细菌芽孢染色.doc

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学号：
班级：12级生物基地4
组别：周三第六大组
时间：2013.10.18
细菌芽孢染色
一．实验目的
1. 学习掌握芽孢染色法，了解芽孢的形态特征。
2. 巩固显微操作技术及无菌操作技术。
二．实验原理
细菌芽孢染色的基本原理：芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚、透性低而不易着色，但是芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力较强的染料，如孔雀绿，在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。再用对比度大的复染剂（如番红液）染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样就可以将两者区别开来。 在不同细菌中，芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形。常见的细菌芽孢形态和着生位置如下图所示：
三．实验器材
1、菌种：枯草芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌，牛肉膏培养基。
2、溶液和试剂：a) 5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，95%乙醇，蒸馏水等。b) 香柏油、二甲苯。
3、仪器及其它用品：普通光学显微镜、电子天平、擦镜纸、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、锥形瓶等。
四．操作步骤
1. 实验流程图：
涂片→加热干燥固定→孔雀绿覆盖→
微热5min→冷却→水洗→番红复染→
水洗干燥→镜检
2. 详细步骤：
a) 涂片，加热干燥及固定：在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水，分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌。然后按照常规方法加热干燥及固定；
b) 孔雀绿加热染色：用木夹夹住载玻片，向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位，然后在酒精灯上微微加热（孔雀绿着色能力强，加热可使较难染色的芽孢染成绿色，且再难洗脱）至染液冒蒸汽开始计时并维持5min，注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜，过热或加热不足均会影响观察效果，且加热时在载玻片上随时补加染液，切勿让涂片干涸；
c) 水洗：水洗一定要等载玻片冷却后进行，否则可能导致载玻片的破裂。具体水洗按常规方法进行；
d) 复染：用0.5%番红水溶液复染2min；
e) 水洗并干燥：按常规方法水洗后自然干燥；
f) 镜检：先在低倍镜下寻找视野范围，然后换用高倍镜调焦，最后加香柏油在油镜下仔细寻找两种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢。
五．实验结果及分析
1. 染色结果照片展示：

图1枯草芽孢杆菌芽孢图示(10×100)

图2梭状芽孢杆菌芽孢图示(10×100)
2. 实验结果记录：
项目
菌种
芽孢形状
芽孢着生位置
芽孢囊形状
枯草芽孢杆菌
椭圆形
位于菌体中央或稍偏
圆形不膨大
梭状芽孢杆菌
圆形或卵圆形
位于菌体中央，极端
或次极端
膨大
3. 结果分析：
1） 本次实验中，枯草芽孢杆菌的染色效果较好，红色的菌体和绿色的芽孢对比鲜明，但是视野中菌体数量较多，原因可能是用接种环刮取了过多的菌体到载玻片上。
2） 梭状芽孢杆菌的芽孢染色效果较好，但是菌体染色太淡，呈透明状，原因可能是用番红染液复染的时间较短，或者是复染后水洗时间过长，导致染色效果不够理想。
六．思考题
1. 为什么芽孢染色法需要进行加热？能否用简单染色法观察到细菌芽孢？
答:因为与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，而加热时芽孢的通透性高，此时染液可以进入从而使芽孢着色，而简单染色法不能使芽孢染色，所以不能看到。
2. 若在你的制片中仅看到游离芽孢，而很少看到芽孢囊和营养细胞，试分析原因。
答：（1）可能是因为芽孢的壁厚，耐受力比细胞体强，在涂片的过程中由于用力过大 ，使得细胞体的细胞壁被压碎，从而使得芽孢脱落出来；
（2）也可能是因为菌体培养时间过长，芽孢正处于复苏阶段，大多数芽孢从芽孢囊中游离出来了。
（3）可能是芽孢染色时水洗不充分，细胞还是孔雀绿的颜色
（4）菌种培养的环境太恶劣了，营养体几乎都变成芽孢了。
（5）可能是给芽孢染色用水洗时没洗干净，细胞还是孔雀绿的色彩。
（6）复染出现问题了，可能是复染时间不够，没染上，或是水洗的太厉害，把染液都冲走了。
3. 用孔雀绿初染芽孢后，为什么必须等玻片冷却后再用水冲洗？
答:如果直接放到水下可能会导致玻片迅速受冷破裂。
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