浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究.doc

酿 酒
HQUOR MAKING
V01．30．No．2
Mar．， 2OO3
文章编号：1002—8110(2023)02—0018一o4
浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究
王耀 ，范文来 ，徐岩2，刁亚琴 ，陆红珍
(1．江苏洋河集团有限公司，江苏宿迁223725；2．江南大学生物i程学院，江苏无锡214036)
摘要：对浓香型大曲的酯化酶测定方法作了研究。建立有机相反映体系来代替传统方法的水相反映，与传
统测定方法(需反映100h)相比，它能简朴、快捷检测大曲质量，适合工业化生产的规定。有机相中酯化反映
条件为：在30mL正庚烷有机反映介质中，35 的条件下，0．15M的底物酸，己酸与乙醇的浓度比为1：1．25，加
入15g(干曲)的大曲，仅用24h就能比较出大曲酯化力的高低。
关键词：浓香型，大曲，酯化酶，酯化，测定方法
中图分类号：TS262．31；TQ925 文献标记码：A ‘
0 前言
酯酶(Eaemse E．C．3．1．1．2)亦称羧基酯酶，是指可以水
解羧酯键的酶【lI4J。但该酶也能催化合成低档脂肪酸
酯Ll J。由于该酶既能催化酯的合成，也能催化酯的分解，因
此，白酒业习惯分别称为酯化酶和酯分解酶[5-7 J。酵母、霉
菌、细菌中均具有酯酶[ ，6． 。目前已经发现，红曲霉、根霉中
许多菌株有较强的己酸乙酯合成能力【5' 。
酯酶不同于脂肪酶。脂肪酶(缉磁e，E．C．3，1．1，3)是一
类特殊的酯酶，全称Tr／acy／g／ycerd acy／hydro／aseo脂肪酶的正
式名称是甘油酯水解酶。它既能将脂肪水解为脂肪酸和甘
油，又能催化脂肪的合成【5．9J。按Novo Nordisk公司的定义，
脂肪酶是可以水解一类特殊的酯类— —三羧酸甘油酯的酶，
而酯酶则是可以水解羧酯键的酶【111。
对大曲酯化力的研究开始于20世纪8o年代后期[12,13J，
但广泛和进一步的阐述大曲对浓香型酒生香的作用却是在20
世纪90年代[ 一 ·M一 刮。
传统的酯化力测定方法【6J，是运用皂化反映和反滴定法
来测定。此法测定期间长，操作复杂。本文研究了运用有机
相代替水相的酯化酶活力的测定。
0．1 传统酯化力的测定【6J 6
先用碱中和酯化液中的游离酸，再加入一定量的碱使酯
皂化，过量的碱用酸进行反滴定，用酚酞作为指示剂。其反
应式为：
RC00H +NaOH— ÷ RC00Na+ROH
2NaOH+ Sq— 一Na2S04+2H20
0，2 优化后酯化力测定方法的原理
近年来，酶在有机相中的生物催化作用因其潜在的工业
用途而日益受到人们的重视[117,18】。与水相催化相比，有机
介质可以增长酯酶的热稳定性，增长非极性底物的溶解度，
减少反映副产物，还也许影响酶的底物特异性及酶反映的平
收稿日期：2o03—01—16
衡方向和反映速度。有机溶剂相中酯化反映平衡点与速率
同溶剂中水含量密切相关，有机溶剂作为反映介质时，在一
个狭窄的初始含水量范围内，酶有较高的催化酯化活力。当
初始加水量较低时，酶分子由于不能获得形成活力构象所必
需的水，表现出较低的催化反映活力；当体系中水初始含量
高时，从物理状态来看，在反映的初始阶段酶粉即发生粘结，
产生吸附现象，无法均匀分散，故反映速率也减少。对本研
究而言，所加入的酶不是纯酯化酶，而是加入一定量的带水
分的大曲，大曲含水量在12％左右，此时反映体系中的含水
比例约为6％左右，这虽然高于一般反映介质的最佳含水
量【181，但仍处在微水范围。并且，反映所运用的酯化酶是从
大曲颗粒里浸出来的，酶量很少，加上曲粉的间隔作用，这样
的含水量是不会发生酶粘结现象的，因此采用无水有机溶剂
与试剂进行酯化力的测定方法是可行的。
现以正庚烷为有机溶剂来代替水相进行酯化力测定方
法的优化，以期在尽也许短的时间内鉴别出大曲酯化能力的
高低。由于大曲的酯化反映是可逆反映，因此不仅要优化条
件以保证酯化能力最强，同时还要保证在此条件下分解能力
最差，只有酯剩余量多的条件才是最适条件。
1 实验材料
1．1 大曲
1．1．1 粉碎
用微型植物粉碎机粉碎。筛孔~'lmm。
1．1．2 分样
采用四分法。通常样品需要量500 引。
1．1，3 大曲样品分类方法
见参考文献[23】。
1．2 试剂
1．2．1 正庚烷，AR级，每瓶试剂(500ⅡlL)加入3og无水硫酸
钠。
1．2，2 己酸，AR级，每瓶试剂(500ⅡlL)加入30g无水硫酸钠。
1．2．3 无水乙醇，AR级，每瓶试剂( )加入30g无水硫
酸钠。
1．2．4 pH4，6醋酸一醋酸钠缓冲液，配制方法见参考文
献【6J。
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第2期 王耀，等：浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究 ·l9 ·
1．2．5 100m~100mL己酸乙酯的20％(v／v)乙醇溶液，配制
方法见参考文献 。
1．3 仪器
恒温培养箱：上海恒三仪器厂。
2 测定方法
2．1 传统酯化力的测定方法具体见文献【6J。
2．2 优化后酯化力测定方法
影响己酸乙酯合成反映的因素有很多，做单因素分析实
验，对加入底物酸(己酸)与乙醇的浓度、加曲量和反映温度
等进行优化。每间隔一段反映时间，取出上清液0．2mL于
50mL三角瓶中，加入5mL水，1滴酚酞，用O．025MNaOH滴定
至酚酞终点，记下消耗的毫升数。计算公式为：
降酸％ =(Vl—Vo)×100％vo
式中：v0一反映前消耗NaOH的体积(mL)
vl—— 反映一段时间后消耗NaOH的体积(mL)
3 结果与讨论
3．1 酯化力
3．1．1 传统方法测定酯化力
传统方法采用100mL 1％的己酸、乙醇溶液，加相称于5g
干曲的曲量，在30—32℃ 酯化100h，用NaOH皂化己酸乙酯
来求得己酸乙酯量。下面对1 、2 曲及陈曲的酯化力进行
测量，以便进行优化的研究(表2)。
表2 传统方法测定酯化力(三次平均)
从表2可以看出，大曲的质量越好，酯化力越高；贮存时
间短的曲(三个月以上)，酯化力越大，但陈曲的酯化力不高。
因此，仅从酯化力考虑，大曲的贮存时间也不可过长，否则，
酯化力会大幅度下降。
3．1．2 优化方法的建立
影响酶在有机溶剂中催化合成己酸乙酯反映的因素
有 ．2 】：第一，底物浓度比(酸、醇浓度比)。第二，加酶量。
加酶量有一个临界值，当加酶量小于临界值时，会影响反映
平衡转化率；当加酶量超过临界值后，平衡转化率不再发生
变化，而反映速度随着酶量的增长而加快。第三，底物的浓
度、特别是有着较强极性的己酸浓度，直接关系着酶的催化
活性和稳定性。第四，反映温度。它既关系着酶的活性，也
关系着反映速度。第五，有机相中，酶的催化活性与反映系
统的含水量密切相关，只有最适含水量时，酶最稳定，且表现
出最大活力。
3．1．2．1 底物酸与醇的比例对酯化反映的影响
理论上，己酸与乙醇反映的摩尔比为1：1，为使反映向己
酸乙酯方向顺利进行，醇应略过量。设定乙醇的三个梯度。
定量：正庚烷30mL，己酸0．15tool，绝干曲量5g，温度
30℃ ，在100mL磨口三角瓶中反映。
变量(摩尔比)：己酸：乙醇=1：1．15(样品一) 己酸：
乙醇=1：1．25(样品二) 己酸：乙醇=1：1．35(样品三)
螽
逝
0 50 100 150h
+ 样一
+ 样二
+ 样三
图1 底物酸与醇比例对鸶化的影响
由图1知：样品二的降酸幅度大于样品一和样品三，说
明样品二比样品一、样品三早达成平衡点，所以取底物酸与
醇比例为1：1．25。
3．1．2．2 加曲量对酯反映的影响
定量：正庚烷30mL，己酸-乙醇=1：1．25，己酸浓度
0．15mol，温度30℃ ，在100mL磨口三角瓶中反映。
变量：加曲量分别为5g、10g、15g(若加入20g大曲则会没
有溶剂剩余)。
由图2可知：最佳加曲量为15g。
蕊
世
反映时间(x10 )
图2 加曲量对酯化的影响
3．1．2．3 底物酸浓度对酯化反映的影响
资料表白【培J，当基质中己酸含量在50×10一 以下时，己
酸乙酯按比例增长，在(50—70)×10I6之间，己酸乙酯虽有增
加，但升幅较大。
3．1．2．3．1 设定己酸浓度梯度为0．1—1．0mol，拟定最佳底
物酸浓度。
定量：正庚烷30mL，己酸：乙醇=1：1．25，干曲量15g，温
度30℃ ，在100mL磨口三角瓶中反映。
变量：己酸浓度分别为0．1n 、0．2mol、0．4mol、0．6mol、
0．8mol、1．0mol。
图3说明底物酸浓度太高时，便克制反映向己酸乙酯方
向进行，0．1mol浓度时降酸最快。
3．1．2．3．2 设定己酸浓度在0．1—0．2tool之间。
定量：同上。
变量：己酸浓度分别为0．1tool、0．125mol、0．15mol、
0．175mol，作图4。
∞ 牾柏 ∞ 衢∞ 坫加5 O
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· 20 · 酿 酒
60
50
40
鑫。。
澄20
10
0
螽
澄
0 50 100h
己酸降酸曲线
圈3 己酸浓度对酯化的影响
— ●一0．1M
．- II-0．
+ 0．4M
* 0．6M
0．8M
+ 1．oM
圈4 底物酸浓度对酯化的影响
由图4可以看出0．1mol与0．2mol间的降酸曲线斜率差
距不大。0．15tool的降酸稍微快一点，所以优化后所得的己
酸浓度为0．15tool。
3．1．2．4 温度对酯化反映的影响
资料表白，在低温25—30℃ 时，生成总酯量高。随着温
度上升，总酯量明显下降。酿造过程中，曲霉与酵母对己酸
都有不同限度酯化能力。当酵母与曲霉两者共同作用时，则
己酸乙酯量大增。产酯酵母重要是球拟酵母，35℃时产酯量
最高，曲霉作用温度也在35℃左右。于是作三个温度梯度，
以期找到最佳温度。
定量：正庚烷30mL，己酸：乙醇=1-1．25，己酸浓度
0．15M，干曲量15g，在100mL磨121三角瓶中反映。
变量：酯化反映温度为25℃ 、30℃ 、35℃。如图5。
0 50 100h
圈5 温度对酯化反映的影响
+ 25℃
+ 30℃
+ 35℃
由图5可以看出，35℃ 时反映最快，因此选用的酯化反
应的温度为35℃。
3．1．2．5 酯化反映最佳条件
综上所述，优化后最终的酯化反映条件为：在30mL正庚
烷有机反映介质中，加入底物酸与乙醇，底物酸的浓度为
0．15mol，己酸与乙醇的浓度比为l：1．25，加入大曲15g，在
100mL的磨口三角瓶中，35℃的条件下反映。
3．1．3 优化后的方法与传统方法对比
优化以后的测定与传统方法相比具有很大优点，重要体
现在以下几个方面(见表3)
表3 优化前后方法的对比
优化前的方法 优化后的方法
反映介质
测酯方法
方法简易度
反映时间
测定结果
水相 有机溶剂相
用碱皂化。直接测定 测定降酸量，间接测定
经蒸馏、皂化、滴定，复杂 只用滴定，简朴
100h 24h
两者相同
从表3可以看出优化后测定方法的优势所在。两种方
法时间上的明显差距，使得优化后的方法更加合用于实际生
产中的测定。
4 结论
4．1 传统酯化力测定方法操作复杂，耗时长。采用在有机
相中反映的方法来测定大曲的酯化力，则相对比较简朴，且
检测时间可以缩短至24h，有助于大生产中快速检测。
4．2 优化最佳测定条件为：在30mL正庚烷有机反映介质
中，加入己酸与乙醇，己酸的浓度为0．15tool，己酸与乙醇的
浓度比为1：1．25，加入大曲粉15g，在100mL的磨口三角瓶
中，35℃的条件下反映24h，测定降酸量。
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第3O卷第2期
2 0 0 3年3月
酿 酒
LIQUORMAKING
Vo1．30，No．2
Mar．， 20O3
文章编号：1002—8110{2023}02—0021—03
防腐剂一苯甲酸的微生物降解研究
苗艳芳，王忠彦，胡承，盂勇
(四川大学生命科学院，四川成都610064)
摘要：通过驯化培养，从废水中分离出一株能高效降解苯甲酸的BJs3菌株，经鉴定，该茵为斑生假单孢茵
(Pseudomonas碱黜如 )，该茵还可以运用苯乙酸、对羟基苯甲酸为唯一的碳源和能源生长。研究了温度、 、
c 、 、氮源，碳源以及微量元素对 茵株生长的影响。在优化培养条件下，BJS3菌株在24h内对苯甲
酸的降解率达99．93％。
关键词：苯甲酸；斑生假单孢茵；生物降解
中图分类号：Q935； ．3 文献标记码：A
苯甲酸又名安息香酸(c6H5COOH)，对多种微生物细胞
的呼吸酶系的活性有克制作用，对于阻碍乙酰辅酶A的结合
反映具有较强的作用，并对微生物的细胞膜有阻碍作用。因
此它既能克制广泛微生物的繁殖，又具有良好的杀菌作用，
其防腐效果较好，因此广泛地被作为防腐剂添加于饮料、汽
酒及平常调味品中。并且苯甲酸也是一类常见的环境污染
物，常存在于化工、食品和医药工业的废水中。关于这类化
收稿日期：2023—12—27
作者简介：苗艳芳(1977一)，女，河北人，在读硕士研究生，主
要从事微生物发酵与遗传工程方面的研究。
合物的生物降解机理和应用研究受到广泛重视[1,2J。由于这
类化合物具有很强的克制作用，所以使具有这类化合物的工
业废水的解决具有较大的难度。因此，对于苯甲酸类化合物
微生物降解的生物化学和遗传学的研究，有助于阐明芳香化
合物的生物降解机制，从而分离和哺育出降解谱广和降解性
能高的菌株，用于环境污染物的生物治理。本文从汽酒厂废
水中分离出一株能高效降解苯甲酸的细菌，并对其最适生长
和降解条件、底物特异性等进行了研究。
1 材料和方法
1．1 茵种来源
从成都附近汽酒厂的废水中驯化、筛选获得。
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酿酒，2023，(5)：25—31
Study on the determination method about the esterifying enzymes from
DaQu of Chinese Strong Flavour Liquor M她
WUANG Yao ，FAN Wen— Lai ，XU Yi ，DIAO Ya一 ，叫Hong —zhen
(1．Jian$su Y埘Ie Co．Ltd．，SIlqian Jian$su 223725，(3fina，2．School 0f Biotechnolo~y，Southern Yangtze University，Wufi 214036，chi~)
AlkqlXACTI~ checkingmethod aboutthe esterifying enzymesfrom DaQu was completely studiedinthis paper．ReactioniIlthe oxalic phase
could rapidly analyses the e啦e enzyIne$power，acIal 【lg to the demand of industrialized product，o0mp with traditional method．The
best conditiom 88 followed：35~C，0．15M n—capmic acid，1：1．25 of n-caproic acid and e吐 alcohol，equal 15g dry DaQu was joln~d into
30mLn—h~tane，the esteritlcatlon 0f diferent q~Uty D o,~an be di shed in 24 hour，which was much less than the conversation
raeamlre8’100 hour．
KEY W ORDS：Chinese Strong FlavonrLiquor， ，伪嘧 eazymes，esteIi |-g，detem~nationmethod
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