减和储存的 在胁迫条件下 miRISC结合的靶mRNA聚积到SG颗粒中的生理作用是什么 胞浆中的RNA颗粒是如何形成的 细胞中有多少种与miRNA沉默作用相关的RNA颗粒 这些颗粒的组成成分是什么 这些问题的答案将使我们更全面、更准确地了解miRNA的作用机制. 对新型小分子非编码RNA的发现及机制的研究将是非编码RNA研究领域的重要发展方向. 目前 我们对miRNA的调控作用已有一定的认识 但对其他几种内源小分子非编码RNA 如piRNA esiRNA等的功能和作用机制还知之甚少. 在过去的一年多 本研究组致力于piwi-piRNA相互作用的研究 初步的研究结果表明 piRNA可能通过调控组蛋白乙酰化修饰在表观遗传学水平调控基因表达 同时可能参与细胞周期的调控未发表资料. 非编码RNA是后基因组时代重要的科学问题 阐明小分子非编码RNA的功能和作用机制将有助于我们深入了解基因组的表达调控. 参考文献 1 Guarnieri D J Dileone R J. 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