ChIP操作步骤.doc

ChIP实验步骤

第一部分、细胞的甲醛交联与超声破碎
1. 交联前的准备工作
（1）细胞准备：对细胞进行一定条件的处理，以确保目的基因的转录激活。细胞密度应达到1×106细胞/10 cm培养皿。
（2）配制1％甲醛溶液：270 μl 37%甲醛加入10 ml无血清细胞培养液中即可，应使用高质量的甲醛。
2. 交联与超声破碎
优化超声条件，以保证目的细胞的染色质DNA能被剪切为200 bp～1000 bp的片段，具体操作如下（以HepG2细胞为例）：
（1）小心吸出细胞培养液，加入1％甲醛溶液10 ml，37℃孵育10 min，然后置冰上5 min终止固定。
（2）小心尽量吸净培养液，用预冷的PBS 3 ml洗细胞两次。
（3）加入预冷的内含PMSF（10ul）的PBS 1 ml。刮取细胞并移至离心管中，于4℃以1200 rpm（约3000 g）离心5 min，小心移走上清液，得到细胞沉淀（细胞沉淀可于-80℃保存数月）
（4）以200μl SDS裂解缓冲液重悬细胞（含PMSF：2ul），冰上放置10 min
（5）冰上超声剪切染色质DNA，使其成为200 bp～1000 bp的片段（10个脉冲，每个20 s，脉冲间隔20 s）
（6）加入5M Nacl 8 μl，65℃，4h至过夜，以解交联
（7）琼脂糖凝胶电泳观察剪切效果（所获超声剪切物可于-80℃保存数月）。
第二部分、免疫共沉淀
如果超声条件优化已经优化好，在步骤“（一）.2(5)”后，进行下列步骤。对于阴性对照，采用下述步骤“5”所述。
接上述2(6)
1. 4 ℃，13,000rpm离心10min，转移上清至2ml离心管中。
2. 以含蛋白酶抑制剂的CHiP稀释缓冲液1800μl，稀释200μl的上清至2ml。
3. 为了去除与蛋白A-琼脂糖非特异结合的分子，加入75 μl蛋白A/鲑鱼精DNA琼脂, 4℃旋转孵育30 min。
4. 4℃, 以1000 rpm离心1 min以沉淀琼脂，将上清转移至新的离心管中。并从这2ml中取出20μl作为“input DNA”对照。
5. 将上清分为两份，一份加入针对DNA结合蛋白的特异性抗体2μg，另一份加强如抗体阴性对照（IgG）2μg，4℃旋转孵育过夜（孵育时间可视情况而调整）。
6. 加入60μl 蛋白A/鲑鱼精DNA琼脂, 4℃旋转孵育60 min以收集抗体/转录因子复合体。
7. 4℃, 以1000 rpm离心1 min，小心移除上清（内含未结合及非特异DNA）。
8. 按以下顺序洗涤蛋白A/抗体/转录因子/DNA复合物，每种缓冲液加0.5ml，旋转孵育3min，然后4℃, 1000 rpm离心1 min，弃上清液。
（1） 低盐洗涤缓冲液，1次；
（2） 高盐洗涤缓冲液，1次；
（3） LiCL洗涤缓冲液，1次；
（4） TE缓冲液，2次
第三部分、洗脱与转录因子结合的DNA
1. 配制新鲜的洗脱缓冲液（1%SDS, 0.1M NaHCO3, 按照1：9体积比配制）。
2. （接（二）.8）向蛋白A-琼脂糖/抗体/抗原/DNA复合物中，加入200 μl洗脱缓冲液，轻弹管壁混匀，室温放置5min. 1200 rpm离心1 min，收集上清液。
3. 向洗脱上清及放置在一边的“input DNA”管中，分别加入5 mol/L NaCl 20 μl，65℃水浴4 h,以解交联。短暂离心收集管壁液体（该样品可-20℃保存）。
4. 加入0.5 mol/L EDTA 10 μl，1 mol/L Tris-HCl（pH6.5）20 μl，10 mg/ml的蛋白酶K 2 μl，45℃孵育10min。
5. cycle-pure法回收DNA，-20℃保存样品
① 加入400μl PC缓冲液，混匀后12000 rpm离心1 min过柱
② 以500μl wash buffer 12000 rpm离心1 min洗柱，弃滤液；
③ 12000 rpm离心空柱1min，然后将柱置入一新的EP管中，加入30μl ddH2O，12000 rpm离心收集DNA
第四部分、DNA样品PCR分析
以上述溶解于ddH2O中的DNA作模板，利用特异性引物进行PCR。应使PCR终止于线性反应时段（具体PCR参数和循环次数应进行优化）。最后通过对扩增产物进行电泳（乃至于测序）来分析蛋白质所结合的DNA情况。
1. PCR体系
TaKaRa Taq （5 U/μl）
0.1 μl
10×PCR Buffer（Mg2+ free）
Mixture 7.6μl
2.5 μl
dNTP Mixture（各2.5 mM）
2 μl
Mgcl
2 μl
上下游引物
1 μl
模板DNA
1μl
灭菌蒸馏水
16.4μl
总体积
25 μl
2. PCR条件
95℃ 4min
95℃ 30 sec.
55℃ 30 sec. 25 Cycles
72℃ 30 sec
3. 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果