阿托伐他汀钙对脂多糖诱导急...血红素加氧酶-1通路的影响_李姗.pdf

安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）阿托伐他汀钙对脂多糖诱导急性肺损伤小鼠核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1通路的影响李姗，王荣丽作者单位：西南医科大学附属医院呼吸与危重症医学科，四川 泸州646000通信作者：王荣丽，女，教授，硕士生导师，研究方向为呼吸系统疾病，Email：摘要：目的 探讨阿托伐他汀钙（AVT）对脂多糖（LPS）诱导急性肺损伤（ALI）小鼠核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1（Nrf2/HO-1）通路的影响。方法 2021年912月，采用随机数字表法把15只BALB/c雌性小鼠分为NS组（尾静脉注射生理盐水）、LPS组（尾静脉注射LPS诱导ALI模型）、LPS+AVT组（经AVT灌胃治疗的ALI模型），每组各5只。收集动脉血，测定血氧分压（PaO2）、氧合指数（PaO2/FiO2）；处死后取出双肺，HE染色观察肺组织，测定湿干重比（W/D），酶联免疫吸附（ELISA）法测肺泡灌洗液（BALF）中白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-（TNF-）含量，蛋白质印迹法（Western blotting）测肺组织中Nrf2、HO-1 的表达。结果 NS 组、LPS 组及 LPS+AVT 组 PaO2 （89.668.54）、（50.886.26）、（67.845.76）mmHg、PaO2/FiO2（426.9540.67）、（242.2929.79）、（323.0527.42）mmHg、W/D（3.120.54、4.950.60、3.850.46）、IL-1（37.956.18）、（115.0912.42）、（75.617.89）ng/L、TNF-（63.6620.71）、（330.9941.71）、（220.8728.89）ng/L、Nrf2（0.430.03、0.080.02、0.220.03）及HO-1（0.590.07、0.090.03、0.220.03）。与NS组相比，LPS组肺泡结构混乱不清，肺泡壁增厚，腔内炎性细胞大量渗出堆积，PaO2及PaO2/FiO2降低，W/D比值增加，BALF IL-1、TNF-含量增多，肺组织Nrf2、HO-1蛋白表达相对降低（均P0.05）。与LPS组相比，LPS+AVT组肺泡结构清晰度高，肺泡壁厚度及腔内炎性渗出改善，PaO2及PaO2/FiO2升高，W/D比值降低，BALF IL-1、TNF-含量减少，肺组织Nrf2、HO-1蛋白含量增多（均P0.05）。结论 AVT可减轻LPS诱导ALI小鼠的炎症反应，这可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。关键词：阿托伐他汀钙；急性肺损伤；核因子E2相关因子2；血红素加氧酶-1；肿瘤坏死因子-；白细胞介素-1Effect of atorvastatin calcium on Nrf2/HO-1 pathway in mice with lipopolysaccharide-induced acute lung injuryLI Shan,WANG RongliAuthor Affiliation:Department of Respiratory and Critical Care Medicine,Affiliated Hospital of Southwest University,Luzhou,Sichuan 646000,ChinaAbstract：Objective To investigate the effect of atorvastatin calcium(AVT)on nuclear factor E2-related factor 2/heme oxygenase-1(Nrf2/HO-1)pathway in mice with lipopolysaccharide(LPS)-induced acute lung injury(ALI).Methods From September to December 2021,fifteen female BALB/c mice were assigned randomly into NS group(injection with normal saline),LPS group(ALI model inducted by intra-tail injection with LPS)and LPS+AVT group(ALI model treated by intragastric administration with AVT),with 5 mice in each group.The arterial blood was taken for detecting the partial pressure of oxygen(PaO2)and the oxygenation index(PaO2/FiO2).The lung tissues were observed by HE staining and detected for wet/dry ratio(W/D).Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)was used to measure the expression of Interleukin-1(IL-1),Tumor necrosis factor-(TNF-)in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and western blot was used to proteins of Nrf2 and HO-1 in lung tissues.Results PaO2 in NS group,LPS group and LPS+AVT group was respectively(89.668.54),(50.886.26),(67.845.76)mmHg;PaO2/FiO2 was(426.9540.67),(242.2929.79),(323.0527.42)mmHg;W/D was(3.120.54,4.950.60,3.850.46);IL-1 was(37.956.18),(115.0912.42),(75.617.89)ng/L;TNF-was(63.6620.71),(330.9941.71),(220.8728.89)ng/L;Nrf2 was(0.430.03,0.080.02,0.220.03)and HO-1 was(0.590.07,0.090.03,0.22 0.03).Compared with NS group,alveolar structure in LPS group was distorted,alveolar septa was thickened,alveolar spaces were accumulated with inflammatory cells;the levels of PaO2,PaO2/FiO2,and proteins of Nrf2 and HO-1 in pulmonary tissue were decresed(P0.05),while W/D ratio,IL-1 and TNF-in BALF were increased(P0.05).Compared with the LPS group,structure distortion,alveolar septa thickening and inflammatory cells accumulation in LPS+AVT group were reduced;the levels of PaO2,PaO2/FiO2,and proteins of Nrf2 and HO-1 in lung tissues were increased(P0.05),while W/D ratio,IL-1 and TNF-in BALF were decreased(P0.05).Conclusion AVT can reduce the inflammatory response in LPS-induced ALI mice,which may be related to the activation of Nrf2/HO-1 pathway.Key words：Atorvastatin calcium;Acute lung injury;Nuclear factor-E2 related factor 2;Heme oxygenase-1;Tumor necrosis factor-;Interleukin-1药学研究引用本文：李姗，王荣丽.阿托伐他汀钙对脂多糖诱导急性肺损伤小鼠核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1通路的影响 J.安徽医药，2023，27（8）：1521-1525.DOI：10.3969/j.issn.1009-6469.2023.08.009.1521网络首发时间：2023-07-06 13:10:19网络首发地址：https:/ 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）急性肺损伤（ALI）是一种由机体创伤、烧伤、重症感染、休克、弥散性血管内凝血等因素触发并以逐渐进展的呼吸困难、难以逆转的氧合障碍、非心源性肺水肿为临床特征1的危急重症。急性呼吸窘迫综合征是ALI进展的严重阶段，发病率及死亡率高2，至今仍然缺乏特效治疗药物。阿托伐他汀钙（AVT）属于3羟基-3甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶选择性、竞争性抑制剂，除针对心血管系统调节血脂、抗动脉粥样硬化外，还可抑制炎症、调节氧化应激、调节免疫、改善内皮功能等3-6。已有文献7-8报道，受核因子E2相关因子2（Nrf2）调控的下游因子血红素加氧酶1（HO-1）表达增强能抑制炎症细胞如中性粒细胞、巨噬细胞等介导的炎症反应，但AVT是否也能通过该通路减轻脂多糖（LPS）诱导的 ALI小鼠炎症反应仍需进一步验证。研究时间2021年912月。1材料与方法1.1动物15只46周龄健康雌性BALB/c小鼠，购自湖北省实验动物研究中心，合格证号 SCXK（鄂）2020-0018，体质量范围为1922 g。1.2药品与试剂AVT（货号 A121956，规格 250 mg，纯度98%）；LPS（货号L118716，规格10 mg，纯度99%），均购自上海阿拉丁有限公司。小鼠肿瘤坏死因子-（TNF-）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（货号ELK1395，规格96T）、白细胞介素-1（IL-1）ELISA试剂盒（货号ELK1271，规格96T）均购自武汉科鹿生物科技有限公司；山羊抗兔二抗（货号AS1107，规格100 L）购自武汉阿斯本生物技术有限公司；Nrf2兔抗鼠抗体（货号16396-1-AP，规格150 L）购自武汉三鹰生物技术有限公司；HO-1兔抗鼠抗体（货号#43966，规格100 L）购自美国CST公司。1.3仪器ABL700全自动血气分析仪，购自瑞士罗氏公司；RM2016 病理切片机，购自上海徕卡公司；DR-200Bs酶标仪，购自Diatek公司。1.4小鼠分组及建立ALI模型15只BALB/c雌性小鼠采用随机数字表法分为 NS 组、LPS 组、LPS+AVT组，每组5只。LPS组、LPS+AVT组以尾静脉注射 LPS 4 mg/kg构建ALI动物模型，NS组则以相同方式注射等量生理盐水。小鼠出现精神萎靡、活动减少、呼吸急促、四肢及口唇发绀为模型建立成功。建模1 h 后，LPS+AVT组予以 AVT 10 mg/kg灌胃，其余组分别以等量生理盐水灌胃。建模后6 h以水合氯醛腹腔麻醉小鼠，采集腹主动脉血1 mL，并用颈椎脱臼法处死。1.5测定动脉氧分压（PaO2），计算氧合指数（PaO2/FiO2）比值取腹主动脉血 1 mL，使用全自动血气分析仪，检测PaO2并计算PaO2/FiO2 比值（呼吸空气情况下吸入氧浓度FiO2为21%）。1.6肺组织HE染色取出小鼠左肺组织，分别进行固定、脱水、包埋、切片、HE染色，光镜下观察小鼠肺组织病理形态学改变。1.7肺组织湿干重（W/D）比值取出右肺中叶，称重，测定湿质量（W）后置于 85 恒温烘干箱中 36 h，再称重测出干质量（D），计算W/D比值。1.8肺泡灌洗液TNF-、IL-1检测处死小鼠后钝性分离出气管，进行气管插管，以1 mL预冷生理盐水灌洗、回抽，重复 3次。将回收后的灌洗液混匀，在冰冻离心机 4 下，以 3 000 r/min 离心 10 min，取出上清液，据TNF-、IL-1 ELISA试剂盒说明书检测TNF-、IL-1含量。1.9小鼠肺组织Nrf2、HO-1蛋白检测取各组小鼠右肺下叶组织，用BAC法测定肺组织总蛋白浓度后，取40 g蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，PVDF膜恒流转膜后室温封闭，加入一抗Nrf2抗体（稀释比1 500）、HO-1抗体（稀释比1 2 000）、GAPDH单克隆抗体（稀释比1 10 000）过夜。回收一抗，TBST洗涤3次，然后室温下孵育二抗（稀释比1 10 000），TBST洗涤4次。均匀滴加现配的ECL混合溶液（显影液 定影液=1 1）到膜蛋白面侧，据光强度不同调整曝光条件。用AlphaEaseFC软件扫描胶片，以目标带与 GAPDH 带的光密度比值作为结果进行统计学分析。1.10统计学方法应用统计软件SPSS 17.0，计量资料以x s表示，多组间比较用单因素方差分析，其中两两比较行LSD-t检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1小鼠肺组织病理改变HE染色可呈现小鼠因肺组织损伤而形成的病理学改变。如图1，NS组小鼠肺泡结构清晰度、完整度高，肺泡壁均一，肺间隔薄，肺泡腔干净。LPS组小鼠肺泡结构混乱不清，肺泡壁不均匀，肺间隔变厚，肺泡腔及间隔里大量炎性细胞渗出堆积；LPS+AVT组小鼠肺泡结构较清晰完整，肺泡壁也较均一，肺间隔轻度增厚，炎性渗出浸润减少。2.2小鼠动脉血气分析由检测的小鼠PaO2水平了解肺部缺氧程度，并根据其数值计算PaO2/FiO2以评估其肺部呼吸功能急性损伤情况。如表1显示，LPS组小鼠的PaO2、PaO2/FiO2均显著低于NS组（P 0.05），而 LPS+AVT组小鼠 PaO2及 PaO2/FiO2均高于LPS组（P0.05）。2.3小鼠肺组织W/D比值检测小鼠肺组织W/D1522安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）比值以评估肺部血管渗漏和肺组织水肿程度。如表1显示，LPS组小鼠W/D比值高于NS组（P0.05），而LPS+AVT组小鼠W/D比值低于LPS组（P0.05）。2.4小鼠BALF中TNF-、IL-1水平采用ELISA法检测小鼠BAF IL-1、TNF-的含量，以反映小鼠肺部炎症水平。根据结果分析，LPS 组小鼠的TNF-、IL-1 水平均显著高于 NS 组（P0.05），而LPS+AVT组小鼠上述炎性因子水平均明显低于LPS组（P0.05）。见表2。2.5小鼠肺组织Nrf2、HO-1蛋白表达比较通过蛋白质印迹法测定小鼠肺组织Nrf2、HO-1蛋白的表达水平，以评估Nrf2/HO-1通路的激活或抑制状态。经结果分析，LPS组小鼠 Nrf2、HO-1表达水平均显著低于 NS 组（P0.05），而 LPS+AVT 组小鼠 Nrf2、HO-1表达水平高于LPS组（P0.05）。见表2，图2。3讨论AVT 对 HMG-CoA 还原酶起特异性抑制效应，通过阻碍 HMG-CoA 向甲羟戊酸转化实现调脂、抗动脉粥样硬化作用。研究9发现AVT能下调黏附分子表达，降低促炎细胞因子及补体末端产物水平，减少核转录因子-B p65磷酸化，抑制炎症细胞浸润和组织损伤。据黄兴汉10研究，脑缺血再灌注后的大鼠经AVT处理，其梗死灶周围中性粒细胞较对照组明显减少，表明AVT可抑制脏器炎症损伤中炎症细胞的浸润。为了验证AVT对ALI小鼠发挥积极的炎症保护作用并探索可能存在的新机制，我们开展了这个实验，以期为AVT在ALI的应用提供更多的理论依据。ALI早期肺泡基底膜受损，肺微血管通透性增加，蛋白质、液体在肺间质聚集引起水肿，并向肺泡内渗漏11，随后出现肺容积减少、顺应性下降、通气血流比例失调等众多病理生理改变，进而导致以PaO2下降为主的急性呼吸功能衰竭。本研究采用LPS呈现ALI模型，可见ALI小鼠因肺间隔和肺泡腔内大量炎性细胞渗出堆积导致肺泡结构混乱不清，肺组织含量水高。并且，ALI小鼠出现低氧血症的同时，其动脉血气分析的结果也符合ALI的诊断标准，即PaO2/FiO2300 mmHg12。上述结果均能说明此次LPS诱导的小鼠ALI模型是成功的。此外，研究结果还可见AVT的治疗可以减轻ALI小鼠肺泡结构破坏程度，减少炎性细胞渗出堆积，降低肺组织含水量，改善肺部呼吸功能受损。LPS诱导的ALI病情进展迅速，涉及炎症、氧化应激、离子通道改变、细胞凋亡等多个环节13-14。IL-1、TNF-均参与炎症的级联放大效应15。多形核白细胞作为主要的炎症细胞，通过上调其表面的细胞黏附分子CD11/CD18、P-选择素等，在肺内过度生理盐水脂多糖脂多糖+阿托伐他汀钙200400注：HE100图中方框所示区域对应HE400放大区域。图1各组小鼠肺组织结构（HE100和HE400）表1小鼠动脉血PaO2、PaO2/FiO2和肺组织W/D比值/x s组别NS 组LPS 组LPS+AVT 组F值P值鼠数555PaO2/mmHg89.668.5450.886.2667.845.7639.04 0.001PaO2/FiO2/mmHg426.9540.67242.2929.79323.0527.4239.05 0.001W/D3.120.544.950.603.850.4614.860.001注：PaO2为动脉氧分压，PaO2/FiO2为氧合指数，W/D为湿/干比值。与NS组比较，P0.05。与LPS组比较，P0.05。表2小鼠BALF IL-1、TNF-水平及肺组织Nrf2、HO-1蛋白表达比较/x s组别NS 组LPS 组LPS+AVT组F值P值鼠数555IL-1/（ng/L）37.956.18115.0912.4275.617.8987.63 0.001TNF-/（ng/L）63.6620.71330.9941.71220.8728.8990.17 0.001Nrf20.430.030.080.020.220.03262.58 0.001HO-10.590.070.090.030.220.03142.79 0.001注：BALF为肺泡灌洗液，TNF-为肿瘤坏死因子-，IL-1为白介素-1，Nrf2为核因子E2相关因子2，HO-1为血红素加氧酶1。与NS组比较，P0.05。与 LPS组比较，P0.05。623415注：1核因子 E2 相关因子 2（Nrf2）；2血红素加氧酶 1 （HO-1）；3甘油酸-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）；4NS组（尾静脉注射生理盐水）；5LPS 组（尾静脉注射 LPS 诱导 ALI 模型）；6LPS+AVT组（经AVT灌胃治疗的ALI模型）。图2各组小鼠肺组织中Nrf2、HO-1蛋白水平1523安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Aug，27（8）聚集、浸润、活化，释放许多具有生物损害作用的组织蛋白酶、TNF-等炎性物质。IL-1、TNF-同时也具备促炎能力，当肺内巨噬细胞受到炎性或损伤刺激时也可分泌这两种物质，以作用于多形核白细胞和其他炎症细胞，促使更多的炎性介质和细胞因子产生、扩散，正反馈循环得到启动，加重肺损伤16。我们的研究可见，LPS诱导后的两组小鼠肺泡灌洗液IL-1、TNF-含量均高，提示炎症反应得到启动；而LPS+AVT组的小鼠IL-1、TNF-水平降低，提示炎症反应有所抑制。因此，若能阻断炎症放大反应，也许能够延缓ALI病情进展。研究表明激活 Nrf2/HO-1 通路在氧化应激、炎症反应、组织损伤中具有积极作用17-19。Nrf2为帽领碱性亮氨酸拉链转录激活因子家族成员，由高度保守的结构域Neh17组成，受Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）负向调控，是调节细胞氧化应激反应的重要因子，参与抗炎、抗氧化、凋亡等过程。机体处于生理状态时，Nrf2经Neh2与Keap1结合在胞质中。在各种应激情况下，Keap1末端的半胱氨酸残基发生氧化还原反应被修饰，因此构象改变。从胞质中Keap1上脱离的Nrf2，经磷酸化和易位入核，在核内同 Maf蛋白和 Jun bZip转录因子形成异源二聚体，再以Neh4、Neh5与抗氧化反应元件精准结合。随后在环腺苷酸效应元件结合蛋白、转录激活因子等作用下，Nrf2介导的转录过程得以启动，正向调控下游靶基因，启动抗氧化酶、相解毒酶等活性调节7，17，20。HO-1，又称热休克蛋白32，是Nrf2调控的下游酶物质，普遍存在于哺乳动物体内血细胞代谢旺盛的骨髓、肝、脾等脏器中。在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、细胞色素P450的参与下7，HO-1将血红素降解为胆绿素、一氧化碳和亚铁离子，进而产生抗氧化、抗炎、抗凋亡等积极作用17，21。于是，我们作出假设，AVT对ALI小鼠的保护效应也可能与此条信号通路有关。为了验证这种假设，本研究以AVT作为干预药物，发现给予了AVT灌胃的ALI小鼠 Nrf2和 HO-1蛋白表达均上调，肺组织损伤和呼吸功能也有所改善，表明 AVT 可通过激活 Nrf2/HO-1通路发挥抗炎效应。文献18报道，从珍贵的传统中草药冬虫夏草中提取的嘌呤类生物碱冬虫夏草素能够诱导Nrf2从细胞质转位到细胞核并激活，以此上调ALI大鼠肺组织中HO-1的表达和酶活性，从而缓解肺组织损伤。据此，我们推测，本研究中AVT 对 Nrf2/HO-1 通路的激活作用也可能与促进Nrf2转位入核致Nrf2转录增加有关，但仍需进一步的实验研究证明。综上所述，AVT可减轻LPS诱导ALI小鼠的炎症反应，这可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。参考文献1 MATTHAY MA，ZEMANS RL，ZIMMERMAN GA，et al.Acute respiratory distress syndromeJ.Nat Rev Dis Primers，2019，5（1）：18.2 BELLANI G，LAFFEY 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该研究得到的知母化学成分数据库一共有81个分子，通过ADME模型筛选得到15个活性分子，通过分析化合物作用靶点网络发现知母活性分子作用20个T2DM靶点蛋白，富集分析发现知母活性分子通过调控胰岛素通路、胰岛素抵抗通路、PI3K-Akt信号、NOS3通路、HIF-1通路、能量代谢等途径治疗T2DM。结论 知母可通过多成分、多靶点、多途径的协同作用治疗T2DM。关键词：知母属；2型糖尿病；网络Meta分析；信号通路；网络药理学A network pharmacology technology study on the mechanism of anemarrhena in the treatment of type 2 diabetes mellitusZHAN Zhimin1,FU Wanjin2,HU Wei2Author Affiliations:1Department of Emergency,Hefei Xinqiao International Airport Co.,Ltd,Hefei,Anhui 230086,China;2Department of Clinical Phamacology,The Second Hospital of Anhui Medical University,Hefei,Anhui 230022,ChinaAbstract：Objective To investigate the mechanism of anemarrhena in the treatment of type 2 diabetes mellitus(T2DM)using network pharmacology technology.Methods Mining the chemical constituents of anemarrhena in the database of traditional Chinese medicines,and obtaining the pharmacokinetic parameters of the chemical constituents to construct the chemical constituents database of medicines;by used ADME model to screen potential active molecules;methods based on random forest and support vector machine to predict active molecules act on the target and construct the anemarrhena compound-target(C-T)network;retrieve T2DM-related targets from multiple human disease databases and construct a disease protein-protein interaction(PPI)network to construct the active molecule-disease target of anemarrhena network;Construction of anemarrhena activity-disease target(C-D)network;construction of anemar药学研究1525