金根注射液的HPLC特征图谱研究.pdf

NO.212023120检测技术饲科研究FEEDRESEARCH金根注射液的HPLC特征图谱研究韩会刚张传津*牛华星魏茂莲 张志民（山东省饲料兽药质量检验中心，山东济南2 50 0 10)摘要：研究旨在建立金根注射液特征图谱，为其质量评价提供依据。试验以绿原酸为参照物，采用WatersXBridgeC18色谱柱（粒径为3.5m，4.6 mm2 50 mm），以乙睛-0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱；检测波长为240nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30。结果显示，供试品色谱中呈现7 个特征峰，并与对应的参照物色谱峰保留时间一致。研究表明，该方法精密度高、专属性强、重复性好，可以更有效地控制金根注射液内在质量。关键词：金根注射液；高效液相色谱法；特征图谱中图分类号：S816.17文献标识码：A文章编号：10 0 2-2 8 13（2 0 2 3）2 1-0 12 0-0 4Doi:10.13557/ki.issn1002-2813.2023.21.023HPLC characteristics spectrum of Jingen injection researchHAN Hui-gangZHANG Chuan-jinNIU Hua-xingWEI Mao-lianZHANG Zhi-minAbstract:The purpose of the study was to establish the characteristic atlas of Jingen injection and provide the basis for itsquality evaluation.Chlorogenic acid was used as reference,and gradient elution was performed on Waters X Bridge C18column(diameter 3.5 m,4.6 mm 250 mm)with acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution.The detection wavelengthwas 240 nm,the flow rate was 1.0 mL/min,and the column temperature was 30.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e w e r e7 characteristic peaks in the chromatogram,and the retention time was consistent with that of the corresponding reference.The study indicates that the method has high precision,strong specificity and good repeatability,and can control theintrinsic quality of Jinjen injection more effectively.Key words:Jingen injection;HPLC;characteristic spectrum金根注射液现收载于中国兽药典2 0 2 0 年版二部，由金银花、板蓝根两味药材组成，经提取精制而成纯中药注射剂，具有清热解毒、化湿止痢的功效，临床主要用于治疗湿热泻痫、仔猪黄、白痫等疾病。现标准对方中板蓝根采用薄层色谱定量鉴别（精氨酸）金银花（指标成分绿原酸），缺乏代表性、专属性。现代药理研究表明，板蓝根含有的（R，S）-告依春、核苷类成分、多糖类物质是其发挥抗病毒的主要有效成分，其中，（R，S）-告依春在板蓝根药材中的含有量比较稳定，因此2020年版中国兽药典二部将（R，S）-告依春作为板蓝根药材含量控制指标成分 2-31。研究发现，（R，S）-告依春作为天然生物碱具有一定的降脂作用。李明明14通过建立体外模型、体内模型，研究证实（R，S）-告依春对高脂饮食诱导的肝脏糖脂代谢紊乱具有积极调控作用，可显著降低甘油三酯、胆固醇含量，增强短链脂酰第一作者：韩会刚，硕士，研究方向为中兽药产品质量控制。通信作者：张传津，大学，研究员基金项目：兽药国家标准制修订项目（项目编号：ZY-2022-22)；国家重点研发计划重点专项“防治畜禽免疫系统疫病的现代中兽药产品创制（项目编号：2 0 17 YFD0501505）收稿日期：2 0 2 3-0 4-0 3辅酶A脱氢酶活性，对预防和治疗动物脂肪肝具有显著作用。金银花具有清热解毒、疏风散热之功效，在畜牧业生产中有悠久的应用历史，具有抗菌、抗病毒、消炎、抗氧化等功能 5。韩强等 0 在蛋鸡基础日粮中添加金银花黄芩提取物，结果表明，金银花黄芩提取物可显著提高产蛋率，还可调控蛋鸡脂质代谢，显著降低蛋黄胆固醇含量，可能与金银花含有较高抗氧化能力的有机酸类有关。现代药物化学研究表明，金银花含有挥发油、有机酸类、黄酮类、环烯醚类等多种活性药理成分，其中有机酸酸类在金银花中含量较高，是中国药典2020年版一部主要的质控指标性成分17-10 。特征图谱具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点，是公认的现代中药质量评价最常用的分析方法之一，可较全面表征中药产品内在的化学成分，有利于控制中药产品的制备工艺稳定性，从整体上提高了中药质量控制水平11-12 。基于此，本试验通过高效液相色谱法，以方中药物组分为依据，选取色谱中重要的特征信息，采用乙腈-0.1%磷酸溶液系统建立了金根注射液7 种成分的特征图谱，完善并提升了金根注射液原有的质量标准，为全面评价金根注射液质量提供技术参考。NO.212023饲料研究FEEDRESEARCH121检测技术1材料与方法1.1试验材料WatersE2695高效液相色谱系统，四元梯度泵，原装色谱工作站，自动进样器，柱温箱，二极管阵列PDA检测器，购自waters科技有限公司。Agilent1260高效液相色谱系统，四元梯度泵/G1311C，原装色谱工作站，自动进样器/G1329B，柱温箱/G1316A，二极管阵列DVD检测器，购自安捷伦科技有限公司。KQ-400DE数控超声波清洗器，电源2 2 0 V，电功率400W，工作频率40 kHz。乙腈为色谱级，磷酸为优级纯（含量大于8 5%），无水乙醇为分析纯，水为超纯水。对照品：(R,S)-告依春（中国食品药品检定研究院，含量：10 0%，批号：1117 53-2 0 17 0 6），新绿原酸（上海安谱璀世标准技术服务有限公司，含量：97.4%，批号：2204349），绿原酸（中国食品药品检定研究院，含量：96.3%，批号：110 7 53-2 0 2 119），隐绿原酸（PANPHYChemicals Corporation，含量：98%，批号：2 5N-RFV-01-8），3,4-O-二咖啡酰奎宁酸（成都曼思特科技有限公司，含量：99.0 5%，批号：MUST-21030602），3,5-O-二咖啡酰奎宁酸（中国食品药品检定研究院，含量：95.9%，批号：1117 8 2-2 0 2 2 0 8），4,5-0-二咖啡酰奎宁酸（中国食品药品检定研究院，含量：94.9%，批号：111894-202205)。每种样品各10 0 支，均为自制，药材均经检定：阳性样品1（批号：2 0 2 2 0 2 0 1，规格：10 mL/支，提供日期：2 0 2 2.0 6），阳性样品2（批号：2 0 2 2 0 2 0 1，规格：10mL/支，提供日期：2 0 2 2.0 6），阳性样品3（批号：20220202，规格：10 mL/支，提供日期：2 0 2 2.0 6），阳性样品4（批号：2 0 2 2 0 2 0 2，规格：10 mL支，提供日期：2022.06），阳性样品5（批号：2 0 2 2 0 2 0 3，规格：10 mL/支，提供日期：2 0 2 2.0 6），阳性样品6（批号：2 0 2 2 0 2 0 3，规格：10 mL/支，提供日期：2 0 2 2.0 6），缺板蓝根阴性样品（规格：10 mL/支，提供日期：2 0 2 2.0 7），缺金银花阴性样品（规格：10 mL/支，提供日期：2 0 2 2.0 6）。1.2色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂（WatersXBridgeC18色谱柱，3.5m，4.6 mm2 50 mm，或效能相当的色谱柱)；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为2 40 nm，流速为1.0mL/min，柱温为32 38，理论板数按绿原酸峰计算应不低于10 0 0 0。金根注射液梯度洗脱条件见表1。1.3参照物溶液的制备取（R，S）-告依春、绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1mL各含（R，S）-告依春2 g、绿原酸150 g的混合溶液表1金根注射液梯度洗脱条件单位：%时间/min流动相A流动相B0134961320489692202589225308109290303310903335102090803550203080705051307070305156704309656654961.4供试品溶液的制备精密量取本品5mL置于50 mL棕色瓶中，加50%甲醇适量，超声处理（功率40 0 W，频率40 kHz）2 0 mi n，放置至室温，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀。2结果与分析2.1检测波长的选择以PDA检测器3D扫描19 0 450 nm波长范围，通过不同波长色谱图的对比，发现在2 40 nm处各种化合物均具有良好的响应值且各峰分离良好，最终选择2 40 nm作为检测波长。2.2方法学考察2.2.1精密度试验取同一份样品，连续进样6 次，每次进样10 L，按色谱条件测定相对保留时间与相应的各色谱峰的峰面积。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD0.2%，各色谱峰峰面积的RSD1.5%，表明仪器精密度符合规定2.2.2稳定性试验取同一份样品，分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样10 L，记录色谱图并计算各峰相对保留时间，结果表明，各色谱峰12 h内的相对保留时间RSD0.12%，表明金根注射液样品在12 h内稳定。2.2.3重复性试验对同一批供试品样品，重复配制6 份，各取10 L注入色谱仪，将色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2 0 12 版）”，设对照色谱图为参照图谱S1进行各峰匹配，采用平均数、时间窗为0.6 min，计算6份样品（S2S7）相似度，结果见表2。由表2 可知，相似度均大于0.98 3，表明重复性符合规定2.3金根注射液特征图谱的建立及相似度评价2.3.1特征图谱建立按色谱条件测定混合参照物溶液及6 批金根注射液样品，将色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统充（2 0 12 版）”，以S1为参照图谱，采用平均数、NO.212023饲料研究FEEDRESEARCH122检测技术时间窗为0.3min，进行自动匹配，计算6 批金根注射液与对照图谱之间的相似度。共有7 个特征峰，金根注射液样品和对照品的HPLC色谱图见图1，金根注射液不同批次叠加图谱图见图2。表2样品特征图谱与对照图谱的相似度评价结果样品编号相似度样品编号相似度S11.000S50.984.S20.984S60.984S30.984S70.984S40.9830.28F0.24S0.200.160.1260.08230.04110203040506070时间/min(a)金根注射液样品0.70FS0.600.500.3030.20260.1010203040506070时间/min(b)对照品图1金根注射液样品和对照品的HPLC色谱图1.500S12506231000S7750S6S5500S4S.32.50S2SI4812162024283236404448525660664.68时间/min图2金根注射液不同批次叠加图谱2.3.2共有特征峰的确认参照物溶液中与金根注射液中相应的7 个共有峰通过色谱图与光谱图比对均有很好的重合性。同时确认1号峰为新绿原酸；2 号峰为(R,S)-告依春；3号峰为隐绿原酸；4号峰为3,4-0-二咖啡酰奎宁酸；5号峰为3,5-0-二咖啡酰奎宁酸；6 号峰为4,5-O-二咖啡酰奎宁酸；S峰为绿原酸。金根注射液处方中金银花有较高含量的绿原酸，出峰时间也较适宜，因此，设定为参考峰S并计算各特征峰与S峰的相对保留时间，结果显示各特征峰的相对保留时间的RSD2.94%，重现性符合要求。按照相对保留时间表征各色谱峰的标准要求，初步得到金根注射液的特征图谱的技术参数文（见表3）。表3金根注射液HPLC特征图谱中特征峰保留时间相对保留相对保留时间的峰号保留时间/min时间RSD/%113.5480.5240.94217.0710.6732.94311.9731.1470.25特征峰（S)25.8311.000442.0781.6171.90642.6891.6401.96743.7381.6881.75注：“二”表示无偏差。3讨论3.1检测波长的选择采用梯度洗脱的方式，PDA检测器，3D扫描范围90450nm，2 D 检测波长，由各组分的光谱图可得（R，S）-告依春最大吸收波长为2 40 nm，绿原酸等系列化合物最大吸收波长为32 4nm。（R，S）-告依春在32 4330nm等处吸收太小，由于金根注射液中绿原酸、（R，S）-告依春两种组分含量差别太大，绿原酸的含量大约是（R，S）-告依春的146 倍，所在优先选择（R，S）告依春的最大吸收波长处。此外，在2 40 nm处各种化合物均有良好的响应值，且各峰分离良好，最终选择240nm作为检测波长1133.2色谱柱的选择先后测试5根色谱柱，分别为AgilentEclipseplusC18(5 m，4.6 m m 2 50 m m)、A g i l e n t Z O R BA X SB-C18（5 m，4.6 mm 2 50 mm)、w a t e r s XBr i d g e C18(3.5 m,4.6mm 250 mm)、w a t e r s A t l a n t i s T 3（5 m,4.6mm250mm）、赛默飞世尔科技（中国）SyncronisC18（5m，4.6 mm2 50 mm）。通过色谱图分析，只有waters色谱柱XBridge C18(3.5m，4.6 m m 2 50 m m)色谱图分离度较好。进一步进行耐用性试验，对6 批供试品进行测定，结果相似度均大于0.98，因此本方法采用waters色谱柱XBridge C18(3.5 m,4.6mm 250mm)3.3共有特征组分的选择金根注射液处方虽然仅有金银花、板蓝根等两味中药，但其含有的化学成分复杂。随着近些年来对板蓝根质量研究深入，有机酸类（精氨酸、亮氨酸、L-脯氨酸等）、核苷类（腺苷、尿苷和鸟苷等）、黄酮类及抗菌脂溶性成分（如靛蓝、靛玉红等）均成为板蓝根含量测定或指纹图谱共有组分的选择对象4-10 。金银花及其制剂是兽医临床常用药材17-18，随着现代药理研究不断深入，金银花的质控指标性成分已达15种，分别是有机酸酸类（绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、NO.212023饲料研究FEEDRESEARCH123检测技术异绿原酸B、菊苣酸、3,5-二-0-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸等）、黄酮类（金丝桃苷、芦丁、木犀草苷、皮素等）、环烯醚类（马钱苷酸、马钱苷、7-表-马钱苷、獐芽菜苷、断氧化马钱苷等）【7-9，其中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸是金银花含量较高的酚酸类组分，也是中国药典采纳的主要质控指标组分19-2 0 。由于在金根注射液处方中，金银花、板蓝根各自所含目标化合物具有专属性，考虑到产品质量标准最终要应用于畜牧行业实际生产、检验中，同时兼顾企业的检验能力，尽量减少检验成本，提高工作效率。因此，本试验从十多种目标化合物中最后锁定7 种代表性参照物：新绿原酸、（R，S）-告依春、隐绿原酸、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-0-二咖啡酰奎宁酸、绿原酸作为共有特征组分。4结论本试验采用HPLC-PDA法，选取方中金银花、板蓝根比较重要的7 个特征指标成分，建立金根注射液HPLC特征图谱。HPLC作为控制金根注射液质量的鉴别手段，灵敏度高，重现性好，仅用到甲醇、乙腈两种有机溶媒，对环境友好；而且与薄层色谱法相比，该方法大大缩短了检测时间，提高了工作效率。面对中药复方制剂多组分复杂体系，采用指纹图谱、特征图谱能够反映中药多成分特点，从而整体控制中药质量，确保其内在质量的均一、稳定，在中药质量控制中具有优势，也是世卫组织认同的中药质量评价方法，是中兽药标准提升的有效方式。参考文献1中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典(二部)2 0 2 0 年版 M。北京：中国农业出版社，2 0 2 0.2颜晓维,何蓉,刘芳.复方板蓝根颗粒中有效成分研究进展.广东化工,2023,50(4):94-95.3陈丹,戚建中,符国成,等.复方板蓝根颗粒HPLC指纹图谱研究.中国民族民间医药,2 0 2 2,31(9):40-44.4李明明.板蓝根提取物表告依春对高脂饮食诱导的肝脏糖脂代谢的调控研究 D.南宁：广西大学,2 0 2 2.5孙全友,王琳燚,邓文,等.金银花的作用机理及其在动物生产中的应用DI.中国饲料,2 0 2 3(7):50-55.6韩强,闫聪聪,张小东,等.金银花黄苓提取物对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋品质、抗氧化功能和脂质代谢的影响).饲料工业,2 0 2 3,44(11)：48-53.7路俊仙,赵秋晨,林慧彬,等.金银花质量控制研究进展.中华中医药学刊,2 0 2 3,41(8):56-6 2.8段慧芳,吴散南，朱亚莹,等.UPLC同时测定不同产地金银花中10 种成分.中草药,2 0 19,50(2 3):58 58-58 6 4.9缪艳燕,徐帮会,徐剑,等.金银花的HPLC指纹图谱建立及其抗炎作用谱-效关系研究).中国药房,2 0 2 0,31(2 0):2 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