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种检测系统测定血清胆红素的差异性研究张鲍虎,张玲玲,郑耿镇,张莉,杨书才,周杰(南方医科大学坪山总医院 深圳市坪山区人民医院,广东 深圳 )D O I:/b j m y i s s n 收稿日期:;修回日期:基金项目:深圳市坪山区医疗健康集团(南方医科大学坪山总医院)年度院长基金资助科研项目(编号:)作者简介:张鲍虎,医学检验与生物科学双学士学位,副主任技师,擅长分析生化、免疫、分子等领域疑难问题.摘要:目的使用重氮法和钒酸盐氧化法共个检测系统测定血清中总胆红素(T B I L)和直接胆红素(D B I L)的含量,评估不同方法间及同一方法不同检测系统间T B I L和D B I L的检测结果,为判断临床检验科室不同检测系统之间的结果能否互认提供试验依据.方法以罗氏、贝克曼作为重氮法检测系统,日本和光、新产业作为钒酸盐氧化法检测系统,使用临床检验剩余样本进行检测.对检测值分析,计算不同系统间的相关系数r,建立P a s s i n g B a b l o k回归模型.使用B l a n d A l t m a n一致性分析及一致性相关系数(C C C)评估不同检测系统检测结果的一致性.计算各检测系统在D B I L和T B I L医学决定水平处的相对偏差,以/T E a为标准,评估试剂间的偏倚情况.结果共纳入 例样本进行研究.钒酸盐氧化法检测D B I L和T B I L的试剂间相关系数均大于 ,相比重氮法相关性更好,P a s s i n g B a b l o k回归分析提示钒酸盐氧化法试剂间的比例及系统偏倚更小.一致性分析表明钒酸盐氧化法试剂间比对一致性较好,C C C均大于.在不同医学决定水平处,钒酸盐氧化法试剂D B I L及T B I L检测结果均符合/T E a标准,而在m o l/L水平处,重氮法试剂D B I L的结果在/T E a标准的可接受范围之外.结论钒酸盐氧化法试剂间检测结果一致性较好,且T B I L试剂一致性优于D B I L.重氮法和钒酸盐氧化法不同检测原理试剂间测定结果的可比性较差.关键词:重氮法;钒酸盐氧化法;总胆红素;直接胆红素中图分类号:R 文献标识码:AAD i f f e r e n t i a lA n a l y s i so fF o u rD e t e c t i o nS y s t e m s f o rB i l i r u b i nD e t e c t i o nZHANGB a o h u,ZHANGL i ngl i ng,ZH E NGG e ngz h e n,ZHANGL i,YANGS h u c a i,ZHOUJ i e(P i ngs h a nG e n e r a lH o spi t a l o fS o u t h e r nM e d i c a lU n i v e r s i ty,S h e n z h e nP i ngs h a nD i s t r i c tP e opl esH o spi t a l,S h e n z h e n ,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v eAt o t a lo ff o u rd e t e c t i o nsys t e m sw e r eu s e dt od e t e r m i n et h ec o n t e n to ft o t a lb i l i r u b i n(T B I L)a n dd i r e c tb i l i r u b i n(D B I L)i ns e r u m byd i a z o m e t h o da n dv a n a d a t eo x i d a t i o nm e t h o d,a n dt h ed e t e c t i o nr e s u l t so fT B I L a n d D B I L b e t w e e nd i f f e r e n t m e t h o d sa n dd i f f e r e n td e t e c t i o nsys t e m so ft h es a m em e t h o dw e r ee v a l u a t e dt opr o v i d ee xpe r i m e n t a le v i d e n c e sf o ri n t e r a c c r e d i t a t i o na m o ngd i f f e r e n td e t e c t i o nsys t e m s i nc l i n i c a l l a b o r a t o r i e s M e t h o d sR o c h ea n dB e c k m a nw e r eu s e da sd i a z od e t e c t i o nsys t e m s,w h i l e W a k oa n dS n i b er e age n t sw e r es e r v e da sv a n a d a t eo x i d a t i o nsys t e m sa n dt h ec l i n i c a l r e s i d u a l s a mpl e sw e r eu s e df o r t h ed e t e c t i o n T h ed e t e c t i o nr e s u l t sw e r et h e na n a lyz e d T h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t,P a s s i ng B a b l o kr egr e s s i o n m o d e l,B l a n d A l t m a na n a lys i sa n dC o n s i s t e n cyC o r r e l a t i o nC o e f f i c i e n t(C C C)a n a lys i sw e r eu s e d t oe v a l u a t e t h e c o r r e l a t i o na n dc o n s i s t e n cyo fd i f f e r e n tm e t h o d s T h er e l a t i v ed e v i a t i o na tm e d i c a ld e c i s i o nl e v e l so fT B I La n dD B I Lw e r ea n a lyz e dt oe v a l u a t et h eb i a sa m o ngd i f f e r e n tr e age n t sw i t ht h equ a r t e r lyT E aa st h es t a n d a r d R e s u l t s s a mpl e sw e r ee n r o l l e di nt h i ss t u dy T h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t so fv a n a d a t e标记免疫分析与临床 年月第 卷第期o x i d a t i o nm e t h o df o rd e t e c t i ngD B I La n dT B I Lw e r em o r e t h a n ,w h i c hw e r eb e t t e r t h a nt h o s eo fd i a z om e t h o d P a s s i ng B a b l o kr egr e s s i o na n a lys i s s h o w e dt h a t t h epr opo r t i o n a la n dsys t e me r r o r so fv a n a d a t eo x i d a t i o n m e t h o d w e r es m a l l e r T h ec o n s i s t e n cya n a lys e ss h o w e da w e l l c o n s i s t e n cyb e t w e e nv a n a d a t eo x i d a t i o nr e age n t s,a n dt h eC C Cw a sm o r et h a n R e s u l t sa tm e d i c a ld e c i s i o nl e v e l sr e v e a l e dt h a t D B I L a n d T B I L r e age n t so fv a n a d a t eo x i d a t i o n m e t h o d m e tt h e/T E as t a n d a r d,w h i l eD B I Lr e age n t so fd i a z om e t h o dw e r eo u t s i d et h er a ngeo f/T E as t a n d a r da tm o l/L l e v e l C o n c l u s i o n D i f f e r e n t r e age n t s o f v a n a d a t e o x i d a t i o n m e t h o d h a v e ago o dc o mpa r a b i l i ty,a n dt h ec o mpa r a b i l i tyb e t w e e nd i f f e r e n td e t e c t i o npr i n c ipl e so fd i a z oa n dv a n a d a t eo x i d a t i o nm e t h o d s i spo o r K e yw o r d s:D i a z om e t h o d;V a n a d a t eo x i d a t i o nm e t h o d;T o t a lb i l i r u b i n;D i r e c tb i l i r u b i n胆红素主要来源于红细胞中的血红蛋白.红细胞衰老后,血红蛋白中的血红素经代谢后形成间接胆红素,间接胆红素在肝脏与葡萄糖醛酸结合后形成直接胆红素(d i r e c tb i l i r u b i n,D B I L).总胆红素(t o t a lb i l i r u b i n,T B I L)是血液中间接胆红素和直接胆红素的总和.胆红素的测定是评估机体肝胆功能的重要指标,常见的检测项目为T B I L和D B I L,可以反映患者黄疸程度及类型,辅助肝胆和血液疾病的诊断和治疗 .重氮法、钒酸盐氧化法和氧化酶法等多种方法可以用于检测血液中胆红素.目前临床上最常用的检测方法是重氮法和钒酸盐氧化法.依据中国合格评定国家认可委员会(C h i n aN a t i o n a lA c c r e d i t a t i o nS e r v i c e f o rC o n f o r m i t yA s s e s s m e n t,C NA S)发布的C NA S C L 医学实验室质量和能力认可准则 文件要求,临床实验室使用多种方法检测同一项目时,应对数据的可比性进行验证.所以本研究分别使用重氮法和钒酸盐氧化法进行检测,评估两种检测原理试剂间测定结果是否具有可比性.同时,基于现有研究多聚焦于不同方法间比较的现状,本研究分别纳入两种重氮法及钒酸盐氧化法试剂,用于比较同种 检 测 原 理 不 同 检 测 系 统 测 定 结 果 的 一 致性 .罗氏及贝克曼试剂是重氮法代表试剂,日本和光是最先使用钒酸盐氧化法测定胆红素的厂家,作为本研究钒酸盐氧化法的代表试剂,另一钒酸盐氧化法试剂选择国产新产业生物试剂作为代表,比较国产新产业生物试剂和日本和光试剂的可比性,为实验室胆红素检测应用及结果互认提供数据参考.材料和方法样本收集 年月至 年月深圳市坪山区人民医院临床检测后剩余的血清样本(本研究已通过深圳市坪山区人民医院伦理审查).样本纳入标准为:岁,不限性别.排除标准为:样本基本信息(性别、年龄)不完整;严重溶血、脂血或受到污染的样本;剩余样本量 m L;重复标本;检测值超出任一检测试剂声称线性范围的样本.共收集得到 份样本,样本年龄 岁,平均年龄为 岁,其中男性 例,女性 例.仪器及试剂本研究包含个检测系统:瑞士罗氏公司的T B I L和D B I L测定试剂盒(重氮法)、原装校准品、质控品及配套罗氏C o b a sc 全自动生化分析仪;美国贝克曼库尔特公司的T B I L和D B I L测定试剂盒(重氮法)、原装校准品、质控品及配套贝克曼A U 全自动生化分析仪;日本富士胶片和光纯药株式会社的T B I L和D B I L测定试剂盒(钒酸盐氧化法)、原装校准品、质控品、日本株式会社日立高新技术的全自动生化分析仪L A B O S P E C T A S;深圳新产业生物医学工程股份有限公司生产的T B I L和D B I L测定试剂盒(钒酸盐氧化法)、英国朗道公司质控品及校准品、日本株式会社日立高新技术的全自动生化分析仪L A B O S P E C T A S.检测方法仪器及试剂准备实验前对上述生化分析仪进行维护保养,对测试系统进行定标和质控,保证样本检测时室内质控在控,试验过程中各检测系统均使用同一批号试剂、校准品及质控品.样本准备研究对象要求在采血前天保持正常饮食且无饮酒、剧烈运动,空腹状态下分别用血清采集管采集静脉血,样本采集后注意避光存放,采集后 h内使用离心机及时分离(r/m i n离心L a b e l e dI mm u n o a s s a y s&C l i nM e d,M a r ,V o l ,N o m i n)血清.混匀血清,将每例样本分装为管,每管 L,分装后于 条件下保存.检测前取出样本在室温放置 m i n解冻,h内分别使用上述检测系统完成检测.离群值检查通过狄克逊(D i x o n)检验法初步剔除偏差极大的数据,即用极大(或极小)值与相邻值的绝对差异D除以数据全距R,若D/R比值/,视为极端离群值剔除,反之则保留.随后参考美国临床和实验室标准化协会(C l i n i c a la n dL a b o r a t o r yS t a n d a r d s I n s t i t u t e,C L S I)E P A 文件中推荐的广义极端学生化偏差方法进行离群值检查,剔除超出可接受限的样本.回归方程使用P a s s i n g B a b l o k回归模型进行拟合,X轴、Y轴代表不同试剂的检测结果.回归方程为YbXa,其中b为斜率、a为截距.b越接近,代表比例偏倚越小,a越接近于,代表系统偏倚越小.相关性检验使用P e a r s o n相关性检验得到不同试剂间检测结果的相关系数(r).r可以反映两试剂间的相关性,当相关系数r 时,认为两方法间相关性较好.r越接近,代表相关性越高.一致性分析对同一检测原理不同检测系统间测定结果进行B l a n d A l t m a n一致性分析,X轴为两试剂测定结果的均值,Y轴为两试剂检测结果差值,比较两种试剂检测结果的偏倚均值以及散点在 倍标准差线内分布的情况.进一步对同一检测原理的试剂间 进行一致性 相关系数(c o n c o r d a n c ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t,C C C)分析,评估两种试剂之间的一致性,C C C大于 时,代表两试剂间一致性极好,若C C C小于,表明两种试剂间一致性较差.医学决定水平处的偏倚评估医学决定水平(X c)的确定参考专业书籍 临床检验方法学评价及既往文献资料 .根据回归方程和医学决定水平,以C L I A(C l i n i c a lL a b o r a t o r yI m p r o v e m e n tAm e n d m e n t so f )规定的室间质量评价允许总误差的/(/T E a)作为标准,将Xc代入相应的回归方程,计算Y值、Y与X间的系统误差S E(S E|YXc|)及相对偏倚S E(S ES E/Xc ),对不同检测原理的结果进行偏倚评估,探讨同一检测原理不同检测系统测试结果的临床可接受性.统计学处理使用E x c e l 、G r a p h p a dp r i s m及M e d c a l c 软件整理分析.计量资料以均值标准差表示,计数资料以频数和百分比表示.两组比较采用t检验,多组比较采用方差分析.使用M e d c a l c 软件计算P e a r s o n相关系数、建立P a s s i n g B a b l o k回归模型、进行B l a n d A l t m a n一致性分析和一致性相关系数分析.当P 时,认为差异具有统计学意义.结果样本特征分析本研究共收集 例样本,经离群值检查后共剔除例超出可接受限的样本,最终保留 例样本用于后续分析.例样本年龄范围 岁,平均年龄为 岁,其中男性 例,女性 例,平均B M I为 k g/m.使用罗氏、贝克曼、和光及新产业系统检测后测定范围分别为:m o l/L、m o l/L、m o l/L、m o l/L,平均浓度分别为:m o l/L、m o l/L、m o l/L、m o l/L,经分析各检测系统检测结果间差异无统计学意义,基线信息对不同试剂结果无显著影响(P ).P a s s i n g B a b l o k回归分析使用P a s s i n g B a b l o k回归模型进行拟合,结果发现采用钒酸盐氧化法的两种试剂相比重氮法试剂散点分布紧凑,呈正线性相关(图、图).D B I L及T B I L的回归分析提示相同检测原理的试剂(图 a b、图 a b)比对的比例偏倚及系统偏倚均较小,其中重氮法两种D B I L试剂比例及系统偏倚分别为 和 ,T B I L分别为 及 ;钒酸盐氧化法两种D B I L试剂比例及系统偏倚分别为 及 ,T B I L分别为 和 .相比同一检测原理,不同检测原理间同一检测项目的比例偏倚均更大(斜率b与的偏差更大)(图 c f、图 c f).所以,对于T B I L和D B I L,钒酸盐氧化法不同检测系统间所测得结果均比重氮法的偏倚更小(斜率b更接近,截距a更接近),D B I L不同系统间的差异相比T B I L更大.标记免疫分析与临床 年月第 卷第期图不同试剂检测D B I L的回归分析图不同试剂检测T B I L的回归分析相关系数分析对个检测系统的测定结果进行P e a r s o n相关性分析,结果发现D B I L和T B I L两项目在同一检测原理下罗氏和贝克曼试剂(D B I L:r ,T B I L:r )、和光和新产业试剂(D B I L:r ,T B I L:r )的相关性均较好,但总体而言,重氮法对比r值均低于钒酸盐氧化法两种试剂检测结果的r值.不同检测原理间罗氏v s和光(D B I L:r 、T B I L:r )、贝克曼v s和光(D B I L:r 、T B I L:r )、罗氏v s新产业(D B I L:r 、T B I L:r )、贝克曼v s新产业(D B I L:r 、T B I L:r )相关系数分析发现D B I L项目r均小于 ,表明不同检测原理间试剂的相关性较差;以上结果表明,重氮法和钒酸盐氧化法应用于胆红素检测时,结果存在明显差异,且钒酸盐氧化法相比重氮法试剂间的相关性更好.一致性分析对相同检测原理的试剂进行B l a n d A l t m a n一致性分析,结果表明同一检测原理不同检测系统结L a b e l e dI mm u n o a s s a y s&C l i nM e d,M a r ,V o l ,N o 果比较的均值差值基本在 倍标准差范围内,提示同一检测原理下测定结果的一致性较好(图).此外,采用重氮法进行胆红素检测的罗氏和贝克曼试剂的偏倚均值绝对值(D B I L:,T B I L:)相比钒酸盐氧化法(D B I L:,T B I L:)更大,表明钒酸盐氧化法检测原理的试剂间一致性较好.通过一致性相关系数(C C C)进一步分析试剂间的一致性,结果发现重氮法试剂D B I L及T B I L检测结果的C C C分别为 和 .使用钒酸盐氧化法两种检测系统D B I L和T B I L的C C C均为 ,一致性极好.图相同检测原理试剂的B l a n d A l t m a n一致性分析给定医学决定水平处的偏倚评估参考 临床检验方法学评价 及刘怀平等 文献中的浓度设定确定本研究的医学决定水平,D B I L的医学决定水平(Xc)设定为 m o l/L和 m o l/L,T B I L设定为 m o l/L和 m o l/L.将医学决定水平分别代入相应的回归方程计算Y值、系统误差S E和相对偏差S E.结果如表所示,钒酸盐氧化法D I B L、T B I L及重氮法试剂T B I L的结果均符合/T E a标准,而重氮法试剂D B I L在m o l/L医学决定水平的S E超出/T E a标准.以上结果表明钒酸盐氧化法不同检测系统间结果互认可接受性更好,重氮法原理的不同试剂可比性较差.表D B I L和T B I L给定医学决定水平处的偏倚评估检测原理检测项目/T E a()Xc(m o l/L)Y(m o l/L)S ES E评价重氮法D B I LT B I L钒酸盐氧化法D B I LT B I L 不可接受 可接受 可接受 可接受 可接受 可接受 可接受 可接受标记免疫分析与临床 年月第 卷第期讨论既往研究发现使用重氮法试剂时,样本中存在V C对胆红素检测结果影响较大,而且在检测直接胆红素时不能避免样本中间接胆红素参与反应,可能引起检测结 果不准确 .针对以 上 问 题,日 本TOKUD A 在 年提出了钒酸盐氧化法测定胆红素的新方法.这一方法稳定性较好,具有较好的抗干扰能力,目前在市场上逐渐得到认可.随着科学技术的快速发展,一个实验室中通常配备有不同检测系统进行检测,验证检测结果是否具有可比性,对于质量管理、实验室标准化以及不同检测机构结果互认具有重要意义.基于目前现状,本研究纳入 例样本进行分析,每例样本分别使用罗氏、贝克曼、日本和光和新产业种检测系统进行检测.相关系数及回归分析表明重氮法试剂和钒酸盐氧化法试剂之间的可比性较差,而采用同一检测原理的试剂相关性较好.此外,两种应用钒酸盐氧化法的试剂一致性优于重氮法试剂,重氮法试剂D B I L的一致性相比T B I L试剂更差.中华人民共和国卫生行业标准 临床常用生化检验项目参考区间 第四部分:血清总胆红素、直接胆红素(W S/T )文件指出采用重氮法的罗氏和贝克曼D B I L的参考范围分别为 m o l/L和 m o l/L.罗氏及贝克曼D B I L试剂的说明书中表明该项目参考上限分别是m o l/L和 m o l/L,而钒酸盐氧化法试剂和光及新产业的参考上限均为m o l/L.可以发现同为重氮法的产品在同一项目参考区间的制定上存在不同,当实验室同时使用不同重氮法试剂检测时可能导致检测值的较大差异,最终影响临床结果解读.基于重氮法试剂以上问题,本研究对相同检测原理不同检测系统的结果进一步分析.一致性分析结果表明,使用钒酸盐氧化法的不同检测系统测定D B I L和T B I L的均值更接近,正负偏倚更小,一致性极好.在给定医学决定水平处的偏倚评估中,钒酸盐氧化法试剂的D B I L及T B I L在医学决定水平的偏倚情况均符合/T E a标准,而重氮法试剂D B I L在/T E a允许的误差范围之外,提示重氮法不同检测系统之间偏倚评估的临床可接受性相比较差.综上,本研究表明同一检测原理下,钒酸盐氧化法试剂之间可比性更好,有利于不同医院、检测机构之间的结果互认.此外既往多数研究表明重氮法和钒酸盐氧化法检测结果一致性较好,但本研究经相关性分析及回归分析发现这两种检测原理检测同一项目的结果存在明显差异,并且相比T B I L、D B I L项目的可比性更差.所以,检验科室或机构使用多种检测原理的试剂测定同一项目时,建议进行方法学比对评估试剂间可比性,必要时依不同检测系统制定相应的临床解读标准.参考文献尚红,王毓三,申子瑜全国临床检验操作规程M北京:人民卫生出版社,A D I NCA B i l i r u b i na sat h e r a p e u t i cm o l e c u l e:c h a l l e n g e sa n do p p o r t u n i t i e sJ A n t i o x i d a n t s(B a s e l),():殷悦,刘清林,杨琦,等全自动生化分析仪检测中黄疸指数的临床应用J标记免疫分析与临床,():胡婷婷,刘维薇医学实验室质量和能力认可准则(I S O :)专用要求概述J临床检验杂志,():陈铭,代芳芳,于艳华,等重氮法与钒酸盐法检测肝病患者胆红素情况的比较分析J标记免疫分析与临床,():杨华,王秀娟钒酸盐氧化法与重氮盐法胆红素测定结果的比较J中国医药指南,():李敏,孟祥兆,孙江漫,等基于C L S IE P A 的总胆红素方法学比对及偏移评估J标记 免疫分析与临 床,():徐建华,刘冬冬,黄宪章,等新指南C L S IE P A 在方法学比对及偏移评估中的应用J中华医学杂志,():杨 有 业临 床 检 验 方 法 学 评 价 M北 京:人 民 卫 生 出 版社,刘怀平,孙金芳,陈欣,等不同检测系统 项常规生化结果的比对与临床可接受性评价J中国实验诊断学,():邱谷溶血对重氮法血清胆红素测定的干扰分析J上海医学检验杂志,():T OKUD AKT AN I MO T OK A n e w m e t h o d o f m e a s u r i n gb i l i r u b i n i ns e r u mb yV a n a d i ca c i dJ J p nJC l i nC h e m,:罗助健血红蛋白对钒酸盐氧化法测定胆红素的干扰程度J医疗装备,():L a b e l e dI mm u n o a s s a y s&C l i nM e d,M a r ,V o l ,N o