低温对狗牙根根系呼吸电子传递的影响及其与抗寒性的关系.pdf

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2022-0514赵尧尧，张泽程，刘美君，陈蝶，柴国梁.低温对狗牙根根系呼吸电子传递的影响及其与抗寒性的关系.草业科学,2023,40(5):1258-1265.ZHAOYY,ZHANGZC,LIUMJ,CHEND,CHAIGL.EffectsoflowtemperatureonrootrespirationofCynodon dactylonanditsrelationshipwithcoldresistance.PrataculturalScience,2023,40(5):1258-1265.低温对狗牙根根系呼吸电子传递的影响及其与抗寒性的关系赵尧尧，张泽程，刘美君，陈蝶，柴国梁（新疆农业大学草业学院,新疆乌鲁木齐830052）摘要：呼吸作用为狗牙根(Cynodon dactylon)根系细胞的生命活动提供能量，也是狗牙根能否正常生长和顺利越冬的关键。本研究以抗寒性不同的新农 1 号(XinnongNo.1)和矮生天堂草(C.dactylon C.transvaalensis)为试验材料，在对照室温 25 和低温 4 处理后，研究低温对狗牙根根系呼吸作用的影响及其与抗寒性的关系。结果表明，低温胁迫会导致狗牙根根系活力下降，相对电导率和 H2O2含量显著上升(P0.05)，与新农 1 号相比，低温对矮生天堂草的伤害更重。低温胁迫会导致狗牙根根系总呼吸速率、细胞色素氧化酶(COX)呼吸速率和交替氧化酶(AOX)呼吸速率均显著降低，且新农 1 号下降程度更大，但新农 1 号根系 AOX 呼吸占总呼吸的比率显著上升(P0.05)；在低温下 AOX 呼吸受抑，加重了新农 1 号狗牙根根系活力的下降、相对电导率的增加以及 H2O2的积累，显著(P0.05)，这表明，在低温胁迫下，AOX 有效地减轻了活性氧的积累，降低了细胞膜的氧化伤害，维持了较高的根系活力，从而对根系起重要保护作用。新农 1 号狗牙根根系AOX 呼吸的相对活性显著上调，增加了其对低温的抗性。关键词：低温胁迫；狗牙根根系；呼吸速率；交替氧化酶呼吸；细胞色素氧化酶呼吸；活性氧；抗寒性文献标志码：A文章编号：1001-0629(2023)05-1258-08Effects of low temperature on root respiration of Cynodon dactylonand its relationship with cold resistanceZHAOYaoyao,ZHANGZecheng,LIUMeijun,CHENDie,CHAIGuoliang(CollegeofGrasslandScience,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,Xingjiang,China)Abstract:Rootrespirationinbermudagrass(Cynodon dactylon)istheonlysourceofenergyandiscrucialfornormalgrowthandwintersurvival.Inthisstudy,XinnongNo.1andTifdwarfBermudagrasswithdifferentlevelsofcoldresistancewereselectedandtheeffectoflow-temperatureonrootrespirationofbermudagrassanditsrelationshipwithcoldresistancewasexaminedat25(control)and4.Theresultsshowedthatlow-temperaturestressnotablydecreasedtherootactivityofbermudagrassandincreasedtherelativeconductivityandH2O2content.ComparedwithXinnongNo.1,theeffectoflow-temperatureonTifdwarfBermudagrasswassignificantlymoresevere(P0.05).Thelow-temperatureexposurereducedthetotal respiration rate and the cytochrome oxidase and alternative oxidase(AOX)respiration rates in the roots ofbermudagrass;however,thedecreaseinXinnongNo.1wasmoresignificant(P0.05).Furthermore,theratioofAOXrespirationtototalrespirationintherootsofXinnongNo.1increasedsignificantly(P0.05).Underlow-temperature,the收稿日期：2022-06-22接受日期：2022-10-31基金项目：国家级大学生创新创业训练计划(202210758005)；自治区自然基金(2523ZZQZRJJ)；作物生物学国家重点实验室开放课题(2021KF05)第一作者：赵尧尧(1998-)，男，贵州桐梓人，在读硕士生，研究方向为植物逆境生理。E-mail:通信作者：刘美君(1988-)，女，山西五台人，副教授，博士，研究方向为牧草生理。E-mail:1258-1265草业科学第40卷第5期5/2023PRATACULTURALSCIENCEVol.40,No.5http:/inhibitionofAOXrespirationsignificantlydecreasedtherootactivity,increasedrelativeconductivity,andaccumulationofH2O2(P 0.05)compared with those subjected to 25,but did not significantly differ from those of TifdwarfBermudagrass.TheseresultsindicatethatAOXreducedreactiveoxygenspeciesaccumulation,reducedoxidativedamagetothecellmembrane,andmaintainedahighrootactivityunderlow-temperature,thusplayinganimportantroleinprotectingtherootsystem.TherelativeactivityofAOXrespirationintherootsofbermudagrasswassignificantlyincreased(P0.05)inXinnongNo.1,whichincreaseditsresistancetolow-temperature.Keywords:low-temperaturestress;bermudagrassrootsystem;rateofrespiration;alternativeoxidasepathway;cytochromeoxidaserespiration;reactiveoxygenspecies;coldresistanceCorresponding author:LIUMeijunE-mail:狗牙根(Cynodon dactylon)属禾本科多年生草本植物，在我国广泛分布，具有抗旱、耐践踏等优良特性且广泛用于公路护坡、足球场和高尔夫球场等建植1-4，但由于抗寒能力比较差，限制了其在我国北方及世界较寒冷地区的应用。尤其是新疆特殊的地理气候条件，春季霜冻寒潮、冬季低温等极端天气，使狗牙根常常遭受冷害和冻害的威胁，严重限制了它的推广应用3-4。低温已经成为限制狗牙根产业发展的重要的环境因素，因此，认识并深入开展狗牙根的抗寒性机理研究，对狗牙根的安全越冬及其推广和应用具有很重要的理论与实践意义。目前，研究人员已经从狗牙根根系形态5、化学组分6-7、脂肪酸代谢8等方面对狗牙根抗寒性的生理机制进行了详细研究。狗牙根几丁质酶基因在低温驯化过程中受到诱导，促进了狗牙根耐寒，阐释了狗牙根抗寒性的分子机制9。此外，外源添加 H2S、Ca2+10以及乙烯11等也都可以在代谢组或光合作用等方面增强狗牙根抗寒性。迄今为止，国内外对狗牙根抗寒性机理开展了大量研究且大多是对狗牙根地上部分的研究，但是对于多年生的狗牙根而言，它主要以根的形式越冬12，因此，狗牙根的抗寒性以及成功越冬的关键在于其根部的抗寒性，在没有叶绿体不能进行光合作用的根部，呼吸作用是提供 细 胞 所 需 能 量 腺 嘌 呤 核 苷 三 磷 酸(adenosinetriphosphate,ATP)的唯一途径。植物线粒体中存在细胞色素(cytochromeoxidase,COX)和交替氧化酶(alternativeoxidase,AOX)两条电子传递途径13，其中 COX 途径期间偶联质子的跨膜运输形成跨膜质子梯度用于 ATP 的合成。线粒体电子传递链是活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的主要产生位点，也是主要攻击位点14-15，AOX呼吸途径由于不受跨膜质子梯度和 ATP/ADP 的限制，在线粒体呼吸电子传递链中有效地促进分子氧与还原醌的结合，降低了 ROS 的产生，从而减少了ROS 对细胞的伤害14-18，低温下根部既要产生足够的 ATP，又要避免产生 ROS，是狗牙根顺利越冬的关键所在。目前，对于低温如何影响狗牙根根部呼吸以及ATP 的产生从而影响狗牙根根部的抗寒性的机制尚不清楚。关于低温对狗牙根根系呼吸电子传递及抗寒性的相关研究未见报道，因此，本研究选用抗寒性较强品种新农 1 号狗牙根(C.dactylonXinnongNo.1)和抗寒性较弱品种矮生天堂草(C.dactylon C.transvaalensis)，通过测定低温后不同呼吸途径的变化，以及低温对根部活性和根部氧化还原平衡状态的影响，研究低温对根部呼吸电子传递及 ATP 合成的影响机制，进一步探讨低温下线粒体呼吸途径与根部抗寒性的关系，以期为狗牙根高抗寒性品种的培育提供理论依据，对狗牙根抗寒育种和栽培有重要意义。1 材料与方法 1.1 试验材料选用抗寒性不同的两个狗牙根品种，分别是能在乌鲁木齐25.6 安全越冬、抗寒性较强的新农1 号狗牙根，以及不能安全越冬抗寒性较弱的矮生天堂草19，供试材料均由新疆农业大学草业学院提供。1.2 试验设计将供试种子先用 98%浓硫酸处理 25min，再用5%次氯酸钠溶液消毒 5min，最后用去离子水清洗5 遍。在培养室恒温 25 下进行培养，每周浇 3 次第5期赵尧尧等：低温对狗牙根根系呼吸电子传递的影响及其与抗寒性的关系1259http:/营养液以促进其生长。待其生长 6 周后，将长势一致的完整植株移至人工气候培养箱内，人工气候室光照强度为 5000lx，光照 16h，黑暗 8h。分别进行25 室温和 4 低温以及 4 低温+水杨羟肟酸(salicylhydroxamicacid,SHAM)处理，光暗条件下温度不变。其中 SHAM 是 AOX 的专一性抑制剂，用来研究根系 AOX 呼吸对狗牙根根系的抗寒性的作用。根据预试验结果，选用含有 lmmolL1SHAM的营养液浇灌进行处理。处理 72h 后，取根系样品，用清水洗净，测定各生理指标。1.3 根系活力测定采用氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC)法测定，用四氮唑的还原强度表示根系活力，单位为 g(gh)120。1.4 根系 ATP 含量测定采用 ATP 生物体发光检测试剂盒测定。取 2g根尖于 2mmolL1MgSO4溶液中裂解，30C 水浴保温 10min。裂解液于 15000rmin1离心，上清液用于 ATP 含量的测定。1.5 根部线粒体呼吸电子传递速率的测定用 Oxytherm 氧电极测定狗牙根根部的呼吸途径21。狗牙根根部取样 1g，剪碎，加入含有 1mL 测定缓冲液的电极反应杯中。分别于 25 和 4 下测定呼吸速率。细胞色素途径和 AOX 途径呼吸速率分别定义为在 SHAM 和 KCN 存在时的氧消耗量的斜率。加入 100mmolL1SHAM 测定细胞色素途径下的呼吸速率；预先加入40mmolL1氰化钾(potassiumcyanide,KCN)(细 胞 色 素 途 径 抑 制 剂)溶 液 测 定AOX 途径下的呼吸速率，其中 KCN 是 COX 的专一性抑制剂。1.6 相对电导率测定采用电导法测定材料的外渗电导率22，蒸馏水的电导率为 S0，煮沸前电导率为 S1，煮沸后电导率为 S2，相对电导率=(S1S0)/(S2S0)100%。1.7 过氧化氢含量测定采用刘俊23的方法测定过氧化氢含量，将 0.5g洗干净的根加入到 3mL 预冷的丙酮中研磨，研磨液在 4 条件下 6000rmin1，离心 10min，取 1mL上清液，加入 0.1mL5%四氯化钛和 0.2mL 浓氨水，混匀，出现沉淀，4，6000rmin1，离心 10min，沉淀用丙酮反复洗涤 35 次，以便去除植物色素，向洗涤后的沉淀中加入 5mL2molL1H2SO4，使沉淀完全溶解，并定容至 10mL 具塞刻度试管，415nm下检测吸光度，通过标准曲线求得过氧化氢含量。1.8 数据分析采用 Excel2019 对所测数据统计分析，用平均值标准差表示测定结果，用 SPSS19.0 软件对同一品种不同温度处理和同一温度不同品种进行单因素方差分析，并用 Duncan 法对各测定数据进行多重比较，采用 Origin2022 作图。2 结果与分析 2.1 低温对狗牙根根系活力与 ATP 含量的影响低温处理后狗牙根根系活力与 ATP 含量均出现变化(图 1)，与 25 室温处理 72h 相比，4 低温处理 72h 后新农 1 号和矮生天堂草根系活力均明显下降，且差异显著(P0.05)，说明低温胁迫均显著抑制了狗牙根根系活力，但抗寒性较弱的矮生天堂草狗牙根根系活力受低温胁迫的影响比抗寒性较好的新农 1 号更为严重。低温还导致新农1 号和矮生天堂草根系 ATP 含量均明显降低，其中矮生天堂草下降更严重，且差异显著(P0.05)。2.2 低温对狗牙根根系细胞膜透性和氧化还原平衡的影响线粒体呼吸电子传递链在线粒体类囊体膜上进行，细胞膜结构的完整性对线粒体呼吸十分重要。同时，线粒体呼吸电子传递链也是活性氧(ROS)产生的位点，活性氧会对细胞造成损害。与对照相比，低温引起狗牙根根系细胞相对电导率显著上升，且矮生天堂草上升幅度更大(图 2)，表明矮生天堂草根系细胞膜对低温更敏感，更容易受低温破坏。与对照相比，新农 1 号和矮生天堂草根系 H2O2含量在低温胁迫下均显著上升，且矮生天堂草上升幅度更大(P0.05)，表明低温胁迫会导致狗牙根根系H2O2含量增加，而矮生天堂草受到的影响更大。2.3 低温对狗牙根根系呼吸电子传递的影响与对照室温相比，低温处理 72h 后新农 1 号和矮生天堂草狗牙根根系总呼吸速率、COX 呼吸速1260草业科学第40卷http:/率以及 AOX 呼吸速率均显著下降(P0.05)，且新农 1 号比矮生天堂草下降程度更大。这表明低温胁迫降低狗牙根根系呼吸电子传递，进入半休眠状态，减少营养的消耗，新农 1 号狗牙根根系对低温的反应更灵敏。此外，与室温对照相比，新农 1 号根系 AOX 占总呼吸的比率显著增加(P0.05)(图 3)，这表明，低温下新农 1 号狗牙根根系 AOX 相对活性上调。2.4 AOX 对狗牙根根系抗寒性的影响AOX 是一种有效的活性氧清除机制，本研究在低温下用 AOX 专一性抑制剂 SHAM 抑制 AOX 活性，用以为了进一步验证 AOX 对狗牙根抗寒性的影响。与对照室温相比，在低温下抑制 AOX 后狗牙根根系活力显著降低，且新农 1 号受到的影响更大(图 4)。抑制 AOX 后相对电导率和 H2O2含量明显上升且差异显著(P0.05)。3 讨论与结论狗牙根作为典型的多年生草坪草，在我国北方尤其是新疆越冬期低温胁迫下狗牙根地上部分枯黄凋萎，此时，根系是狗牙根越冬的主体12,24-26，根部 的 呼 吸 作 用 是 为 其 根 系 细 胞 提 供 所 需 能 量ATP 的唯一途径，本研究表明狗牙根根系细胞呼吸主要通过 COX 途径推动跨膜质子梯度的产生用以合成 ATP。低温胁迫破坏了细胞中的电子呼吸传递链，阻碍了细胞 ATP 的产生，以维持根系活力，而abac2540.000.050.100.150.200.250.300.350.40温度 Temperature/254温度 Temperature/根系活力Root activity/mg(gh)1新农 1 号 Xinnong No.1矮生天堂草 Tifdwarf bermudagrassabac0510152025303540ATP 含量ATP coontent/(1010 molg1)图 1 低温胁迫下不同品种狗牙根根系活力与腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)含量Figure 1 Root activity and adenosine triphosphate(ATP)content of different varieties ofBermudagrass under low temperature不同小写字母表示各处理间差异显著(P0.05)。下图同。Differentlowercaselettersindicatesignificantdifferencesbetweendifferenttreatmentsatthe0.05level.Thisisapplicableforthefollowingfiguresaswell.cbca01020304050607080相对电导率Relative electrical conductivity/%cbca0.00.20.40.60.81.01.21.41.61.8过氧化氢含量H2O2 Content/(molg1)254温度 Temperature/254温度 Temperature/新农 1 号 Xinnong No.1矮生天堂草 Tifdwarf bermudagrass图 2 低温下不同品种狗牙根根系细胞相对电导率和 H2O2含量Figure 2 Relative electric conductivity and H2O2 content of different bermudagrass root cells under low temperature第5期赵尧尧等：低温对狗牙根根系呼吸电子传递的影响及其与抗寒性的关系1261http:/线粒体呼吸电子传递链的正常运转需依赖于线粒体膜的完整性13,17。低温可导致植物细胞膜受到伤害27，由常温下的液晶态转变为凝胶态，细胞膜脂的相变破坏膜和蛋白质原有的结合方式，或者由活性氧引起的膜脂过氧化导致膜结构的破坏，加速离子等物质渗漏，因而外渗透量可以反映植物细胞膜受到伤害的程度28-29。研究表明，低温导致紫花狗牙根根系细胞的细胞膜遭受破坏，致使细胞内容物离子扩散，电导率显著上升，植物遭受低温胁迫无法越冬很可能是因为低温破坏了线粒体内膜上电子呼吸传递链，影响细胞正常呼吸和能量供应。根系线粒体呼吸电子传递链是活性氧产生的主要位点30。低温胁迫下破坏了细胞呼吸电子传递，导致电子渗漏，活性氧代谢增强31。AOX 呼吸途径254温度 Temperature/254温度 Temperature/254温度 Temperature/254温度 Temperature/新农 1 号 Xinnong No.1矮生天堂草 Tifdwarf bermudagrassbabb051015202530354045AOX 占总呼吸的比率Ratio of AOX to total respiration/%acbc010203040506070COX 呼吸速率Cox respiratory rate/mol(gh)1acbc05101520253035AOX 呼吸速率AOX respiratory rate/mol(gh)1acbc020406080100总呼吸速率Total respiration rate/mol(gh)1图 3 低温下不同品种狗牙根根系细胞总呼吸速率、细胞色素(COX)呼吸速率、交替氧化酶(AOX)呼吸速率和 AOX 占总呼吸的比率Figure 3 Total respiration rate,cyclooxygenase(COX)respiration rate,alternative oxidase(AOX)respiration rate,and ratio of AOX to total respiration of bermudagrass root cells of different breeds under low temperaturecaba01020304050607080相对电导率Relative electricalconductivity/%caba0.00.51.01.52.0过氧化氢含量H2O2 Content/(molg1)温度 Temperature/新农 1 号 Xinnong No.1矮生天堂草 Tifdwarf bermudagrassacbc44+SHAM温度 Temperature/44+SHAM温度 Temperature/44+SHAM0.000.050.100.150.200.25根系活力Root activity/mg(gh)1图 4 低温胁迫下抑制交替氧化酶(AOX)后不同品种狗牙根根系活力、细胞相对电导率和 H2O2含量Figure 4 Root activity,cell relative conductivity,and H2O2 content of different varieties of Bermudagrassafter inhibiting alternative oxidase(AOX)under low temperature1262草业科学第40卷http:/是一条呼吸耗能途径，加速电子的消耗从而有效的减轻活性氧的产生32-34。低温胁迫后，尽管狗牙根根系细胞呼吸速率全部降低，但是 AOX 呼吸途径占总呼吸的比例却比常温下高，狗牙根根系在低温胁迫下启动了自身应激机制，减少活性氧的产生。但是本研究发现低温胁迫后狗牙根根系活性氧过氧化氢(H2O2)发生积累，这可能直接或间接氧化生物大分子，损伤细胞膜，从而加速细胞的死亡和解体35。这表明低温下根系 AOX 的上调只能减轻，并不能完全清除根系细胞的氧化伤害。本研究指出，在低温下抑制了 AOX 呼吸途径后，反而抗寒性较强的新农 1 号狗牙根根系受到的影响更大，因此，新农 1 号狗牙根根系 AOX 呼吸相对活性的上调对其抗寒性增加有至关重要的作用。综上所述，低温胁迫破坏了狗牙根根系细胞膜结构，影响了根系细胞线粒体的呼吸，减少了 ATP的合成，增加了活性氧的产生，加重了低温对根系细胞的氧化伤害，最终影响了根系活力。新农1 号狗牙根根系 AOX 呼吸的相对活性显著上调，减轻了低温下狗牙根根系细胞的氧化伤害，增加了其对低温的抗性。因此，AOX 呼吸对狗牙根抗寒性有重要意义。参考文献 References:马克群,刘建秀.坪用狗牙根种质资源评价与改良研究进展.植物遗传资源学报,2005(3):348-353.MA K Q,LIU J X.Progress in assessment and improvement of bermudagrass germplasm for turf.Journal of Plant GeneticResources,2005(3):348-353.1段宏利,蒋凌雁,陈志坚,黄春琼.铝胁迫对狗牙根根系生长和营养元素的影响.草地学报,2022,30(4):936-942.DUANHL,JIANGLY,CHENZJ,HUANGCQ.Effectsofaluminumstressonrootgrowthandcontentsofnutrientelementsofcynodon 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