肺腺癌胸腔积液DNA倍体异常与EGFR突变的关系及其对患者预后的影响.pdf

1 7 8CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS论著癌变畸变突变Vol.35No.3May 2023肺腺癌胸腔积液DNA倍体异常与EGFR突变的关系及其对患者预后的影响刘颖，王蕊，郭晓，董律吏，张艳，赵银环，杜芸*(河北医科大学第四医院癌检中心，河北石家庄050011)Relationships between DNAploidy abnormality andEGFR mutation in pleuraleffusions,and their effectson prognosis of lungadenocarcinomasLIU Ying,WANG Rui,GUO Xiao,DONG Lli,ZHANG Yan,ZHAO Yinhuan,DU Yun*(Cancer Detection Center,The Fourth Hospital of HebeiMedical University,Shijiazhuang 050011,Hebei,China)收稿日期：2023-03-03；修订日期：2023-05-10作者信息：刘颖，E-mail：。*通信作者，杜芸，E-mail：【摘要】目的：回顾性分析转移性肺腺癌胸腔积液细胞的DNA倍体异常和表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的关系，及其对肺腺癌患者预后的影响。方法：收集河北医科大学第四医院20122019年439例肺腺癌伴恶性胸腔积液患者的临床资料。使用计算机辅助DNA倍体定量分析系统检测胸腔积液中肺腺癌细胞DNA含量，计算大于5c细胞的百分比、大于9c细胞的数目、最大DNA指数(DI)值、大于5c细胞的平均DI值及非整倍体细胞峰。比较DNA倍体异常、EGFR基因突变各组间的差异，并检验DNA倍体异常与EGFR突变的相关性，分析DNA倍体异常及EGFR基因突变在肺腺癌预后中的价值。结果：439例肺腺癌患者中，共有244例(55.58%)检测出EGFR基因突变。与对照组比较，男性、有吸烟史、大于5c细胞的百分比14%、大于9c细胞的数目8、最大DI值6、大于5c细胞的平均DI值5的患者，其EGFR基因突变率降低(P0.05)。不同非整倍体细胞峰的EGFR基因突变率不同，双峰和单峰比无峰的EGFR突变率高(P0.05)。与EGFR野生型患者相比，EGFR突变型患者的大于5c细胞的百分比、大于9c细胞的数目、最大DI值、大于5c细胞的平均DI值及非整倍体细胞峰的平均秩次更高(P0.05)，且上述5项指标均与EGFR突变均存在较弱的正相关关系(Kendalls tau-b相关系数分别为0.186、0.153、0.110、0.156、0.148，均为P0.05)。单因素生存分析显示，大于5c细胞的百分比14%、大于9c细胞的数目8、EGFR突变患者的中位总生存时间较对照组患者长(P0.05)。多因素生存分析显示，EGFR基因突变是晚期肺腺癌患者的独立预后影响因素。结论：晚期肺腺癌患者中EGFR基因突变与DNA倍体异常存在关联，DNA倍体异常可能是预测EGFR基因突变的潜在指标。DNA倍体异常不是晚期肺腺癌患者的独立预后因素，但EGFR基因突变患者预后优于野生型患者。【关键词】DNA倍体异常；EGFR基因突变；肺腺癌；计算机辅助；预后中图分类号：R734.2文献标志码：A文章编号：1004-616X(2023)03-0178-06doi：10.3969/j.issn.1004-616x.2023.03.003【ABSTRACT】OBJECTIVE：Relationships between DNA ploidy abnormality and epidermal growth factorreceptor(EGFR)gene mutation in pleural effusion from metastatic lung adenocarcinomas and their effects onprognosis of patients.METHODS：Clinical data of 439 patients with lung adenocarcinomas and with malignantpleural effusions were collected from the Fourth Hospital of Hebei Medical University from 2012 to 2019.DNAcontent in cells from pleural effusions was detected by computer aided DNA ploidy quantitative analysis.Percentages of cells with greater than 5c，the number of cells with greater than 9c，the maximum DNA index(DI)value，the average DI value of cells with greater than 5c and the peak of aneuploid cells were calculated.Differences of DNA ploidy and EGFR gene mutation among groups were compared，and correlations betweenDNA ploidy and EGFR mutation were tested to analyze the values of DNA ploidy and EGFR gene mutation inprognosis of lung adenocarcinoma.RESULTS：EGFR mutations were detected in 244(55.58%)of 439 patients.The mutation rate was significantly reduced in male patients，and in patients with a history of smoking，compared to the controls(P0.05).In addition，the percentage of cells greater than 5c 14%，the number of论著癌变畸变突变1 7 9CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 5 月第 35 卷第 3 期cells greater than 9c 8，the maximum DI value 6，and the mean value of cells greater than 5c 5(P0.05).The mutation rate of EGFR gene was different with different aneuploid cell peak，and compared withthe nonpeak group，the mutation rate of EGFR gene was higher with single and double peak(P0.05)，whilethere was no significant difference in EGFR mutation rate between multi-peak and other groups.Compared withthe EGFR wild-type patients，EGFR mutant patients had a higher mean rank in the percentage of cells greaterthan 5c，the number of cells greater than 9c，the maximum DI，the mean DI of cells greater than 5c，andthe aneuploid cell peak number，and all five indexes were weakly positively correlated with EGFR mutation.Univariate survival analysis showed that the median overall survival time of patients with greater than 5c cellpercentage 14%，greater than 9C cell number 8 and EGFR mutation were longer than that of the controls.Multivariate survival analysis showed that DNA ploidy was not associated with patient prognosis，and EGFRgenemutationwasanindependentprognosticfactorinpatientswithadvancedlungadenocarcinoma.CONCLUSION：There was a positive correlation between EGFR gene mutation and DNA ploidy abnormalityin patients with advanced lung adenocarcinoma，and DNA ploidy abnormality was a potential predictor ofEGFR gene mutation.DNA ploidy was not an independent prognostic factor in patients with advanced lungadenocarcinoma.Patients with EGFR gene mutation had a better prognosis than the wild-type patients.【KEY WORDS】DNA ploidy abnormality；EGFR mutation；lung adenocarcinoma；computer aided；prognosis肺癌是导致癌症相关死亡的主要原因1-2，肺腺癌是肺癌中最常见的病理类型。晚期肺腺癌患者往往具有胸腔积液转移，转移性肿瘤细胞恶性程度越高，染色体越不稳定，DNA倍体异常细胞越多。应用计算机辅助 DNA 倍体分析可以测定肿瘤细胞核的 DNA 含量，计数胸腔积液中DNA倍体异常细胞。肺腺癌中最常见的驱动基因突变是表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor，EGFR)，在亚洲人中 EGFR 突变率为40%62%2。EGFR突变状态与肺腺癌生物学行为及预后相关，然而研究结果并不一致。DNA倍体异常通常用于辅助细胞病理学的诊断，已有研究表明DNA倍体异常可能影响肺腺癌患者的预后3，DNA倍体异常与肿瘤增殖密切相关，肿瘤细胞增殖一般伴有染色体数量和结构异常4，但对于 DNA 倍体异常与EGFR突变之间的关系却少见报道。本研究将肺腺癌患者胸腔积液中的肺腺癌细胞用于DNA倍体分析和基因检测，分析癌细胞的DNA倍体异常和EGFR突变之间的关系，并探究其对患者预后的影响。1材料与方法1.1病例收集本研究采用回顾性分析来自河北医科大学第四医院2012年1月2019年12月期间439例肺腺癌患者的临床资料。患者的入选标准包括：经细胞病理学诊断及免疫细胞化学确诊为胸腔积液肺腺癌转移；单发肺癌；有明确的DNA倍体分析及EGFR基因突变检测结果。所有患者均随访至死亡或研究截止日期(2019 年 12 月 31 日)，统计患者的总生存期(overallsurvival，OS)，即确诊肺腺癌至患者出现死亡或本研究截止日期。本研究经过河北医科大学第四医院伦理委员会批准(批准文号2019MEC102)，且临床资料收集均已获得患者知情同意书。吸烟史定义为入院前平均每天吸烟1支，且持续时间超过6个月。1.2胸水的处理用一次性细胞采集器富集胸腔积液中的肿瘤细胞，制作涂片，进行HE染色。并采用免疫细胞化学法5，选择 NapsinA、TTF1、P40、P63、Syn、CD56、CEA、WT1等抗体诊断肺腺癌胸腔积液转移。本实验所有抗体均为即用型抗体，均购自福州迈新公司。1.3计算机辅助DNA倍体分析制作胸腔积液涂片进行Feulgen染色，使用购自武汉兰丁的计算机辅助DNA图像定量分析系统(DNA-ICM)检测染色细胞核的集成光密度(integrated opticaldensity，IOD)来测定细胞核 DNA 含量，用 DNA 指数(DNA index，DI)来表示DNA含量6。DI为肿瘤细胞核DNA均值与正常细胞DNA均值的比值，它反映了肿瘤细胞总DNA含量的相对水平。DI计算公式如下：DI被测细胞DNA的IOD平均值/正常细胞DNA(G0/G1期)的IOD平均值正常细胞的DI是2c(1c为正常G0/G1组DNA含量的一半，因此G0/G1细胞为2c细胞，即二倍体细胞)。大于 5c 细胞(5 倍体细胞)被判断为 DNA 倍体异常细胞。计算大于5c细胞的百分比，即DNA含量大于5c的细胞数量/DNA含量大于2c的细胞数量100%；大于 9c 细胞的数目，即前 20 个细胞中大于 9c 的细胞数；大于5c细胞的平均DI值，即前20个细胞中大于论著癌变畸变突变1 8 0CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.3May 20235c细胞的平均DI值。非整倍体细胞峰为在2c以后可出现大量非整倍体细胞，并形成峰，根据形成峰的多少可分为无峰、单峰、双峰和多峰。1.4EGFR突变检测利用人类EGFR基因突变检测试剂盒(厦门艾德公司)，通过ABI 7500荧光定量PCR仪(美国Thermofisher公司)，采用扩增受阻突变系统-PCR技术(amplificationrefractory mutation system，ARMS)对从胸腔积液肿瘤细胞中提取的 DNA 进行扩增，检测 EGFR 基因突变类型。PCR 反应条件：95、5 min；95、25 s，64、20 s，72、20 s，15 个循环；93、25s，60、35 s，72、20 s，36个循环。1.5统计学分析应用SPSS 21.0软件进行统计分析。采用卡方检验比较分类变量组间分布差异，计数资料用百分比表示，采用秩和检验、卡方检验和Kendalls tau b系数评价DNA倍体异常与EGFR突变的相关性，单因素生存分析用Kaplan-Meier法及Log-rank检验，多因素生存分析采用 Cox 比例风险模型。以=0.05 为检验水准。用R语言的最优截断算法来确定连续参数的截断值，选择在生存分析中意义最大的截断值作为最优截断值。2结果2.1EGFR基因突变与临床病理指标的相关性439例肺腺癌患者中，共有244例(55.58%)检测出EGFR突变。其中外显子19缺失100例(40.98%)，外显子21突变113例(46.31%)，其他突变31例(12.7%)。如表1所示，EGFR突变与患者年龄无明显相关关系。男性、有吸烟史、大于5c细胞的百分比14%、大于9c细胞的数目8、最大DI值6、大于5c细胞的平均DI值5的患者，其EGFR基因突变率降低(P0.05)。非整倍体细胞峰的不同分组间EGFR突变率不同(P0.05)。2.2DNA倍体异常与EGFR基因突变的相关性如表 2 所示，Mann-Whitney U 检验结果显示，EGFR突变患者大于5c细胞的百分比、大于9c细胞的数目、最大DI值、大于5c细胞的平均DI值、非整倍体细胞峰数的平均秩次高于 EGFR 野生型患者(P0.05)，而EGFR不同突变组大于9c细胞的数目经Bonferrni法校正后两两分析比较发现，21号外显子突变的大于9c细胞的数目的平均秩次高于其他突变组(P=0.049)。采用Kendalls tau-b相关系数评价DNA倍体异常和EGFR突变的关系，大于5c细胞的百分比、大于9c细胞的数目、最大DI值、大于5c细胞的平均DI值、非整倍体细胞峰数均和EGFR突变均存在较弱表1EGFR基因突变与肺腺癌患者临床病理指标的相关性指标年龄/岁6262性别女性男性吸烟史是否大于5c细胞的百分比14%14%大于9c细胞的数目88最大DI值66大于5c细胞的平均DI值55非整倍体细胞峰无峰单峰双峰多峰EGFR突变型130(54.9%)114(56.4%)151(61.4%)93(48.2%)51(40.8%)193(61.5%)180(51.3%)64(72.7%)124(48.2%)120(65.9%)111(50%)133(61.3%)172(52.3%)72(65.5%)90(44.8%)93(67.9%)28(68.3%)33(55%)EGFR野生型107(45.1%)88(43.6%)95(38.6%)100(51.8%)74(59.2%)121(38.5%)171(48.7%)24(27.3%)133(51.8%)62(34.1%)111(50%)84(38.7%)157(47.7%)38(34.5%)111(55.2%)44(32.1%)13(31.7%)27(45%)突变率/%54.956.461.448.240.861.551.372.748.265.95061.352.365.544.867.968.35520.1117.62815.46513.10713.4985.6665.79620.595P0.7390.010.010.010.010.0170.0160.01表2DNA倍体异常与EGFR基因突变的相关性(平均秩次)变量大于5c细胞的百分比大于9c细胞的数目最大DI值大于5c细胞的平均DI值非整倍体细胞峰数EGFR突变状态突变型(n=244)245.78240.08235.21241.55236.74野生型(n=195)187.78194.87200.96193.03199.05P0.010.010.010.010.01EGFR突变位点19(n=100)113.56119.76123.54113.56119.821(n=113)133.29131.72126.36133.29123.1其他(n=31)112.0297.74105.1112.02129.03P0.0850.0490.3260.1800.790论著癌变畸变突变1 8 1CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 5 月第 35 卷第 3 期的正相关关系(P0.05)，Kendalls tau-b分别为0.186、0.153、0.110、0.156、0.148，说明 EGFR 突变率随DNA倍体异常比例增加而升高。2.3DNA倍体异常与EGFR突变对肺腺癌患者预后的影响本实验采用OS作为主要结局指标。如表3所示，单因素生存分析结果显示，62岁、女性、不吸烟的患者预后好于大于62岁、男性、吸烟的患者；大于5c细胞的百分比14%、大于9c细胞的数目8的患者预后好于大于5c细胞的百分比14%、大于9c细胞的数目8的患者；EGFR突变型患者的预后较EGFR野生型患者更好。而多因素生存分析结果显示，大于5c细胞的百分比(P=0.171)、大于9c细胞的数目(P=0.176)及性别(P=0.799)与晚期肺腺癌患者预后无明显相关关系；EGFR突变是患者的正向独立预后影响因素，年龄、吸烟是患者的负向独立预后影响因素，如表4所示。3讨论计算机辅助DNA倍体分析在细胞病理学诊断中发挥重要作用7-10，DNA倍体异常代表肿瘤细胞染色体不稳定，与肿瘤发生发展相关4。EGFR是一种酪氨酸激酶受体，属于ErBb家族，EGFR基因突变与肺腺癌的发生发展及预后有着密切关联。研究肺腺癌肿瘤细胞DNA倍体异常与EGFR突变及预后的关系可以为肺腺癌患者个体化治疗提供重要预测信息。随着人工智能的发展，越来越多的研究者发现基于病理图像可以预测肿瘤相关指标，包括基因突变、分子亚型、治疗效果等11-13。王荃等14的研究结果显示非小细胞肺癌的病理图像可以预测EGFR基因突变。DNA倍体分析作为一种低级别人工智能，本研究探索了基于DNA倍体异常预测EGFR基因突变的可能性。有研究表明 DNA 异倍体与 EGFR 基因突变状态有关，EGFR突变患者DNA异倍体比例较野生型患者更高15。在本研究中，在大于5c细胞的百分比、大于9c细胞的数目、最大DI值、大于5c细胞的平均DI值不同组别中，高值组的患者EGFR突变率高于低值组的患者，与文献15报道结果一致。与EGFR野生型患者相比，EGFR突变型的大于5c细胞的百分比、大于9c细胞的数目、最大DI值、大于5c细胞的平均DI值和非整倍体细胞峰数的平均秩次更高。在EGFR不同突变组间，21号外显子突变的大于9c细胞的数目平均秩次高于其他突变组，而在其他DNA倍体异常指标中EGFR不同突变组间无明显差异。EGFR突变与各DNA倍体异常指标均存在较弱的正相关关联。这表明DNA倍体异常与EGFR基因突变有着一定的相关性，在一定程度上可以用来预测EGFR基因突变。在一项有关96例IIIIA期手术切除NSCLC患者的研究中16，在单因素分析中大于5c细胞的百分比5%患者较大于5c细胞的百分比5%患者有更高的OS，而在多因素分析后结果表明大于5c细胞的百分比并不能作为一个独立预后因素。单因素分析结果与本研究中的结果相反，可能与患者的临床分期和大于5c细胞的百分比分界值不同有关，而多因素分析结果与本研究结果一致。在本研究中，单因素生存分析结果显示，大于5c细胞的百分比14%、大于9c细胞的数目8的患者预后好于大于5c细胞的百分比14%、大于9c细胞的数目8的患者，EGFR突变型患者预后好于EGFR 野生型患者。但多因素生存分析结果显示，DNA倍体异常与晚期肺腺癌患者OS无关，EGFR基因突变组 OS 的 HR=0.576(95%CI 为 0.4650.714，P0.05)，这表明EGFR基因突变是肺腺癌患者的独立预指标年龄(大于62岁，62岁)EGFR(突变，野生)吸烟(吸烟，未吸烟)HR(95%CI)1.298(1.051，1.602)0.576(0.465，0.714)1.402(1.112，1.767)P0.0150.010.004表4439例肺腺癌患者临床及病理指标的多因素生存分析指标年龄/岁6262性别女性男性吸烟史是否EGFR突变型野生型大于5c细胞的百分比14%14%大于9c细胞的数目88最大DI值66大于5c细胞的平均DI值55非整倍体细胞峰无峰单峰双峰多峰生存时间中位数/月132018141219221116221419141916191518141695%CI(10.432，15.568)(17.181，22.819)(15.338，20.662)(10.775，17.225)(9.699，14.301)(16.342，21.658)(18.961，25.039)(8.724，13.276)(13.828，18.172)(17.360，26.640)(10.920，17.080)(15.666，22.345)(11.121，16.879)(16.077，21.923)(13.641，18.359)(15.135，22.865)(12.018，17.982)(15.729，20.271)(9.866，18.134)(8.839，23.161)25.9454.10416.58133.3025.9696.5932.3410.4921.301P0.0150.0430.010.010.0150.010.1260.4830.729表3439例肺腺癌患者临床及病理指标的单因素生存分析论著癌变畸变突变1 8 2CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.3May 2023后因素，而DNA倍体异常并不是肺腺癌患者的独立预后因素。DNA倍体异常与预后的关系在单因素和多因素分析中结果不同，这可能是因为DNA倍体异常与EGFR基因突变关联密切有关，DNA倍体异常作为一个混杂因素在多因素生存分析中被剔除。一项荟萃分析17表明，在肺癌手术患者中，与EGFR野生型患者相比，EGFR突变患者OS更长。此外，一项关于5 780例早期非鳞状NSCLC患者的回顾性研究18发现EGFR突变患者的无复发生存期和OS比野生型患者均显著延长。这与本研究结论相符，在本研究中，晚期肺腺癌患者EGFR突变组的OS优于非突变组。而许丽莉等19的研究结果显示在早期肺腺癌患者中，EGFR突变状态与患者术后无病生存期及OS无显著相关性，不是影响患者预后的独立因素，但相比EGFR外显子21 L858R突变患者，EGFR外显子19缺失患者的术后复发风险更高。Ito等20的一项多中心回顾性分析发现在病理分期IAIB期的高度恶性亚型和病理分期AA期病例中，单因素和多变量分析显示EGFR突变患者的5年无复发生存率低于EGFR野生型患者。EGFR突变状态在肺癌患者中的预后影响存在明显争议，可能是由于肺癌患者的分期及组织学亚型不同，或者患者携带有其他驱动基因突变，这些因素均会影响研究结果。本研究中年龄和吸烟史与晚期肺腺癌患者预后有关，年龄62岁患者预后好于年龄62岁的患者；无吸烟患者预后好于吸烟患者，与文献21报道相符。但本文仅随访了患者OS，并未统计患者的无进展生存时间，可能会使结果存在一定的局限性，后续研究中我们将进一步扩大样本量，延长随访时间，增加患者无进展生存时间指标，进一步分析DNA倍体异常与EGFR基因突变对患者预后的影响。晚期肺腺癌患者常常较难获得组织学标本，本研究采用胸水细胞学标本进行DNA倍体异常与EGFR突变检测，将DNA倍体异常与EGFR突变进行相关性分析，并用COX单因素和多因素生存模型分析两者与预后的关系，为晚期肺腺癌患者的预后及精准治疗提供了依据。总而言之，晚期肺腺癌患者中EGFR基因突变与DNA倍体异常存在关联，DNA倍体异常是预测EGFR基因突变的潜在指标。DNA倍体异常不是晚期肺腺癌患者的独立预后影响因素，而EGFR基因突变患者预后好于野生型患者，可作为晚期肺腺癌患者预后的预测因子。参考文献1TORRE L A,SIEGEL R L,JEMAL A.Lung cancer statisticsJ.Adv Exp Med Biol,2016,893:1-19.2眭玉霞,邓晓宇,伍铮,等.非小细胞肺癌驱动基因突变与临床病理特征的关系J.临床与实验病理学杂志,2020,36(9):1023-1028.3UEDA K,KANEDA Y,HAYASHI M,et 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