SNP开发验证的研究方法和技术路线.doc

SNP开发/验证的研究方法和技术路线
1分子标记：
分子标记，我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。现在，我们没有任何可用的标记检测我们的定位材料。即使想要验证已经定位的QTLs，我们也需要相相应的区间内的分子标记，特别是SNP标记。
1.1 全基因组SNP—Affymetrix芯片：
一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简朴，高通量。可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。在国家玉米改良中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常可以用来QTLs初定位，育种材料的群体划分与纯度鉴定以及低密度的关联分析等。在此，我建议我们应当开发一套番茄基因型检测的芯片。
目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720条探针。而Affymetrix公司目前并没有相应的产品。但是通过跟Affymetrix公司了解，可以运用Illumina芯片已有的结果进行开发。
番茄目前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为~2,500Mb，但是他们涉及的基因数目~30,000个，整体情况相近。此外，番茄作为自交植物，其LD的衰减值应当更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低。因此，综合考虑，我建议我们可以开发~3k芯片，应当可以满足大多数研究材料、育种材料的基因型检测需求。虽然目前下一代测序技术蓬勃发展，但是对于用于基因型检测来讲，其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。总之，我们番茄处在刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面，芯片有其很高的应用价值。即使像玉米，这样测序技术发展很数年的材料，芯片技术也在应用。
1.2全基因组SNP—Douglas：
当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并完毕基因型分析之后，1）对于优良的QTLs或是基因，我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运营Douglas系统进行分子标记辅助育种，2）对于需要进一步验证的QTLs，我们也可以运用Douglas系统只检测材料覆盖定位区间的基因型，而不需要再一次运用Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图1.1）。3）对于一些高信息量，均匀分布在全基因的SNP分子标记，可以用来构建番茄的指纹图谱。因此，一套完整可以与Affymetrix芯片相相应的SNP标记是必不可少的。

图1.1 QTL区间上的SNP标记分布图
注：蓝色为进一步片段，棕色为背景染色体。
1.3 Douglas系统下SNP标记的开发
通过建立稳定、可靠的番茄DNA提取流程与优化PCR反映体系，筛选具有一致性、稳定性与多态性SNP分子标记引物，从而构建番茄全基因组SNP分子标记。全基因组的SNP分子标记，可以用于番茄QTL定位群体的检测，分子标记辅助育种的选择以及全基因组选择的群体基因型的检测。同时，从中挑选高质量，高信息量的分子标记用于构建一套完毕的番茄指纹图谱，检测品种一致性。
1.3.1 供试材料：
22份材料的DNA用作特异性引物筛选，2份水作为NTC（None Template Control），共计24份模板作为SNP引物的初期筛选。以上实验在Q6仪器上进行。
对于筛选获得的一致性引物，在运用94株番茄自交系与2份水作为模板，进一步在Douglas仪器上验证。
1.3.2 DNA提取：
1. 取~10mg 植物组织，加入研磨介质和400μl 裂解液，研磨5min，3000g离心5min。
2. 加入裂解液1/3 体积的提取液，旋涡振荡混匀，冰浴（或置于-20℃冰箱中）5min，于4℃，3200×g 离心10min，吸取上清300~400μl 加入到样品板中。
3. 按照下表在各96 孔板中加入试剂：
板号
板型
板名
成分
样品及试剂体积
1
Microtiter deep well 96plate
样品板（Lysis）
样品反映液
无水乙醇
300~400μl
400μl
2
Microtiter deep well 96plate
洗涤板I（W1）
PW
磁珠
800μl
30μl
3
Microtiter deep well 96plate
洗涤板II（W2）
80%乙醇
磁套
800μl
4
KingFisher 96 KF plate
洗脱板（Elution）
TE1.0
50~100μl
4. 将各96 孔板按仪器提醒顺序放入仪器中，运营程序。
5. 程序运营结束后，将DNA 溶液转移PCR 板中并测量浓度（>100ng/μl），进行后续实验或于-20℃保存待用。
1.3.3 分子标记命名：
分子标记所有采用统一的命名规则，这样有助于结果的修改与维护。例如：
名称
ID
SNP位点
正向引物
反向引物
模板序列
SolBeckman-00001-V1
Sol00001
A/G

引物合成：由上海生工公司负责引物合成。
1.3.4 SNP分子标记的开发：
最近，Sim等人运用番茄的Illumina芯片检测410份自交系与16份番茄品种的基因型。本研究在此基础上，运用Illumina开发的7,720条探针序列，选择其中丢失频率小于10%，等位基因频率大于10%的探针序列，获得~3,500条探针序列，作为SNP引物开发的模板序列（），每条序列的长度为~100bp，SNP 上下游各50bp。
初期，我们可以从~3500条探针中，选取~120探针序列作为模板发展引物，这120条序列规定分布在12条染色体上并且在每条染色体上尽量保证均匀分布。假如实验成功，我们可以逐步地将剩余的探针序列发展成为SNP引物。
1.3.5正向引物设计：
由于我们需要使用KASP基因分型检测试剂盒，本试剂盒对正向引物已经拟定为SNP位点上游~20bp（涉及SNP位点），同时需要人工加上FAM或是HEX序列（图1.2）。因此，我们需要单独设计反向引物。

图1.2 正向引物设计
1.3.6反向引物设计：
运用Primer3.0软件对模板序列进行引物选择，引物参数设定如下：
1 引物长度为18~25bp；
2 GC含量为40~60%；
3 TM值58~62°C。
假如其上述模板序列局限性以满足引物开发的需要：我们可以运用剩余~4,200条探针，继续开发新的引物。此外，我们还可以运用PCR产物测序的方式获得gap中序列，寻找新的SNP位点。
1.3.6 PCR反映：
PCR反映体系：PCR反映体系需要保证均一化，这样可以满足将来在Douglas系统下进行SNP检测。初期我们会在Q6仪器上进行预实验，摸索一致后，再在Douglas系统中进行。
Primer Mix反映体系：
名称
体积（μl）
FAM-Primer
12
HEX-Primer
12
Reverse-Primer
30
ddH2O
46
Total
100

PCR反映体系：
名称
体积（μl）
Reaction Mix
2.5
Primer Mix
0.7
ddH2O
0.8
DNA
1
Total
5
1.3.7 PCR反映程序：
我们的PCR产物应当都为<100bp，因此我们可以采用统一设定，保证均一化。采用两步法进行PCR反映，前期筛选引物我们设计3个复性梯度：60°C、57°C以及55°C，以便找到最合适的复性温度。
一方面，运用60°C的复性温度进行筛选：
环节
参数
意义
1
25°C 1:30min
反映前收集荧光
2
94°C 10min
预变性
3
94°C 15s
变性
4
60°C 1min
复性，延伸
5
3-4反复40个循环

6
25°C 1:30min
反映完收集荧光
假如SNP引物在60°C复性温度时扩增结果正常，则保存该引物在60°C复性进行PCR反映。假如得到引物扩增效果不好，则减少复性温度，运用57°C进行复性。
57 °C复性温度PCR反映程序筛选：
环节
参数
意义
1
25°C 1:30min
反映前收集荧光
2
94°C 10min
预变性
3
94°C 15s
变性
4
57°C 1min
复性，延伸
5
3-4反复40个循环

6
25°C 1:30min
反映完收集荧光
假如SNP引物在57°C复性温度时扩增结果正常，则保存该引物在57°C复性进行PCR反映。假如得到引物扩增效果不好，则减少复性温度，运用55°C进行复性。最终，假如55°C复性温度时，反映结果不好，则该SNP引物剔除去掉。
55°C复性温度PCR反映程序筛选：
环节
参数
意义
1
25°C 1:30min
反映前收集荧光
2
94°C 10min
预变性
3
94°C 15s
变性
4
55°C 1min
复性，延伸
5
3-4反复40个循环

6
25°C 1:30min
反映完收集荧光

1.3.8 SNP分子标记准确性验证：
对于已在21份模板DNA扩增稳定的SNP引物，需要进一步在大群体中验证其稳定性、一致性、多态性。选择84份番茄自交系或品种的DNA，通过相同的PCR方法，验证新开发的SNP分子标记。
1.3.9目的规定：
番茄全基因组SNP标记：在番茄的全基因上，我们获得1200对特异的SNP引物（平均100对/染色体）覆盖番茄的全基因组。已获得在12份模板DNA可以稳定扩增的SNP分子标记，所有保存。
2分子标记辅助育种：
2.1 ILs群体：
假如运用现在群体不再进一步构建亚群体，ILs群体（L pennellii渐渗系群体）~76个自交系，整个群体数目较小，不利于定位及QTLs验证（图2.1）。但是对于这些材料的渗入片段都已经注视清楚，因此我们可以直接比较进一步系与M82自交系的表型差异，假如存在显著性差异，则可以定义为有进一步片段引起的表型差异。当鉴定结果与已定位的QTLs信息一致时，我们就认为此QTL在区间内。同时我们要检索此QTL定位时的位置，以此为基础发展SNP标记，用于以后分子标记辅助育种。
对于每个QTL的区间，需要发展4~8个SNP标记覆盖其定位区间（图1.1），其中，区间外两段各一个标记，内部2~6个SNP标记。这样可以保证目的QTL被完整的应用。SNP标记的开发，此时的SNP标记只需要在ILs群体的两个亲本中有多态性就可以应用。引物设计同全基因组SNP引物设计相同。
性状验证：对于拟定的QTLs，我们需要开发相应的SNP标记，运用这些标记重新验证定位结果：

图2.1 进一步系材料的基因型
2.2 IBLs群体：
IBLs群体自身就是分离群体，因此可以直接用作定位（图2.2）。假如该群体基因型已经被鉴定，我们可以直接运用鉴定的基因型结合我们自己调查的表型，获得QTL初定位的结果。同时，运用Affymetrix芯片进行全基因组的SNP检测，然后与表型数据相结合进行分析。然后，需要查看定位的QTL区间内是否存在3 Douglas系统下SNP标记，假如满足分子标记辅助育种的应用，可以直接应用。假如QTL区间内的没有或是过少的SNP标记，则需要重新开发SNP标记（标记开发同上）。

图2.2 IBLs群体构建
2.3性状调查：
从我的观点出发，对于分子育种比较有价值研究的QTL，应为育种家需求的性状所相应的QTL。我认为我们需要跟番茄育种家合作并讨论育种需求与育种目的。
鉴于目前ILs群体定位情况（表1，表2），我认为我们可以从中选择一些我们可以鉴定测量的性状进行研究，例如：糖分，可溶性固形物的含量，果实形状与大小等。总之我们要可以测量这些性状。
同时，对于需要研究性状，我们需要对其进行界定，比假如实大小，我们需要测量成熟后几天的果实，作为统一的鉴定。以保证性状测量的准确性。

为了可以获得准确的田间实验数据，应当采用良好的田间实验设计。在此，建议：现有的两个群体材料都为永久性群体，一般可以采用随机区组或是裂区设计，每个系2~3个反复，鉴定表型。因此我认为我们应当进行田间实验设计，保证表型数据的准确性。
3 SNP指纹图谱构建：
通过已经获得的全基因SNP分子标记，进一步可以从中挑选出稳定、一致的48对SNP分子标记构建番茄的指纹图谱。挑选参数为：
3.1 等位基因频率（Allele Frequency）
在一个二倍体的某特定基因座上某一个等位基因占该基因座上等位基因总数的比率，是群体遗传结构的一个最基本的尺度，该基因座上所有等位基因的频率之和为1，对于SNP分子标记，一般只涉及两种等位基因。因此，其等位基因频率在~0.5时为最适宜值。
3.2 多态性信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）：
多态信息量(Polytnorphism Information Content，PIC)由Botstein等在1980年提出，用来评价一个多态性基因座使用价值的一个量化概念。PIC由该基因座的等位基因数、等位基因频率分布两个因素决定。标记基因座的等位基因数越多、各等位基因频率分布越均匀，PIC越大。

i= 第j个分子标记中第i个等位基因
n =第j个分子标记的等位基因的数目。
p =等位基因频率
3.3 核心引物分组：
此外，还需要根据SNP分子标记在全基因上的分布进行筛选，规定4个SNP分子标记/染色体，并且规定其分子标记之间的距离越远越好。在玉米中，运用40对SSR引物构建指纹图谱，他们针对这40对引物提成两组。我们可以采用相同策略，将我们的48对引物提成两组，用于将来的检测。
4经费预算：
项目名称
单价
总价
PCR引物
1元/碱基

PCR 反映试剂盒

DNA 提取试剂盒