QDPR通过调控Beclin1改善UUO诱导的大鼠肾间质纤维化.pdf

806安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 11：21：19 网络出版地址:h t t ps：/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1340.017.h t mlQDPR通过调控Beclinl改善UUO诱导的大鼠肾间质纤维化高海洋I,何海兰駕张立国I，陈 曦打李治国彳摘要目的探讨醞型二氢生物喋吟还原酶（QDP R）在单 侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型肾间质纤维化中的作用及对 Bec l in l的影响。方法通过单侧输尿管结扎的方法构建 UUO模型，Ma sso n、COL I染色和West er n bl o t技术分析纤 维化进展及QDP R和Bec l in l的表达情况。慢病毒输尿管逆 行注射构建过表达QDP R基因和空载对照UU0模型，评估 慢病毒感染效率和QDP R表达情况,并检测QDP R过表达对 纤维化进展和Bec l in l表达的影响。结果 UUO模型组较 假手术组的胶原纤维表达水平增高（P 0.05）,QDP R表达 水平降低（P 0.05）,Bec l in l表达增高（P 0.05）o通过输 尿管逆行注射慢病毒，成功感染肾脏,并能增加肾脏QDP R 表达。过表达QDP R后，胶原纤维表达水平降低（P 0.05）,且Bec l in l表达水平下降（P 0.05）o结论 过表达 QDP R抑制了 Bec l in l的表达水平,改善了纤维化的进展，提 示过表达QDP R可能通过抑制Bec l in l进而抑制肾间质纤维 化。关键词醞型二氢生物喋吟还原酶;Bec l in l;肾间质纤维化 中图分类号R 364.2+4文献标志码A 文章编号1000-1492（2023）05-0806-06 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.017肾间质纤维化是许多进行性慢性肾脏疾病的共 同途径,最终导致终末期肾衰竭,其发病机制十分复 杂,主要特征是细胞外基质沉积、成纤维细胞积累、炎性细胞浸润等目前缺乏有效治疗方法。因 此，探讨肾间质纤维化的发病机制，对于预防和减轻 肾间质纤维化具有重要意义。醞型二氢生物喋吟还 原酶（q u in o id d ih y d r o pt er id in e r ed u c t a se,QDP R）在体 外研究中发现有抗纤维化作用,过表达QDP R能减 少转化生长因子-pl（t r a n sf o r min g g r o w t h f a c t o r-pl,TGF-pi）的表达，提示其在肾间质纤维化中有重 要作用。据报道，QDP R这一作用可能与自噬相2022-12-13 接收基金项目：河北省自然科学基金（编号:H2020209243）；河北省医学 科学研究课题计划（编号=20210159）作者单位J华北理工大学附属医院泌尿外科，唐山0632102华北理工大学公共卫生学院，唐山063210作者简介:高海洋，男，主治医师；李治国，男，教授，硕士生导师，责任作者,E-ma il:l izh ig u o n est.ed u.c n关。自噬是一种高度保守的细胞行为，其在单 侧输尿管梗阻（u n il a t er a l u r et er a l o bst r u c t io n,UUO）大鼠模型肾纤维化过程中起到双重作用7T。自噬 诱导肾小管萎缩和分解，从而促进纤维化,又可 能通过抑制上皮间质转化进而抑制纤维化。此 外，研究问发现Bec l in l是自噬过程的关键调节因 子之一。因此，该研究拟通过构建过表达QDP R的 UUO模型，探讨QDP R是否通过调控Bec l in l的表 达进而调控肾间质纤维化，为肾间质纤维化发病机 制的研究提供新的思路。1材料与方法1.1主要试剂慢病毒由华北理工大学李治国教 授课题组自制;QDP R抗体、o t-SMA抗体（美国P r ot ein t ec h 公司）；COL I（武汉博士德生物工程有限 公司）；E-Ca d h er in（ECa）抗体、Bec l in l 抗体（美国 P r o t ein t ec h公司）；山羊抗兔抗体（英国Abea m公 司）；枸椽酸三钠、柠檬酸（天津大茂化学试剂厂）;DAB（德国Sig ma公司）；Ma sso n染色试剂盒（珠海 贝索生物科技有限公司）。1.2实验动物3周龄,雄性健康清洁（SP F）级的 SD大鼠北京维通利华实验动物技术有限公司，实 验动物的生产许可证号：SYXK（京）2015-0017 24 只,体质量（237 13）g,置于北京中日友好医院医 学动物实验动物房饲养合格证号：SYXK（京）20054）019；伦理审批单位:华北理工大学；动物实验 研究的伦理审批号:LAEC-NCST-2017015。动物模 型的制备:UUO模型组（U组）：结扎大鼠左侧的 输尿管两端，并剪断中间的输尿管;假手术组（S 组）：与UUO模型组方法相同，唯一区别是只分离 左侧输尿管，并不结扎及剪断;UUO+QDP R空 载组（C组）：与UUO模型组方法相同，区别是在分 离左侧输尿管后，沿着输尿管逆行注射病毒滴度为 l.Ox 107 U过表达QDP R空载慢病毒50 pl,然后用 丝线结扎注射口的上方防止病毒流下,结扎输尿管 两端,剪断中间的输尿管;UUO+QDP R过表达组（Q组）：与UUO+QDP R空载组方法相同，唯一区 别为注射的病毒是过表达QDP R的慢病毒。造模后 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)807常规饲养,分别在7、14 d每组各处死3只。1.3免疫组化与Masson染色 造模7、14 d后，取 大鼠左侧肾脏做石蜡切片，然后进行免疫组化及 Ma sso n染色,最后在400倍的显微镜下观察，随机 选10个不重复的视野，用Ima g e J分析。1.4 Western blot 检测 West er n bl o t 分别检测 a-SMA、QDP R、ECa和Bec l in l的表达水平。取大鼠左 侧肾组织，液氮研磨后加入RIP A裂解液提取蛋白。Br a d f o r d法测定蛋白浓度，统一稀释到3 000|x g/ml,通过SDS-P AGE电泳每组跑15 pig蛋白，半干转到 NC膜,5%牛奶室温封闭2h,抗a-SMA(1:1 000)、QDP R(l:1 000)、ECa(l:1 000),Bec l in l(1:1 000)室温孵育2 h,TBST洗膜，二抗(山羊抗 兔1：3 000)室温孵育2 h,TBST洗膜，最后显影，使 用Ima g e J分析条带的灰度值，然后计算各蛋白目的 条带与内参的比值。1.5 统计学处理 所有数据均由IBM SP SS St a t ist ic s 21进行统计分析，计量资料采用xs进行统计 学描述，两组间比较采用独立样本t检验,P 0.05 示差异有统计学意义。2 结果2.1 UUO模型存在肾脏纤维化 单侧输尿管结扎 构建UU0模型(见图1),通过Ma sso n和COL I染 色以及West er n bl o t检测纤维化因子ECa和a-SMA 的表达情况。Ma sso n染色结果显示：UUO模型7 d 组(U7)中的胶原纤维高于S模型7 d组(S7)(t=-19.596,P 0.001),UUO 模型 14 d 组(U14)中的 胶原纤维高于S模型14 d组(S14)Q=-6.552,P 0.001)；COL I染色显示：U7组中的COL I的含 量高于 S7 组(t=-11.351,P 0.001),U14 组中的 COL I 的含量高于 S14 组(t=-4.939,P 0.01)；且，与S7组比较,U7组中ECa含量降低(t=7.387,P 0.05),a-SMA 含量升高(t=-3.058,P 0.05)；与S14组比较,U14组中ECa含量降低Q=7.866,P 0.01),a-SMA 含量升高&=-7.98,P 0.01)o 见图 2。2.2 UUO模型中QDPR表达 肾脏免疫组化和 West er n bl o t检测了 QDP R的表达情况。免疫组化 结果显示:与S7组比较,U7组中的QDP R表达水平 降低(227.256,P 0.001)；与 S14 组比较,U14 组 中的QDP R表达水平降低(t=18.499,P 0.001)。West er n bl o t 结果显示：U7 组(t=20.897,P 0.001)和 U14 组(=8.301,P 0.01)中 QDP R 含 量均低于S组。见图3。2.3过表达QDPR基因的UUO模型的构建 C7 组(慢病毒对照7 d组)和Q7组(QDP R慢病毒过表 达7 d组)中慢病毒标签ZsGr een均有表达;C14组(慢病毒对照14 d组)和Q14组(QDP R慢病毒过表 达14 d组)组中ZsGr een亦有表达,提示慢病毒感 染肾脏成功。免疫组化染色QDP R的结果显示:与 C7组比较，Q7组中QDP R的表达差异无统计学意 义(i=1.105.P=0.331)；而与 C14 比较，Q14 中 QDP R染色的表达面积增加(t=-34.138,P 0.001)。West er n bl o t结果显示:与C7组比较，Q7 组中QDP R的表达差异无统计学意义(t=1.022,P=0.365)；与C14比较,Q14中QDP R的表达增加(/=-7.061,P 0.01)。结果提示慢病毒在输尿管 逆行注射后7 d已有表达，但未增高,14 d过表达组 中QDP R显著增高。见图4。2.4过表达QDPR对UUO诱导的大鼠肾间质纤 维化的影响 Ma sso n染色显示:与C14组比较,Q14 组的胶原纤维面积降低(t=6.811,P 0.01)；COL I染色显示:与C14组比较,Q14组的COL I染色 面积降低(t=4.643,P 0.05)；West er n bl o t 检测显 示:与C14组比较,Q14组中的ECa蛋白的表达水 平增高(t=-10.280,P 0.05),a-SMA 表达水平 降低(t=2.922,P 0.05)。见图 5。2.5 过表达QDPR对Beclinl蛋白的表达的影响 与S14比较,U14组中Bec l in l蛋白的表达水平升 高(/=-3.272,P 0.05)；过表达 QDP R 后，与 C14 组比较,Q14组中Bec l in l蛋白的表达水平降低Q=10.404,P 0.001)o 见图 6。3讨论肾间质纤维化是各种终末肾病发展到终末肾功 能衰竭的终末途径卫，已成为危害人类生命健康 的公共卫生问题。深入认识肾脏纤维化的发病机 制，对肾脏疾病的预防、诊断和治疗具有重要的意 义。808安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)AU7S14U14S7Ba-SMA(42 k u)ECa(125、100k u)Ac t in(43 k u)CDS7U7图2 Masson和COL I染色以及 Western blot检测UUO模型中的纤维化水平A：Ma sso n、COL I 染色检测胶原纤维 x400；B、C：West er n bl o t 检测（xSMA、ECa 表达水平；D K：Ma sso n、COL I 染色和 West er n bl o t 的统计学分析;与 S 组比较：*P 0.05,*P 0.01,*P 0.001研究T发现,QDP R在体外研究中有一定的 抗肾脏纤维化作用，可能与自噬密切相关。过表达 QDP R基因能减少在纤维化中有重要作用的TGF-P 1的表达，提示其在肾间质纤维化中发挥着重要 的作用。本课题开展了过表达QDP R对肾间质纤维 化影响的体内研究，UU0模型肾脏出现了纤维化,并且在UU0模型中发现QDP R含量降低，而与自噬 密切相Bec l in l的表达增高，提示QDP R和Bec l in l 可能在肾脏纤维化中有重要作用。为进一步研究 QDP R在肾间质纤维化中的作用和机制,本研究用 输尿管逆行注射的方法，制备过表达QDP R及其空 载对照UUO模型，探究过表达QDP R对肾间质纤维 化的影响及其可能机制。结果显示,C组与Q组中 慢病毒标签ZsGr een均有表达,提示模型制作成功。免疫组化染色和West er n bl o t检测显示QDP R在7 d 表达并未表达增加，而14 d表达明显升高，提示慢 病毒介导的基因表达需要超过1周才能充分表达。通过Ma sso n染色及检测抗纤维化相关因子ECa的 表达水平，发现过表达QDP R可降低胶原纤维并增 加ECa的表达，表明过表达QDP R可以抑制UUO模安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)809QDP RS7U7S14U14 _ W Im 1-,.-:|.inACQDP R(26 k u)Ac t in(43 k u)DE20 r1.5 rF黑B-m嘲 M d a o2010105 515151414 m mS7S74 47 7 u uo o图3免疫组化染色和Western blot检测QDPR在肾纤维化中的表达情况A：免疫组化染色检测QDP R表达情况X400；B.C：West er n bl o t检测QDP R表达水平;D G：免疫组化染色和West er n bl o t的统计学分析;与 S 组比较：*P 0.01,*P 0.001C7 Q7 C14QDP RD 25 r E 2.0ZsGr een(26 k u)QDP R(26 k u)Ac t in(43 k u)G 1.5F 60 r*C7C7KBM4nwHddo1414 clcl4 4 QIQIAC图4免疫组化染色和Western blot检测QDPR模型的制备情况A:免疫组化染色检测QDP R表达情况X400；B、C：West er n bl o t检测ZsGr een.QDP R表达水平;D G：免疫组化染色和West er n bl o t的统计学分析;与 C 组比较:*P 0.05 01,*P 0.001810安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)a-SMA(42 k u)QIQI1414clECa(125、100k u)Ac t in(43 k u)bvsh14141414 clcl14141414cl1414 QIQIc Ica图5 Masson.COL I染色和Western blot检测过表达QDPR的UUO模型中的纤维化水平A：Ma sso n、C0L I染色检测胶原纤维X400；B、C：Ma sso n、COL I染色结果的统计学分析；D：West er n bl o t检测a-SMA和ECa表达水平;E、F：West er n bl o t 的统计学分析;与 C14 组比较：*P 0.05,*P 0.01ABec l in l(54 k u)Ac t in(43 k u)S14U140 8 6 4 2 00 8 6 4 2 0l.a o a 0 E 启maEH*S14 U14CBec l in l(54 k u)Ac t in(43 k u)C14 014.5e.5o.5e.5ol.l.ol.l.oD D 虽00二-SPQH-SPQH*C14 014图6 Western blot检测Beclinl表达水平A:West er n bl o t检测UUO模型中Bec l in l表达水平;B:结果A的 统计学分析，与S14组比较P 0.05；C：West er n bl o t检测过表达 QDP R模型中Bec l in l表达水平;D：结果C的统计学分析，与C14组 比较:*P 0.001质纤维化的作用机制，本研究检测了 QDP R基因过 表达的UU0模型中Bec l in l的表达情况，发现过表 达QDP R后Bec l in l表达降低。众所周知,Bec l in l 是自噬发生的关键分子皿，在肾脏纤维化的进展 中扮演重要角色。据报道，在UU0肾间质纤维化 的发病过程中自噬增强，进而诱导肾小管萎缩和分 解,从而促进纤维化。本研究中也发现Bec l in l 蛋白在UU0模型中表达增高，与前人观测结果一 致。而过表达QDP R基因降低了 Bec l in l的表达，提 示QDP R基因可能通过调控Bec l in l的表达，进而改 善肾间质纤维化。综上所述,UU0模型中QDP R表达降低，Becl in l 表达增加，纤维化增强，而过表达QDP R可抑制 UU0诱导的肾间质纤维化，过表达QDP R能降低 Bec l in l表达，提示QDP R基因可能通过调控Bec l in l 的表达进而改善肾间质纤维化。型的肾间质纤维化。为了进一步研究QDP R抑制UU0诱导的肾间参考文献1 Li R,Gu o Y,Zh a n g Y,et a l.Sa l id r o sid e a mel io r a t es r en a l in t er st i安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)811t ia l f ibr o sis by in h ibit in g t h e TLR4/NF-kB a n d MAP K sig n a l in g pa t h w a y s J.In t J Mo l Sc i,2019,20(5)：1103.2 Cu i D,Liu S,Ta n g M,et a l.P h l o r et in a mel io r a t es h y pemr ic emia-in d u c ed c h r o n ic r en a l d y sf u n c t io n t h r o u g h in h ibit in g NLRP 3 in-Ha mma so me a n d u r ic a c id r ea bso r pt io n J.P h y t o med ic in e,2020,66：153111.3 Li Q,Min g Y,Jia H,et a l.P o r ic o ic a c id a su ppr esses TGF-pl-ind u c ed r en a l f ibr o sis a n d pr o l if er a t io n v ia t h e P DGF-C,Sma d 3 a n d MAP K pa t h w a y s J.Ex p Th er Med,2021,21(4)：289.4 Gu Y,Go n g Y,Zh a n g H,et a l.Reg u l a t io n o f t r a n sf o r min g g r o w t h f a c t o r bet a 1 g en e ex pr essio n by d ih y d r o pt er id in e r ed u c t a se in k idn ey 293T c el l s J Bio c h em Cel l Bio l,2013,91(3)：187-93.5 Si Q,Su n S,Gu Y.A278C mu t a t io n o f d ih y d r o pt er id in e r ed u c t a se d ec r ea ses a u t o ph a g y via mTOR sig n a l in g J.Ac t a Bio c h im Bio-ph y s Sin,2017,49(8)：706-12.6 Zh a n g Q,Gr u n ber g er J W,Kh u r a n a N,et a l.Bec l in-1-med ia t ed a ut o ph a g y su ppr esses sil ic a n a n o pa r t ic l e-in d u c ed t est ic u l a r t o x ic it y via t h e in h ibit io n o f c a spa se 8-med ia t ed c el l a po pt o sis in l ey d ig c el l s J,Cel l s,2022,11(12):1863 7 Ch u n g S,So n M,Ch a e Y,et a l.Fa br y d isea se ex a c er ba t es r en a l int er st it ia l f ibr o sis a f t er u n il a t er a l u r et er a l o bst r u c t io n via impa ir ed a u t o ph a g y a n d en h a n c ed a po pt o sis J.Kid n ey Res Cl in P r a c t,2021,40(2):208-19.8 张 波，汝 峰，陈 湘，等自噬通过抑制上皮间质转化减轻 梗阻性肾病肾纤维化J.中南大学学报(医学版),2021,46(6)：601-8.9 Gu i Z,Su o C,Wa n g Z,et a l.Impa ir ed ATG16L-d epen d en t a u t o pha g y pr o mo t es r en a l in t er st it ia l f ibr o sis in c h r o n ic r en a l g r a f t d y sf u n c t io n t h r o u g h in d u c in g En d MT by NF-kB sig n a l pa t h w a y J.Fr o n t Immu n o l,2021,12：650424.10 Men o n M B,Dh a mija S D.Bec l in 1 ph o sph o r y l a t io n-a t t h e c ent er o f a u t o ph a g y r eg u l a t io n J.Fr o n t Cel l Dev Bio l,2018,6：137.11 Ra y eg o-Ma t eo s S,Mo r g a d o-P a sc u a l J L,Ro d r ig u es-Diez R R,et a l.Co n n ec t iv e t issu e g r o w t h f a c t o r in d u c es r en a l f ibr o sis via epid er ma l g r o w t h f a c t o r r ec ept o r a c t iv a t io n J.J P a t h o l,2018,244(2):227-41.12 Wa n g J,Zh u H,Hu a n g L,et a l.Nr 2 sig n a l in g a t t en u a t es epit h el ia l-t o-mesen c h y ma l t r a n sit io n a n d r en a l in t er st it ia l f ibr o sis via P I3K/Ak t sig n a l in g pa t h w a y s J.Ex p Mo l P a t h o l,2019,111：104296.13 Sh i B,Ma M,Zh en g Y,et a l.mTOR a n d bec l in l:t w o k ey a u t o pha g y-r el a t ed mo l ec u l es a n d t h eir r o l es in my o c a r d ia l isc h emia/r eper-f u sio n in ju r y J.J CeD P h y sio l,2019,234(8)；12562-8.QDPR improves UUO-induced renal interstitial fibrosis in rats by regulating BeclinlGa o Ha iy a n g1,He Ha il a n2,Zh a n g Lig u o1,Ch en Xi1,Li Zh ig u o2(1 Dept of Urology,Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology,Tangshan 063210；2School of Public Health,North China University of Science and Technology,Tangshan 063210)Abstract Obje c t ive To in v est ig a t e t h e ef f ec t o f QDP R o n r en a l in t er st it ia l f ibr o sis a n d Bec l in l ex pr essio n o f u n il a t er a l u r et er a l o bst r u c t io n(UUO)r a t mo d el.Me t hods Th e UUO mo d el w a s c o n st r u c t ed by u n il a t er a l u r et er a l l ig a t io n.Th e f ibr o sis pr o g r essio n,QDP R a n d Bec l in l ex pr essio n o f UUO mo d el w er e ev a l u a t ed by Ma sso n,COL I st a in in g a n d West er n bl o t t ec h n iq u es.UUO mo d el w h ic h w a s o v er ex pr essio n QDP R a n d it s c o n t r o l w er e c o n st r u c t ed by r et r o g r a d e u r et er a l in f u sio n o f c o r r espo n d in g l en t iv ir u s.In f ec t io n ef f ic ien c y a n d QDP R ex pr essio n l ev el w er e f u rt h er ev a l u a t ed Th e QDP R o v er ex pr essio n o n f ibr o sis pr o g r essio n,a n d Bec l in l w a s f u r t h er a n a l y zed Re sult s Co mpa r ed w it h t h e sh a m o per a t io n g r o u p,t h e c o l l a g en f iber s l ev el in t h e UUO mo d el g r o u p sig n if ic a n t l y in c r ea sed(P 0.05),t h e QDP R ex pr essio n l ev el w a s sig n if ic a n t l y r ed u c ed(P 0.05),a n d t h e Bec l in l sig n if ic a n t l y in c r ea sed(P 0.05)Ret r o g r a d e in jec t io n o f l en t iv ir u s t h r o u g h t h e u r et er c o u l d su c c essf u l l y in f ec t t h e k id n ey a n d in c r ea se t h e ex pr essio n l ev el o f QDP R in t h e k id n ey Th e o v er ex pr essio n o f QDP R in k id n ey c o u l d sig n if ic a n t l y d ec r ea se c o l l a g en f iber s(P 0.05)a n d Bec l in l(P 0.05)ex pr essio n.Conc lusion Ov er ex pr essio n o f QDP R in h ibit s t h e ex pr essio n l ev el o f Bec l in l a n d pr o g r essio n o f f ibr o sis,su g g est in g t h a t o v er ex pr essio n o f QDP R ma y r el iev e r en a l in t er st it ia l f ibr o sis by in h ibit in g Bec l in l ex pr essio n.Key words q u in o n e d ih y d r o bio pt er in r ed u c t a se；Bec l in l；r en a l in t er st it ia l f ibr o sis