小鼠在免疫抗原后机体产生的特异性免疫应答研究.doc

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实验目的：验证小鼠在接受抗原之后机体产生了特异性免疫反应，并观察小鼠各项生理指标以及免疫器官的反应状况，再观察T细胞和B细胞在此应答的反应状况。
实验假设：小鼠免疫灭活疫苗之后，机体会逐渐产生特异性免疫应答，一方面T细胞在接受抗原刺激之后，经过阳性和阴性选择，T细胞从CD4，CD8双阳性选择为单阳性T细胞，并逐步转移，最终到达淋巴结等组织产生效应；另一方面，B细胞也会发育分化为浆细胞和记忆细胞，相应的浆细胞产生抗体以应对抗原。由于小鼠在接受抗原之后，免疫细胞在胸腺和脾脏内的数量和种类将发生变化，另外小鼠血清中也会产生相应的抗体。
因此假设，在排出其他偶然因素引起的误差的情况下，有以下结果：
1. 免疫后的小鼠胸腺大小比对照组更小，脾脏大小比对照组更大；另外免疫后小鼠的淋巴结比对照组更大。
2. 免疫后的小鼠胸腺免疫细胞数量小于对照组，脾脏免疫细胞数量大于对照组。
3. 免疫后小鼠胸腺中的单阳性淋巴细胞比对照组单阳性淋巴细胞更多，双阳性淋巴细胞比对照组更少；免疫后小鼠的脾脏中单阳性淋巴细胞数量多于对照组单阳性淋巴细胞数量。
4. 免疫后小鼠血清里面的抗体检测呈阳性，对照组小鼠血清抗体检测呈阴性。
预期结果：
预计结果与假设一致，即：
1. 免疫后的小鼠胸腺大小比对照组更小，脾脏大小比对照组更大；另外免疫后小鼠的淋巴结比对照组更大。
2. 免疫后的小鼠胸腺免疫细胞数量小于对照组，脾脏免疫细胞数量大于对照组。
3. 免疫后小鼠胸腺中的单阳性淋巴细胞比对照组单阳性淋巴细胞更多，双阳性淋巴细胞比对照组更少；免疫后小鼠的脾脏中单阳性淋巴细胞数量多于对照组单阳性淋巴细胞数量。
4. 免疫后小鼠血清里面的抗体检测呈阳性，对照组小鼠血清抗体检测呈阴性。
实验方法：
一、小鼠免疫后与对照组的中枢和外周免疫器官的观察
实验原理：
实验采取DH5α灭活菌液为抗原，对小鼠进行注射，小鼠在接受抗原之后，机体会对其产生免疫应答，然而抗原在体内具有一定的半衰期，重复注射可以提高机体的免疫应答强度。当小鼠产生特异性免疫应答之后，机体的中枢和外周免疫器官大小会发生变化，即表明小鼠产生的免疫应答程度。
实验材料：
1. BALB/c小鼠：6-10周龄，雄鼠，清洁级，上海斯莱克实验动物有限公司
2. DH5α灭活菌液（个/ml）：制备方法：将DH5α扩增至饱和，取出3500rpm离心15min，弃上清，用生理盐水重悬计数，121℃，20min灭活，计数并稀释。（3次接种，每次500ul）
3. 工具：1ml注射器（针头），酒精棉球，眼科剪，眼科镊，眼科弯镊，废物筒，解剖板，离心管（离心管架），小鼠尸体袋。
4. 试剂：生理盐水（3次接种，每次500ul）
实验方法：
①第一次抗原免疫小鼠
1. 做好准备工作，注射器内装入1ml DH5α灭活菌液和生理盐水
2. 腹腔注射：
小心抓起小鼠，使小鼠腹部朝上，用酒精棉球擦一擦，向小鼠的中线略左的位置，先挑其表皮，再斜向下插入0.5-1cm的距离，注射后拔出，用剪刀剪去耳朵做好标记。
3. 鼠笼做好标记，等待一周后，再第二次免疫小鼠。
②第二次免疫小鼠
大约一周后，根据做好的标记，用相同的方法进行免疫，再放回鼠笼，等待一周。
③第三次免疫小鼠
大约一周后，根据做好的标记，用相同的方法进行免疫，再放回鼠笼，等待一周。
④取小鼠血清，脾脏，胸腺及腹股沟淋巴结
a. 小鼠的眼部取血
1. 离心管，离心管架准备，套上保鲜膜，并做好标记。
2. 对应标记的取血：小心抓起小鼠，暴露其眼球，小心剪去眼球以及相应血管，并轻轻抚摸小鼠胸部，尽量收集血液。
3. 等小鼠不再流血后，脱臼法处死小鼠，血液静置一小时，并编号。
b. 脾脏，胸腺及腹股沟淋巴结的摘取
1. 取处死的小鼠，腹部朝上，使腹腔伸展，并固定四肢。
2. 解剖剪去上皮，小心将上皮撕开，在腹股沟约三叉血管交叉处寻找类似球形实心组织，即为淋巴结。
3. 小心剪开腹部，在小鼠右侧肠道位置找到脾脏并取出。
4. 小心剪开胸骨，在心脏上部找到两瓣白色的器官，即为胸腺。
c. 血清分离
1. 静置的血清，离心5min，3000rpm
2. 小心取上清液，编号，若为淡黄色，即可收集保存，否则重复第一步。
3. 冷藏血清，为后续实验做准备。
数据获取及处理：
获得免疫组和对照组的免疫器官之后，将其置于一张纸上对比拍照，并通过照片观察可得到相应结论。
二、小鼠免疫后淋巴器官中淋巴细胞绝对数的变化
实验原理：
利用200目钢丝筛网，研磨胸腺和脾脏并过滤掉结缔组织，即可获得淋巴细胞和红细胞的混合物，通过红细胞裂解液的作用使红细胞裂解，即可获得纯的淋巴细胞，通过血细胞计数板的计数，即可反应各个淋巴器官的淋巴细胞的数量变化。
实验材料：
1. BALB/c小鼠：6-10周龄，雄鼠，清洁级，上海斯莱克实验动物有限公司
2. DH5α灭活菌液（个/ml）：制备方法：将DH5α扩增至饱和，取出3500rpm离心15min，弃上清，用生理盐水重悬计数，121℃，20min灭活，计数并稀释。（1次接种， 500ul）
3. 工具：1ml注射器（针头），酒精棉球，眼科剪，眼科镊，眼科弯镊，废物筒，解剖板，离心管（离心管架），小鼠尸体袋，细胞计数板（载玻片），显微镜，擦镜纸，天平，离心机，200目筛网。
4. 试剂：生理盐水（1次接种，500ul）,75%酒精，1×PBS，RBC裂解液，3%冰醋酸。
实验步骤：
①小鼠免疫：本实验需要免疫一次的小鼠，实验方法与三次免疫小鼠的第一次相同。
②眼球取血：方法同前面的取血方法相同。
③小鼠的脾脏和胸腺的淋巴细胞分离
1. 摘取小鼠的脾脏和胸腺，置于两份PBS溶液中，做好标记。（方法与脾脏和胸腺的观察的摘取方法相同）。
2. 用200目筛网研磨过滤，并转移到15ml离心管中，编号。
3. 2500rpm，10min离心（天平配平）。
4. 弃上清，对脾脏细胞加入1mlRBC裂解液重悬裂解，5min；对胸腺细胞加入1mlPBS，待用。
5. 脾脏溶液加1×PBS终止裂解，配平，4℃离心2000rpm，10min。
6. 向脾脏细胞加入1mlPBS重悬，将脾脏细胞和胸腺细胞悬液混匀，各取10ul，编号。
7. 加入等体积的冰醋酸，PBS稀释，方法如下：
免疫后：脾脏200倍，胸腺10倍
对照组：脾脏100倍，胸腺100倍
8. 细胞计数
a. 取计数板和盖玻片，用酒精洗净后用擦镜纸擦干
b. 盖玻片置于计数室上部，用枪吸取10ul待测细胞溶液，加至载玻片边缘，待其自行渗入。
c. 显微镜观察计数（10×10，100倍）
最后结果=四个大格子总数×0.25××稀释倍数
数据获取和处理：通过显微镜下观察计数板的四个大方格，做到数上不数下，数左不数右的原则，计数所有细胞后，最后细胞的个数=四个大格子总数×0.25××稀释倍数，并记录下来。
三、小鼠免疫后T细胞的发育分化的情况观察
实验原理：
①免疫标记技术：指用荧光素，放射性同位素，酶，铁蛋白等作为追踪物，标记抗体进行抗原抗体反应。
本次实验使用荧光素标记后，利用流式细胞仪，对相应的细胞进行检测。
②流式细胞术：是一种在液流状态下，通过检测大批量的单个细胞的生物学性质，并将其分类的一种技术。一般通过快速测定荧光，电阻，光散射和光吸收等方法来测定细胞的各种参数。
测量样品要求：
单细胞悬液，细胞大小0.2-50um，样品至少有20000个细胞，浓度个/ml
流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了细胞表面物质的浓度，经过光电倍增管将相应的信号转化为电信号，电信号转化为数字信号，通过计算器的处理，最后将分析结果显示在计算机上。
抗体选择：由于需要将CD4，CD8阳性分离，因此标记CD4，CD8分子，于是采用：
FITC-CD4，PerCP-CY5.5-CD8两种荧光标记细胞。
同型对照：用与检测特异性无关的同型同亚型同荧光抗体染色，作为同型对照。
实验材料：
Ep管（Ep管架），离心机，移液器（枪头），吸水纸，流式管，废液缸。
1×PBS，大鼠血清（iso），抗体FITC-CD4，PerCP-CY5.5-CD8以及同型对照抗体。
FITC-CD4：用量0.3ug/5×
PerCP-CY5.5-CD8：用量0.3ug/5×
Iso：FITC-Rat IgG2a：用量0.3ug/5×
PerCP-CY5.5- Rat IgG2a：用量0.3ug/5×
实验步骤：
1. 由细胞计数的结果，计算出需要从分离的胸腺和脾脏细胞所取的体积（每管需要1-5×个），取样与1.5mlEp管中，空白一管，单标两管，同型对照一管，样品两管，做好标记，并加入PBS补满1ml。
2. 4000rpm离心5min。
3. 弃上清，加入75ulPBS重悬细胞。
4. 加入10ul大鼠血清封闭，4℃避光放置30min。
5. 加抗体，按如下方法添加。

空白
CD4单标
CD8单标
同型对照
对照组
免疫组
FITC-CD4

●

●
●
PerCP-CY5.5-CD8

●

●
●
FITC-Rat IgG2a

●

PerCP-CY5.5- Rat IgG2a

●

4℃避光放置30min。
6. 1ml1×PBS洗一次，4000rpm，5min离心。
7.弃上清，200ulPBS重悬细胞。
8.200目筛网过滤至流式管中，上机测试。
数据的获取和处理：经过FACScabibur流式仪的检测，得到一系列的流式图，经过软件flowjo7.6的处理，可得一系列的流式结果，经过对照与免疫组的对比，即可得到实验结果。
四、小鼠免疫后 B细胞功能的影响
实验原理：
小鼠免疫产生特异性应答之后，B细胞也会发育分化，从而转变为浆细胞，并产生相应的抗体。而对于本次实验，灭活DH5α会诱导B细胞产生IgG抗体，因此仅需检测IgG的作用效果，即可了解B细胞功能的变化情况。
①抗原抗体反应
a. 玻片凝集反应
玻片凝集反应是指将已知的抗体直接与未知颗粒性抗原物质混合，在适当电解质存在的情况下，两者作用出现凝集物即为阳性；无凝集物即为阴性。
b. 试管凝集反应
试管凝集反应是用已知的颗粒性抗原来检测抗体及其相对含量，用生理盐水将待测血清进行倍比稀释，然后加入等量的抗原悬液，经过一定时间后，根据凝集程度可以判断抗体效价。
②Elisa法测定IgG含量
Elisa（酶联免疫吸附试验）：将过量的抗体或抗原包被于载体上，通过抗原抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体上，经洗涤除去游离抗原后，加入底物成色，定性或定量分析待测物的存在或者含量的检测方法。
类型：夹心法，间接法，竞争法，捕获法，ABS-ELISA法
本实验采取间接法测定IgG含量，待测物为IgG，需要先包被一层抗原后，待被测抗体结合后，加入含酶标的二抗与待测抗体结合，经洗涤后，通过显色反应，再观察结果的方法。
实验材料：
①抗原抗体反应
载玻片，marker标记，移液枪（枪头），DH5α培养液（4×个/ml），LB培养基，免疫三次和对照小鼠血清，废液缸，试管16支（试管架），温箱，生理盐水。
②Elisa法测定IgG含量
酶标板（96孔），Ep管（Ep管架），移液枪（枪头），吸水纸37℃温箱
免疫一次，三次及对照血清，PBST（含1‰吐温20的PBS），assay液：稀释液（含0.5%BSA+1‰吐温20的PBS），HRP-Goat 抗小鼠IgG：2mg/ml，1:10000倍稀释，1×TMB，2M硫酸
实验步骤：
①抗原抗体反应
a.玻片凝集反应
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6
7
7
1. 载玻片按如图所示处理，编号1-7
免疫组
对照组

2. 向一号孔里加100ul生理盐水（对照组和实验组相同）
3. 取对照组和实验组血清20ul，分别加入两只Ep管中，各加入80ul生理盐水，混匀，各加10ul到2,3号孔上。（剩余80ul，5倍稀释）
4. 剩余80ul血清加入80ul生理盐水，混匀，各加10ul到4,5号孔（剩余140ul，10倍稀释）。
5. 140ul血清加入140ul生理盐水，混匀，各加10ul到6,7号孔（剩余260ul，20倍稀释）。
6. 向两组的1,2,4,6号加入5ul DH5α培养液，3,5,7号加入5ulLB培养基。
7. 30min，在显微镜下观察结果。
数据的获取和处理：在显微镜下观察每一个孔，观察里面是否存在白色絮状物质，若存在，即为阳性，否则为阴性。
b.试管凝集反应
1. 菌液稀释：需要8000ul菌液，稀释方法：
240ul菌液+9360ulLB培养基（1×个/ml）
取16支试管，编号，并各加入500ul稀释后的菌液
对照组：① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧实验组：① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧
8为对照组，1-7分别为40,80,160,320,640,1280,2560倍稀释
2. 血清稀释：
取玻片凝集反应的20倍稀释血清，加入260ul生理盐水（剩余520ul），加500ul到1号试管中，混匀，取500ul再加入到2号试管中，以此类推，知道七号管，取500ul弃置。
3. 向每一只管加500ul稀释后的菌液，震荡摇匀，37℃过夜。
4. 过夜后，观察实验结果，是否存在白色絮状物。
数据处理：实验之后的第二天，观察试管的沉淀情况，以及观察内部白色絮状物的多少，划分+等级，+++很高阳性，++较高阳性，+为阳性，-为阴性，观察到结果后并记录。
②Elisa法测定IgG含量
1. 抗原准备
DH5α→121℃ 20min灭活→超声破碎15min→12000rpm离心15min，弃细胞碎片→蛋白定量（400ug/ml）→PBS稀释（1ug/ml）
2. 包被，取两列孔，各加入100ul抗原溶液，4℃过夜后，洗板三次。
3. 封闭：10%BSA，每孔200ul，37℃，2h，4℃保存待用。
4. 稀释血清：取出免疫三次，免疫一次血清，做好标记，稀释：
需要的血清：1:200:3免200ul， 1免200ul， 3对100ul，1对100ul
1:1000：3免200ul， 1免200ul， 3对100ul，1对100ul
1:10000：3免200ul
稀释液（对照）：200ul
5. 洗板五次：加满洗液，倒掉洗液，并在吸水纸上扣干。
6. 上样，每孔100ul，37℃，60min封闭，上样图如图所示：
一次对照1；200一次对照1；1000
三次对照1；200三次对照1；1000
一次免疫1；200一次免疫1；200
一次免疫1；1000一次免疫1；1000
三次免疫1；200三次免疫1；200
三次免疫1；1000三次免疫1；1000
三次免疫1；10000三次免疫1；10000
对照组对照组
7. 洗板五次。
8. 加入1:1000稀释的HRP-Goat抗小鼠IgG每孔100ul，37℃，60min封闭。
9. 洗板五次
10.每孔加入80ulTMB显色1min。
11.2M硫酸终止反应，并测量450nm的OD值。
数据的获取及处理：终止反应后，立即使用酶标仪进行测量，测量出的结果将输入到计算机中，最后以表格的形式记录下来，以200稀释的对照血清的OD值对应的IgG含量作为1，计算免疫一次和免疫三次的IgG的相对含量，并作出对比，得出相应结论。
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