微生物实验五牛津杯琼脂孔洞法.doc

实验五 牛津杯（琼脂孔洞法）测定抗菌剂的抑菌效果
一、目的：观察抗菌剂抗菌的作用效果，熟练掌握牛津杯法（琼脂孔洞法）体外测定抗菌物质的抗菌活性。
二、原理： 抗菌物质从孔洞向琼脂培养基扩散渗透，通过对试验菌的抑杀作用而影响细菌生长繁殖，使菌落形成抑菌圈，依抑菌圈的大小确定抗菌物质抗菌能力的强弱。
三、材料
1. 菌种：金黄色葡萄球菌，用营养肉汤培养16~18 h得到的菌液。
2. 药品：氨苄青霉素，肉汤培养基。
3. 器材：生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、灭菌肉汤琼脂培养基、酒精灯、平皿、吸管、0.5 cm 纸片、镊子、记号笔、尺子等。
四、实验步骤
1.按照实验一（培养基的配制）的方法步骤配制好肉汤培养基，并在121℃，灭菌20 min后，放在60 ℃水浴锅中保温，注意温度恒定，不要让培养基凝固。
2. 将用于试验的防腐剂（抑菌物质）配制成2个所需的浓度（见表1）。
3.将已经培养好的菌制成一定浓度（106cfu/mL）的悬浮液，用移液管移取1 mL该菌悬液至灭过菌的（121℃，20分钟）培养皿中，倒入15 mL已灭菌的培养基（温度约45℃，用手摸瓶壁不感觉烫手即可），轻轻转动培养皿，使培养基与菌液混匀，静置凝成平板。
4.将凝固后的平板用灭菌后的打孔器在平板上打孔（4个孔洞），并挑出培养基。（或将已灭菌的牛津杯依次轻轻放置在平板上）
5.按照顺时针方向依次在每个孔洞（或牛津杯）中加入抑菌剂，以无菌水做空白对照，每种抑菌剂的浓度做三个平行样。
6.在37 ℃下培养24 h观察，用尺子测量抑菌圈的大小。
五、注意事项
1.应在无菌条件下操作，试验完毕后及时灭菌处理。
2.添加抑菌剂的时候注意滴到其他地方，以免影响观察。
六、实验结果
表 测定抗菌剂的抑菌效果
菌株
药物
浓度（µg/mL）
抑菌圈直径（mm）
抑菌圈平均数
判定结果
金黄色葡萄球菌
氨苄青霉素
10

10

10

30

30

30

思考题：如何判定防腐剂或抑菌物质的抑菌效果，说明其食品应用的指导意义。
附：1. 药敏试验判定标准
表 抗菌药物的抑菌效果判定标准
抑菌圈直径（mm）
敏感性
<9
耐药
9~11
低度敏感
12~17
中度敏感
>18
高度敏感