草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟_郭小雷.pdf

，化学与生物工程 基金项目：福建省中科院 院省合作重大项目（）收稿日期：作者简介：郭小雷（），男，安徽阜阳人，博士，工程师，研究方向：蛋白质工程，：。：郭小雷草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟化学与生物工程，（）：，（）：，草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟郭小雷（福州科宏生物技术开发有限责任公司，福建 福州 ）摘要：以来源于草生欧文氏菌（）的酪氨酸酚裂解酶（）为目的基因，通过易错 定向进化技术构建突变体文库，利用高通量筛选方法获得了比酶活提高的突变体 和 ，再通过定点突变得到突变体 。经 摇 瓶 发 酵 培 养 发 现，突 变 体 比 野 生 型 的 比 酶 活 提 高 了 ；酶学性质研究结果表明，突变体 的最适温度仍为，最适 值从 升至，热稳定性、稳定性均得到明显提高；结构模拟结果表明，突变体 的三维结构无明显变化，突变位点附近氢键和表面电势有所变化。体外定向进化技术能有效提高 的催化效率，对酶法生产酪氨酸具有重要应用价值。关键词：易错 ；定向进化；草生欧文氏菌；酪氨酸酚裂解酶；酪氨酸中图分类号：（.，.，）：（），：；酪氨酸酚裂解酶（，）是一种磷酸吡哆醛（，）依赖型裂解酶。具有广泛的底物特异性，可以催化 酪氨酸发生，消除反应生成丙酮酸、苯酚和氨，该反应是郭小雷：草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟 年第期 可逆的；可以催化 酪氨酸和其它几种 氨基酸发生，消除反应；还可以催化酪氨酸、甲基半胱氨酸和一些相关氨基酸的取代反应；同时，对一些氨基酸包括丙氨酸具有消旋作用。目前，发现 多存在于肠杆菌属中，如大肠杆菌属、变形杆菌属和欧文氏菌属。随着研究的深入，近年来发现的 新的微生物来源及其应用越来越多，如气单胞菌（）、克雷伯氏菌（）、摩氏摩根氏菌（）、弗氏柠檬酸杆菌（）、中间柠檬酸杆 菌（）、草 生 欧 文 氏 菌（）和恶臭假单胞菌（）等。目前，制备 酪氨酸效率最高、成本最低的酶转化法主要以苯酚、游离铵、丙酮酸或 丝氨酸为底物，以 为辅酶，通过 催化得到。因此，筛选或改造获得催化活性高、热稳定性好的 在酶转化法制备酪氨酸的工业化应用中有着十分重要的意义。年，团队首次提出了酶定向进化的概念，即在目的基因中随机引入低频率突变，并定向选择所需性质的突变酶。定向进化技术包括定点突变、易错 和 重组等。定向进化技术不需要提前 知 道 酶 的 结 构、功 能 或 结 构 与 功 能 之 间 的 关系，为酶的改造提供了更为便捷的新途径。等 通过多次交替使用易错 、定点突变和 改组技术，使黑曲霉来源的植酸酶的活性和热稳定性都得到了大幅提升。在此，作者以来源于草生欧文氏菌的酪氨酸酚裂解酶（）为目的基因，通过易错 定向进化技术构建突变体文库，利用高通量筛选方法及定点突变构建突变体，为酶法生产 酪氨酸的工业化应用奠定基础。实验 材料与试剂大肠杆菌.（）、表达载体 （）；质粒 （），由基宇生物科技有限公司（常州）构建。限制性内切酶（、和 ）、聚合酶、连接酶，公司（大连）；柱式质粒 小量抽提试剂盒、异丙基硫代半乳糖苷（）、单硫酸卡那霉素，生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白质 标准品、聚丙烯酰胺凝胶电泳（）试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；磷酸吡哆醛（），浙江正硕生物科技有限公司；其它试剂均为进口试剂或国产分析纯。培养基种子培养基（，）：胰蛋白胨 ，酵母提取物，（固体培养基添加的琼脂粉）；用 氢氧化钠溶液调节 值至 ，高温灭菌 。发酵培养基（，）：胰蛋白胨，酵 母 提 取 物 ，甘 油，；用 氢氧化钠溶液调节 值至 ，高温灭菌 。易错 扩增 基因片段以质粒 （）为模板，扩增 基 因 片 段，设 计 上 游 引 物 ：（划线部分为限制性内切酶 的酶切位点）和下游引物 ：（划线部分为限制性内切酶 的酶切位点）。易错 扩增反应体系为：质粒 （）模板，上游引物 ，下游引物 ，聚合酶，加 补足。反应条件：预变性 ；变性，退火，延伸 ，个循环；延伸 。突变文库的构建将易错 扩增产物进行 琼脂糖凝胶电泳，选择目的条带进行切胶纯化回收，并以此为大引物，采 用 （）法对大引物全质粒进行 ，直接将突变后的 基因扩增至表达载体 （）上。反 应体系 为：质 粒 （）模板，易错 产物，高保 真 酶 ，加 补 足 。反应条件：预变性 ；变性，退火，延伸 ，个循环；延伸 。向 产物中加入限制性内切酶 ，酶切消化原始模板，产物转化至.（）感受态细胞中，涂布于 固体平板（），随机挑选单菌落进行菌落 ，验证转化子的阳性克隆概率。将不同反应条件下的易错 产物克隆至表达载体 （），并分别随机挑取 郭小雷：草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟 年第期 个突变子进行测序，利用软件 比对测序结果并计算突变率，以确定最合适的 和 浓度。利用在最优易错 条件下得到的所有转化子构建突变文库。突变文库的高通量筛选从构建含有 个转化子的突变文库中挑取单克隆至含有 无菌 培养基的 孔板中，每孔个单克隆，、振荡培养，加入诱变剂 至终浓度为 ，降温至 培养过夜，获得单克隆菌液，将 个 孔板命名为“母板”。每孔保留一半菌液冷藏，另一半离心弃上清，离心菌体于 冷冻过夜后用反应液重悬，反应体系 ，反应 ；离心 ，移取上清 至第块含有 水杨醛试剂、溶液的 孔板中，显色反应 后，加入 溶液终止反应，通过酶标仪测定每孔的 值。以 出 发 菌 株 转 化酪 氨 酸 情 况 为 对 照，值越高，表明丙酮酸剩余量越多，酪氨酸转化量越少，说明该突变子为负向突变；反之，为正向突变。再经过两轮复筛，分别筛选 值较低的 株、株相应“母板”上的单克隆菌液，每个单菌落做个平行，通过 发酵工艺对获得的正向突变株进行摇瓶发酵复筛，采用 法测定比酶活，确定比酶活提高后再进行测序，确定突变位点。酶活的测定反应体系中依次加入 水、氯化铵、丙酮酸钠、亚硫酸钠、和 苯酚，搅拌使其溶解，用氨水调节 值至，通氮气；称取 冷冻菌，加入 缓冲液（值、）重悬，加入 至终浓度为 ，移至上述反应体系中，反应 后加入 硫酸，保温 ，使 酪氨酸充分溶解；取样，用 值 的磷酸溶液稀释 倍，采用 法测定 酪氨酸含量。酶活定义：反应生成 酪氨酸所需的酶量定义为一个酶活单位。色谱条件：色谱柱（，），流动相为 甲醇，波长为 ，柱温为，流速为 ，二极管阵列检测器（）。结果与讨论 易错 条件的确定选择 梯度浓度（）为、进行易错 实验，考察 浓度对易错 产物的影响，结果如图所示。：，浓度（）：、图 浓度对易错 产物的影响 由图可知，浓度为 或 时，目的条带的扩增特异性较强，扩增产物显示明显条带。分别 固 定 浓 度 为 、，选 择 梯度浓度（）为、进行易错 实验，考察 浓度对易错 产物的影响，结果如图所示。：，浓度 ，浓度（）：、，浓度 ，浓度（）：、图 浓度对易错 产物的影响 由图可知，当 浓度为 时，扩增 产 物 条带较亮；当 浓 度 超 过 时，条带变暗。将不同 和 浓度条件下扩增产物克隆至表达载体 （），并分别随机挑选 个突变郭小雷：草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟 年第期 子进行测序以统计其突变率，结果见表。表不同 和 浓度下易错 的突变率 突变率 突变率 基因的长度为 ，共编码 个氨基酸。由于大多数突变都是有害的，多重突变常使蛋白质失活，因此，较低的突变率（每个基因有个或个氨基酸替换）是最合适的。由表可知，浓度为 、浓度为 时，易错 的突变率为 ，能满足实验要求。因此，选择 浓度为 、浓度为 进行易错 扩增。突变体的高通量筛选及序列分析与改进利用水杨醛显色法对突变文库进行高通量筛选，经过初筛和两轮复筛，从约 株突变体中筛选出了株正向突变株；通过 发酵工艺进行摇瓶发酵复筛验证，采用 法测定突变株的比酶活，结果显示，有株突变体的比酶活显著提高。测序发现，株突变体均发生了个氨基酸位点的突变，分别为第 位丝氨酸（）突变为半胱氨酸（）和 第 位 谷 氨 酸（）突 变 为 精 氨 酸（）；文献 报道 的突变有利于提高酶活，因 此，在 突 变 体 的 基 础 上 进 行 定 点 突 变 、，构建突变体 。经摇瓶发酵复筛测定比酶活，发现株突变体比野生型 的比酶活分别提高了 、和 （图）。图野生型 和突变体摇瓶发酵的比酶活对比 野生型 和突变体 的酶学性质分析 最适温度和最适 值将培 养 好 的 野 生 型 和 突 变 体 冷冻过夜后，分别在不同温度（、）和不同 值（、）下测定比酶活，结果如图所示。图温度（）及 值（）对野生型 和突变体 比酶活的影响 （）（）由图 可知，当温度为 时，野生型 和突变体 的比酶活均最高；当温度超过 后，突变体的酶活保留率明显高于野生型 。由图 可知，当 值为 时，野生型 的比酶活最高；当 值为 时，突变体 的比酶活最高，二者在不同 值下的酶活保留率变化不大。热稳定性将培 养 好 的 野 生 型 和 突 变 体 冷冻过夜后，分别置于 、郭小雷：草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟 年第期 、的 缓冲液（值，）中保温后，测定残余酶活，结果如图所示。图野生型 和突变体 的热稳定性 由图可 知，随 着 温 度 的 升 高，突 变 体 的稳定性明显优于野生型 ，说明突变体 的热稳定性明显改善。稳定性将培 养 好 的 野 生 型 和 突 变 体 冷冻过夜后，分别置于 值、的 缓冲液中，保温后，测定残余酶活，结果如图所示。图 野生型 和突变体 的 稳定性 由图可知，当 值 时，突变体 的稳定性较差；当 值 时，突变体 的稳定性明显优于野生型 。突变体 的三维结构模拟及突变位点分析以成团泛菌中 （：，与 同源率为 ）为模板，分别使用 和 通过同源建模和从头建模的方法对 和突变体 进行三维结构模拟，结果如图所示。图 的结构（）和突变体 的亚基结构（）模拟图 （）（）由图可知，结构（图）由个亚基组成，每个亚基中均含有 作为辅因子和。突变体 的单个亚基（图）根据结构域可以划分为个部分，分别是 端臂、大结构域、连接区和小结构域；其中，位于大结构域和小结构域形成的裂缝间，而则位于两个相邻亚基的界面之间。讨论易错 技术由 等 于 年首次提出，描述了一种简单的体外诱变方法，用于在给定的 片段中产生随机突变。常规方式是通过在易错 过程中改变模板、的浓度，提高碱基错配率而引入多点突变 。等 改进了易错 技术，发现使用较高浓度的 和 可降低聚合酶的保真度而不影响基因扩增，同时减小了 和 之间互换的概率。等 使用易错 技术快速简便地提高了有机磷水解酶的活性，在 和 条件下经过一轮易错 ，筛选出的种突变菌株比野生型菌株表现出更高的二嗪农降解能力。因此，本研究中考察了 和 浓度对易错 产物的影响，确定最佳 浓度为 、浓度为 。成功的酶定向进化需要一种高通量筛选方法，然而，将表型分析与兼容的高通量筛选方法相结合是开发酶工程高通量筛选方法中最具挑战性的部分。本研究建立了检测丙酮酸含量的水杨醛显色法，在检郭小雷：草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟 年第期 测波长 下绘制标准曲线，拟合得线性回归方程为.，丙酮酸浓度在 范围内线性关系良好，可作为 催化生产 酪氨酸体系的高通量筛选方法。等 将酶定向进化和高通量筛选方法结合，获得 突 变 株，用 于 催 化 生 产 左 旋 多 巴，其 中 氨基酸位点的改变能产生新的氢键，对提高酶活和热稳定性有重要作用。因此，本研究在突变体 的基础上经过定点突变最终得到比酶活比野生型 提 高 的 突 变 体 。不论是在水溶液中还是呈结晶形态，其三维结构都已证实为存在个分子量约为 的相同亚基四聚体，均有个可与 共价结合的催化位点。年，等 由三维结构确定了 与磷酸吡哆醛（胺）辅酶连接的具体位置：。另 有 研 究 发 现，活 性 位 点 残 基 、和 对酶活起重要作用，这些活性位点使 拥有更高的酶活，也为其结构优化和改造提供了理论依据。为了阐明突变位点的作用机制，本研 究 对 野 生 型 和 突 变 体 进行了同源建模。三维结构显示，个突变位点均不是位于活性中心的突变，而是位于单亚基的外侧，与相邻亚基的界面上，这可能跟蛋白的稳定性相关，如突变位点 中，残基可形成二硫键以提高稳定性，（）取代（）会缩短其与 和 之间的氢键长度；突变位点 中（）取代（）会与 和 形成个新的氢键，另外，可能形成的二硫键也具有稳定肽链空间结构的作用。且 和 均位于相邻亚基的界面上，相应氨基酸的变化造成局部带电状态的变化，有可能对 的结合有促进作用。而 位的（）取代（）后，直接影响了蛋白质表面电势，突变位点附近的表面电势发生了明显变化，可能会造成最适 值的增大和 稳定性的提高。结论以 为目的基因，通过易错 定向进化技术构建突变体文库，利用高通量筛选方法获得了比酶活提高的突变体 和 ，再通过定点突变获得热稳定性及 稳定性明显提高的突变体 。在今后的研究中，可从 的空间结构和催化机理分析出发，进一步结合理性设计 或半理性设计 等方法来提高酶活及底物耐受性。参考文献：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：曲戈，赵晶，郑平，等定向进化技术的最新进展生物工程学报，（）：，（）：陈勇，王淑珍，陈依军酶的理性设计药物生物技术，（）：，（）：，：，（）：（下转第 页）付晓，等：维药核桃青皮的生药学研究 年第期 张迅杰，赫军，柳芳，等青龙衣的化学成分和质量控制研究进展山东中医药大学学报，（）：江苏新医学院中药大词典（下册）上海：上海科学技术出版社，：张浩，张磊，龙红明电炉渣超微粉改性生物质废弃物制备生态活性炭的光谱学分析 光谱学与光谱分析，（）：，（）：李子文，李宗朋，买书魁，等 最小二乘支持向量机的核桃露饮品中脂肪成分的定量分析光谱学与光谱分析，（）：，（）：何勇，郑启帅，张初，等基于中红外光谱和化学计量学算法鉴别核桃产地及品种 光谱学与光谱分析，（）：，（）：周媛媛，刘雨新，孟颖，等青龙衣中的醌类成分研究中医药学报，（）：，（）：周媛媛，蒋艳秋，孟颖，等 青龙衣活性部位的化学成分研究中成药，（）：，（）：柴丽华，宋海龙，马晓玲，等 青龙衣化学成分的分离及其体外抗肿瘤活性的研究中草药，（）：，（）：李嗣乾，迟洪影，李艺，等超声波提取杏鲍菇三萜类化合物工艺的研究 食品研究与开发，（）：，（）：（上接第 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