酵母菌感受态制作及转化.doc

Y187 酵母感受态制作及转化
1）挑新鲜单菌落 Y187 于 8 ml YPDA 培养液， 30℃，250 rpm 培养 16-18h；
2）至 OD600＞1.5，1：10 转接，此时 OD600≈0.3；
3）30℃，250 rpm，4-7 h，每 2 h 检测一次，直到 OD600=0.4-0.6；
4）转入 2 个 50 ml 离心管，5100 rpm,5 min,弃上清；
5）加入 1/2 V ddH2O,洗涤细胞，5100 rpm,5min,弃上清；
6）每管中分别加 1 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；
7）每管中分别加 0.5 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；
8）每管中分别加 0.5 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；
9）每管中分别加 0.4 ml 1×TE/LiAc，每管 100 ul 分装；
10）分别加入 100 ng 左右 DNA（plasmid）和 0.1 mg 鲑鱼 DNA（10 mg/ml,10 ul）,移液器抽吸混匀溶液；
11）分别加入 600 ul LiAc/PEG，高速混匀（10 s-1 min 内）；
12）30℃摇床恢复 30 min；
13）超净台（无菌条件下）加入 70 ul DMSO,轻轻颠倒混匀；
14）42℃热激 15 min；
15）冰上放置 1-2 min；
16）14 000 rpm,15 s,去上清；
17）300 ul TE 重悬细胞；
18）100 ul/1 ul 分别涂布于 YPDA 平板；
100 ul/1 ul 分别涂布于 SD/-Trp 单缺陷平板；
100 ul/1 ul 分别涂布于 SD/ -Trp/ -His 双缺陷平板上，30℃倒置培养 48-72 h 可见转化菌落。