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第六章 生物工程中的下游加工（技术）6.1前言“下游加工（技术）” 对于从任何工业化生产中回收有用产品所需要的所有环节来说是一个有用的词语。对于生物工程特别重要，我们想要的最终形式的产物经常非常远的从最先在生物反映器中获得的状态除去。例如，一个典型的发酵过程是一个分散的固体（细胞、也许有营养培养基的某些组分等）与稀释水溶液的混合物；所想要的产物也许作为一种非常复杂的混合物的组分存在于细胞中，或者存在于稀释的培养基溶液中，或甚至两者中都有。任何情况下，这个产品的回收、浓缩和纯化都需要有用并有效的操作，这也受生产经济性的限制。任何特殊的规定，如需要除去污染物或限制生产微生物都只会增长困难。许多实验室中的标准操作在生产中都是不实用或者不经济的。并且，生物产品经常是非常脆弱（labile）敏感的化合物，其活性结构只能在限定并有限的pH、温度、离子强度等条件下才干保持。考虑到这些限制，假如要用到所有可用的科学方法以发挥最佳的效果就需要更多的发明性。也明显的是，没有一种独特的、抱负的、普遍合用的操作或者仅是操作顺序可以推荐；对一个特定的问题应当以最适宜的方式把单个单元操作结合起来。6.2 粒子的分离在发酵终点，多数情况下第一步是将固体（通常是细胞，但也可以是在一个特定支持物上的细胞或者酶，不涉及反映培养基固体组分）从几乎一直是水溶液的连续均匀的液体系统中分离出来。与这个分离相关的一些细胞特性列于表6.1；注意，细胞的比重不比发酵液大很多。细胞的大小也给细菌带来了困难，但是比较大的细胞更容易分离，有时候甚至只需要简朴的定位于倾析器。分离的容易性取决于发酵液的性质，它的pH、温度等等，在许多情况下，通过添加助滤剂、絮凝剂的等等进行改善（见后面）。表6.2给出了分离方法的大体分类。6.2.1 过滤 这个是从发酵液中分离丝状真菌和丝状细菌（例如，链霉菌）所使用的最广泛和最典型的方法。它也可以用于酵母絮凝物的分离。根据机理，过滤可以采用表面过滤或者深层过滤；或者离心过滤；所有情况下的驱动力都是压力，由超压产生或者由真空产生。过滤的速率，在一定期间内收集的滤液的体积，是过滤面积、液体的黏度和通过过滤基质的压力降以及沉积的滤饼的函数。过滤基质与滤饼的抗性是关键的，决定了它的可压性。对于不可压的滤饼，过滤速率与压力无关，但是多数生物材料是可压的，所以滤饼的抗性随着时间而增大而与过滤和滤饼形成过程中增大的总体抗性无关。错流过滤实现了过滤流的巨大的改善，在错流过滤中，固体不通过过滤器而通过跨膜的湍流保持悬浮状态。这可以通过安排悬浮物流经膜来实现或者通过在过滤器中固定移动的叶片或叶轮来实现。简朴的平板过滤广泛用于液体的澄清，也可以用于过滤少量的悬浮物，但是它们的载量是有限的；有时使用压力过滤器，特别对于分批操作。转鼓式真空过滤器大约是从发酵液中分离微生物最为广泛使用的装置；在这些过滤器中，过滤部分是一个旋转的鼓维持在减少的内压下。这个鼓转到液体中进行过滤，它的连续转动使滤饼层进行重要的后续操作，如图6.1所示。为了避免在过滤器表面形成生物体增长过滤的抗性，这种过滤器经常装有卸刀，像图中所描绘的；假如一个形成了粘性“菌丝毡”的菌丝体被破坏，它可以通过过滤器被分离出。常预先用助滤剂覆盖转鼓，有助于防止阻塞并且保持一个恒定的压力降。最重要的优点是以最小的升温、低的动力消耗及将过滤与洗涤和部分去水相结合而有效过滤；但是助滤剂被过滤掉的物质所污染是一个严重的缺陷。也可以使用在正压下操作的旋转过滤器。而带式过滤器是对原理明显的改善，非常适于需要大量洗涤的易过滤的沉淀物。带式过滤器可以与压缩机结合以促进脱水。6.2.2 离心细菌往往由于太小而不能由简朴的过滤基质进行分离，但通过离心进行分离也是困难的由于粒子与悬浮液之间密度的微小差异。经常采用离心分离蛋白质沉淀也有类似的困难。离心机的效果可以特性表达为：（方程式）在表达式中，Q=体积进料速率、d=粒子直径、=密度差、g=重力加速度、F=沉淀面积、=黏度、R=radius、=角速度及n=每分钟的转速。公式=FZ在比较不同的离心机的时候是有用的。由于F随着转子旋转长度的增长而增长，而Z随着转子的直径和速度增长而增长，通过采用长转子（F）或者快的、宽转子（Z）可以改善分离效果；可获得的Z值受到结构材料的限制。图6.2 列出了一些转子的安排方式，不同安排方式的关键特点总结在表6.3中。所有的设计都有单独的缺陷，添加上成本（涉及维护）、动力消耗及温度升高（除过结合冷冻）这些总体缺陷。6.2.3 絮凝和浮选既然细菌的微小细胞大小使从发酵液中对它们进行回收变得非常困难，甚至通过离心的方法，那么可以采用絮凝实现一种改善；粒子的沉淀速率随着粒子直径的增大而增大（斯托克斯定律）。絮凝可以是可逆的，假如细胞表面的电荷可以被相反电荷的离子中和，也可以是不可逆的，假如带电的多聚分子在细胞之间形成桥。因此絮凝剂就涉及无机盐、矿质胶体、聚合电解质。除了取决于絮凝剂的选择，絮凝作用还取决于这样的其他一些因素如细胞的性质（生理年龄）、离子环境、温度及表面剪切应力。假如没有形成一个足够紧密的絮凝物，那么可以采用浮选的方法，在这个过程中小的气泡吸取并进入到微生物中。这种分离取决于气泡的大小；气体可以鼓泡产生或者（更好的）非常精致的气泡可以由溶解的气体释放过多的压力来产生或者通过电解作用。不可溶的 “收集物质”如长链脂肪酸或者胺可以促使一个稳定的肥皂泡的形成，并且收集在肥皂泡层的粒子能被除去。在某些情况下，絮凝和浮选的联合使用非常有效地用于回收生物体。6.3 细胞破碎6.3.1 微生物由于细胞壁的强度和高的内在渗透压，破碎微生物经常是困难的；粒子太小而不能采用简朴的机械手段如碾碎而获得必要的强力。同时，细胞破碎不能破坏所需要的细胞组分，但通常所作的规定是矛盾的。分解微生物的方法总结于图6.3中。它们的作用效果通常以破碎的细胞的悬浮液中回收的细胞酶的活性水平来评估，与以破坏限度衡量破坏效率相结合。机械方法采用的是剪切力（在球磨机、胶磨机中搅碎）、压力和压力释放（匀浆机）及超声波。一种广泛使用的方法是采用高压紧接着忽然的解压，是由细胞悬浮液流经精细管口的结果。其中的一种解决方法如图6.4所示。这里，破碎是由流体剪切力和空穴现象导致的。超声波重要通过空穴现象而作用，但重要用于实验室，由于在大规模中，热量的除去是困难的。也可以采用加热、化学或者酶方法来破坏细胞。其中一种广泛使用的方法就是干燥，它引起细胞壁结构的变化并且经常可以用缓冲液或者盐溶液对细胞物质进行后续提取；一个著名的程序就是将细胞导入过量的冷丙酮中以制备“丙酮粉”。通过化学方法可以引起细胞裂解，如盐或者表面活性剂、或者渗透压冲击、或者采用合适的裂解酶，现在可运用的裂解酶的种类非常多并且可以与所要解决的微生物的具体性质相匹配。采用所有的方法并进行比较，细胞破碎后活性细胞酶的回收效果经酶解决和超声波解决为最佳；加热或者渗透方法次之，而机械法破碎通常效果最差。 6.3.2 植物和动物细胞来自动物组织或者植物的细胞通常不稳定且更容易通过机械方法破碎。假如物质一方面通过冷冻，就可采用外加剪切力的方法，而合适的酶就可以帮助从动物或者植物中进行提取。在技术上，人们非常关注通过合适的裂解酶（纤维素和半纤维素）解决来提高所有植物提取量而不是传统的提取方法。6.4 提取方法当用于生物产品时，提取同时具有分离和浓缩的作用。对于回收亲脂性物质尤为有用，不管这些物质最初是胞外的还是通过对细胞的合适解决而释放出来的。具有目的物的溶液或者甚至是悬浮液与不相溶的溶剂相混合，产物在这个溶剂中是更易溶解的并且更容易进行特异回收。物质在这两相中的分派由它的特性分派系数K控制：K=A相中物质的浓度/B相中物质的浓度然而，任何实际的提取过程的系数还取决于达平衡时两相的相对体积。由简朴的计算可知，当以一定体积的溶剂萃取某一物质时，假如将溶剂提成若干等分，分数次相继进行，则萃取的效率较高；而当欲差别地萃取某一种组分，而非其他组分时，则反萃取必能提高选择性。这样，液液萃取可以单步进行（假如分派系数是非常抱负的），通过多步顺流萃取或者逆流萃取（最复杂的解决过程但是可以很好的解决混合物）。在回收抗生素时，溶剂萃取是在除去细胞或者细胞碎片后的初期环节。全发酵液的萃取也可采用萃取倾析器，萃取柱或者用到离心机的混合澄清器。图6.5示例了一个从发酵液中回收抗生素的全发酵液提取过程。 全发酵液回收方法明显的减少了回收环节，因此应减少分阶段损失，即使萃取由于细胞的存在会被削弱而受损。减少了产物滞留于水溶液相中的时间，在水相中产物的降解是非常快的，这也是一个优点。从细胞或者细胞碎片中分离酶可以采用水溶液多相系统进行萃取。细胞碎片和酶分派在水溶液的聚乙二醇葡聚糖混合物中，其形成分离相且因此可以容易的分离开。这个方法避免了在离心过程中出现的一些困难（小粒子尺寸）而提高产量。6.5 浓缩方法生物加工过程中形成的低浓度产物通过初始分离环节而被浓缩，如在萃取过程（见上），但一般在经济纯化之前必须进一步浓缩。又由于许多产物的脆弱性，对它们浓缩的方法必须非常温和。一些适宜的方法涉及：萃取（已经考虑到了）、蒸发、膜解决过程、离子互换法、吸附法。6.5.1 蒸发蒸发常用于溶剂提取所得到的溶液，在这种情况下，小心的解决以回收蒸发的溶剂是必要的；由于蒸发产生高的特殊的热量，当用于水溶液制备物时，需要更为关键的解决。全发酵液的直接蒸发常用于制备相对低档的产物，通常采用某种喷雾干燥的方法。非常普遍的是，采用短滞留时间的蒸发器以减少由于热不稳定性而引起的损失。连续流动蒸发器可以对快速通过的物质中不稳定的产物进行浓缩；在降膜蒸发器中，热互换器更好，基于大的热互换表面，它使得在加热介质与溶液之间产生最小的温度差。滞留时间在一分钟内。在薄膜蒸发器中，薄层是通过机械方法形成的且非常湍流的；热互换器是非常有效的，并且这些蒸发器可以用于浓缩黏性液体，甚至浓缩至干燥的产品。在离心式薄膜蒸发器中，蒸发是在旋转转筒中的加热圆锥壁上进行的，滞留时间甚至更短。6.5.2 膜过滤膜过滤是一种多功能的程序，可以用于富集和分离不同的分子或者粒子。在流体静压下，假如采用的压力超过溶液的渗透压，那么粒子就可以通过某种适宜的膜，渗透压驱动浓溶液中的溶剂流向更稀的溶液。在超滤中，膜可以看作一个筛网（微孔膜）它的孔的大小控制着分离，但是这种简朴的模型不能用于反渗透，在反渗透过程中，相似大小的分子仍然是分离的。这依赖于分散及分子与膜材料之间的互相作用。图6.4给出了应用膜过滤过程的例子。为了获得高的流速，通常采用不对称膜，它具有由一种粗糙的海绵状结构机械支持的紧密的薄膜层。超滤过程中出现的最严重的问题之一是“浓差极化”现象。在膜高浓度的一面，溶液的浓度随着靠近膜而增长，而在膜的另一面为零。这导致形成“次级膜”作用，具有不同的通量和分离特性。与在错流过滤中同样，尽管不能完全用通过膜表面高的流速来消除这种作用，但是可以减少，采用高的泵速涉及湍流或者装配细渠道产生高速层流。典型的装置如图6.6和图6.7。微滤可以取代过滤以从发酵液中分离细胞或者甚至是特定的代谢产物；封闭的系统便于无菌操作，而在必要的时候也便于进行限制。6.5.3 离子互换和吸附树脂使用吸附剂从发酵液中回收产物是一种长期所采用大方法，最初基于活性炭的使用。这种方法通过单一的环节就会产生非常大的浓缩效应，并且由于可以采用大范围的较特异的吸附，所以被越来越多的采用。例如，在研究 新的抗生素回收方法中，探测经常是初始环节之一。离子互换树脂 离子互换树脂是带有紧密连接的可离子化基团的多聚物，离子基团根据选择可以是阳离子或者是阴离子，并且根据环境条件可以是离子形式或者为非离子形式。可采用的类型列于表6.5中；固体离子互换剂可以采用分派加入，然后通过倾析除去，或者采用柱程序使用。涉及这种离子互换柱的色谱分离将在下面的6.6.2部分中讨论。液体离子互换剂通过相似的原理进行操作，但是可离子化的物质之溶液非水溶剂载体中；然后通过液液萃取进行分离。不管是哪种情况，目的物质通过离子解离从离子互换剂上回收，然后对离子互换剂进行再生。在合适的情况下，抗生素可以从全发酵液中进行回收，在分批式发酵中相对于澄清发酵液而选择采用离子互换树脂。 吸附树脂 这些树脂提供了与不能混合的液体溶剂有相似特性的固体相，因此可以用于萃取过程。现在，有大范围这样的树脂可以使用，将它们重要的特性总结在表6.6中。该树脂是孔状的多聚物载体，其功能基团，假如是任易的一种，修饰载体的总体极性，不离子化。多数化合物处在非解离状态 通常从水溶液中被吸附；通过有机溶剂萃取或者改变溶液相的pH或离子强度而对它们进行回收。吸附树脂的孔隙度是重要的，由于孔隙度决定了可进行吸附的表面积，从而决定了树脂的吸附容量。6.6 混合物的纯化和分解在设计的合适的过程顺序中，产物的回收和浓缩已经伴有某些限度的纯化。然而，进一步纯化产物的需求通常存在，特别是当目的产品随着有重要的相似的副代谢物的时候，这些副代谢物经常可以通过初期的回收环节。因此，在纯化时将要面对的清况也许需要高度的分解或者也许不需要。两种常被使用的方法是结晶和各种色谱操作；结晶更容易进行放大，但是色谱方法有助于混合物更好的分解。6.6.1 结晶结晶重要用于纯化低分子量化合物，如抗生素。例如，常采用乙酸丁酯从发酵液中提取青霉素G，并通过添加乙醇溶液中的醋酸甲进行结晶。图6.8是采用相似的顺序分离和纯化放线菌素的过程。结晶开始于50下在乙酸乙酯中浓缩某一溶液，通过向溶液中添加石油醚直到溶液变得浑浊，；将溶液加热到65然后冷却。在一个更大的规模中，结晶是纯化柠檬酸和次谷氨酸盐这种产品的最后环节。6.6.2 色谱方法色谱方法用于低分子量的化合物（ 如同源抗生素），需要混合物分辨率，及巨大分子特别是酶，产物有着及其相似的性质。必要的设备是柱子，填充有载体材料，通常是粒子，储备和泵系统洗脱液，有选择的收集洗脱组分。根据具体的分离问题，柱子的比例可以变动，从相对高的窄的柱子到短的宽的柱子；一个例子是淀粉微球分段柱，这个柱子是由不锈钢构建的。为了获得最大解决量，采用大小均匀的微粒；柱的填充经常受到在分离的罐中混合吸附剂与溶剂系统的影响，假如需要在减少的压力下除气，然后以稠的糊状物传递到柱子中。某些物质特别是在分子筛层析中使用的那些物质，当用缓冲液与有机溶剂平衡或者用不同离子强度的缓冲液平衡（盐梯度洗脱）的时候，体积发生变化，然后必须固定到柱子中采用可调节的端板。柱子可以进行向上和向下流动操作，通常安装有泵输入的液体的流动计和一个输入压力控制装置。在柱子的两端安装无菌滤纸是所需要的，以消除细菌的污染和也许的产物破坏。通常情况下需要控制每一阶段从柱子上被洗脱下来的组分，如遵照洗脱液在254nm和280nm处的紫外吸取分别是核酸和蛋白质；缓冲液梯度通过衡量电导性来控制，或者在极端情况下，安装自动分析仪旁路途径来控制。为了分开已分离的产物需要某些形式的部分收集器，并且对于使用有机溶剂的大规模分离过程，这是必须安装在防爆房内的。不同的层析过程可以按下列区分为：吸附、离子互换、凝胶过滤、疏水、亲和、共价、分派这些层析的特性描述如下：吸附层析：分离产物依据的是它们对固体介质表面不同的吸附性，可以是无机载体如硅胶、氧化铝或者羟基磷灰石，也可以是有机多聚物。离子互换层析：使用的这类树脂已经讲述过了，或者使用不可溶或交联的多糖（纤维素，琼脂糖），离子功能基团吸附到上面。它对巨型分子的分解高；图6.9给出了分解复杂的蛋白质混合物的例子。这个所示的是生产规模的人血浆蛋白的分离，通过联合离子互换层析第4，6步与凝胶过滤第2，9步。凝胶过滤 运用 “分子筛”效应的，即一种中性的交联载体其有拟定的孔大小以进行分子的分离。大于最大孔的分子不能进入到介质内部而直接通过柱子；小一些的分子进入载体内部并被保存；这样分散到孔中是由于孔大小的作用，所以保存的分子就可以按照分子大小减小的顺序洗脱下来。与分子量范围从几百到百万或者更大相相应，就需要大范围的可控孔大小的载体；它们通常由线性多聚物产生（葡聚糖、琼脂糖），受交联度的控制。这些一般在溶液系统中使用，凝胶过滤液可以用于多肽或者蛋白质溶液的除盐。引入相对疏水基团的分子筛可以在有机溶剂中使用，以相同的方式分离亲脂性物质。疏水载体 具有不同疏水性的分子可以在具有疏水基团的载体上得到分离。因此，许多酶和其他蛋白质具有疏水区域，该区域积累中性氨基酸（如缬氨酸、苯丙氨酸），将与连接有不同长度酰基的载体发生不同限度的互相作用。亲和层析 运用更专一的互相作用进行分离；在固体支持物载体上连接上一种特定的结构，并且与欲分离的化合物发生特异的互相作用。分离原理如图6.10所示。特异性效应物如酶的克制剂（I）固定在不溶于水的载体上（C），载体被填充到一个柱子中。引入具有不同酶（E1、E2、E3、E4.）的复杂混合物的中性缓冲液，当E1被克制剂I复杂化，所有剩下的酶通过柱子。采用不同pH的缓冲液，现在，酶E1就可以选择性的从柱子上洗脱下来。可以分离的典型的特异性效应物与互补分子涉及：酶/酶的克制剂（或反之亦然）抗体/抗原或者半抗原（or vice versa）外源凝集素/糖蛋白或多糖核酸/互补碱基序列激素/受体维生素/载体蛋白等等这种类型的分离依赖于相同的高特异性互相作用，这种作用调控着生物过程。例如，脱氢酶根据它们与辅酶的特异性作用采用带有键合的NAD+的琼脂糖载体可以进行分离。可以运用抗原/抗体反映：例如通过带有固定的单克隆抗体的琼脂糖层析，人白细胞介素以高产量且高纯度形式得到回收。显而易见，这种固定的特异性效应物的成本是非常高的，应当多次循环使用。为了制备特异性固定物，载体如琼脂糖凝胶in head form要被活化，例如通过与溴化氢反映，然后当连接的是小分子的时候如辅酶，就可以直接进行连接，或者当要连接的是较大的效应物分子的时候通过“手臂”分子进行连接。基团特异性亲和层析 以相似的方式采用低特异性的“化学”互相作用；例如，带有二羟硼基的多聚物可以分离糖蛋白和核苷酸由于在硼酸和1,2diols之间可以形成可逆的复合物。共价层析 是一种微小的变化，运用固定的功能基团与欲纯化的物质之间形成可逆的共价键；特别是，硫醇化的多聚物可以用来分离具有SH-的蛋白质由于形成可逆的二硫化物。6.7 干燥生物产品的干燥在多数情况下作为最后的解决方法，通过干燥使产物形成稳定的形式以适于解决和储存；多数生物产品的热敏性意味着只能采用的方法是以最小的升温而除去水分。在某些情况下，产物如酶或者药物制品的热稳定性通过添加糖或者其它惰性的稳定剂而被提高。为了以蒸汽的形式除去水分，必须传递热量并且需要严格控制条件以保证温度的升高在可以忍受的范围内，温度的升高是由于热量输入的速率与潜在的 heat equivalent of蒸发速率间的平衡而导致的。热量的传递受传导、对流、或者辐射的影响或者这些作用的联合影响。表6.7示例了三种最重要的干燥方法和它们的操作条件。为了得到完整的信息，读者需要参考标准手册；这里，我们只概括的介绍一下最重要的技术。真空干燥 应用于分批式模式在间隔式干燥机中进行，或者连续模式象在旋转鼓式真空干燥机中进行。热量的传递重要通过与加热的表面接触而产生，并且当液体相浓度更高时应当考虑其特点的变化。喷雾干燥 提供了关于对流方法的最重要的例子，在这个方法中，热量的传递、产物的运动及蒸汽的去除均受到气流的影响。在连续操作中可以解决大的量。欲干燥的液体用作溶液或者浆且被nozzle 或者旋转的碟片雾化。热气流（150250）引起迅速的蒸发以至于粒子的温度仍处在很低的状态。喷雾干燥可以用于干燥酶和抗生素，并且当其他存在的物质是无害的时候，它可以用于干燥全发酵液，例如清洁剂级的detergent-grade 酶和饲料级的feed-grade抗生素。这种方法也广泛应用于食品工业。冷冻干燥 是最温和的干燥方法，由于水分从冷冻的物质而升华。为了水蒸气的升华，大约每kg水需要将680kcal热量传递到升华的表面，通过加热金属板的传导或者表面辐射：促进快速升华、维持非常低的压力并且通过低温浓缩要将蒸汽除去。通过控制干燥室中的压力来调节固体温度，测量被干燥物质的电导率为物质中存在的任何液态水的检测提供了一种非常灵敏的检测方法。许多药物产品是冷冻干燥的，如病毒、疫苗、血浆、激素及酶制品，尚有不稳定的并且高成本的诊断试剂；同时，在食品工业中，这种技术大规模的应用是重要的。