本科毕业论文---生物传感器.doc

南 开 大 学本 科 生 毕 业 论 文（设 计）中文题目：LSPR生物传感器的研究系 别：电子科学与技术系专 业：电子科学与技术完成日期：2010年5月12日30LSPR生物传感器的研究摘 要目前，基于局域表面等离子体共振(LSPR)现象的传感研究是一个热点方向，这种方法在器件开发和相关应用上均有很大的潜力。LSPR传感器具有一些优于传统SPR传感器的特性，在物理、化学和生物方面的特性测量分析上应用方便，效果显著，有很高的开发潜力。这篇文章是一个综述性的文章，首先介绍了LSPR技术目前的发展状况，对LSPR技术的原理和特点进行了归纳，并总结了目前已经成型的几种LSPR传感部件和系统的制作方法和技术要素，以及在实验中的应用领域。同时，它对基于LSPR的传感器传感芯片的未来发展趋势和商业化前景也作出了讨论。关键词 局域表面等离子体共振(LSPR)；纳米粒子；生物传感器目 录摘 要01简介12LSPR定义23LSPR与SPR的区别44DDA算法65LSPR传感系统的基本构造75.1 基于光纤的生物传感系统75.2 基于反射的光纤(RFO)传感系统86LSPR传感器的构造97LSPR传感器制作工艺107.1 基于电光调制的LSPR生物传感器的制作107.2 在玻璃表面固定金纳米棒117.3 金纳米线表面结合自组装分子117.3.1 金纳米线阵列芯片的制作117.3.2 自组装分子层结合127.4 利用NSL技术制作Ag纳米微粒127.5 银纳米结构薄膜137.6 金纳米井芯片的制作138LSPR传感技术的工艺方法148.1 光学系统的材料和技术148.1.1 一种匹配生物传感器的光纤探针的制作148.1.2金纳米粒子修饰的光学纤维的制备148.2材料表面图案加工工艺158.2.1纳米刻蚀图案过程158.2.2 利用NSL拓展技术制作纳米孔阵168.2.3 利用CP技术在纳米粒子层表面形成图案179LSPR传感器的应用实例189.1 LSPR传感器应用于测量物理量189.1.1 金纳米线阵列表面结合自组装分子的LSPR光谱测量方法189.1.2 纳米粒子表面典型消光光谱的测量199.2 LSPR传感器在化学传感领域的应用209.2.1基于纳米Ag粒子的表面等离子体共振光谱测定CN- 的测定方法209.2.2利用LSPR传感器检测有机磷杀虫剂209.3 LSPR传感器在生物传感领域的应用219.3.1以氯金酸氧化还原反应为基础的蛋白质病人血清样本中的葡萄糖LSPR传感探测219.3.2使用基于LSPR的纳米芯片蛋白质的无标记监测219.3.3使用LSPR的重组细胞蛋白质表达分析2210LSPR传感器技术的商业化2311LSPR传感器的未来发展趋势2412总结25参考文献26致 谢31一、简介 近年来，纳米材料由于其独特的光学、电磁学和力学特性而得到了研究人员的广泛关注。贵金属纳米粒子显示了很强的紫外-可见光吸收带特性，绝大多数金属中都没有这种性质1-8。科学研究表明，贵金属纳米粒子悬浮液的这种特有性质取决于它们同光的强烈作用，而对纳米粒子光学领域的研究又使得对于材料的成分，尺寸，形状，以及局部绝缘环境和金属悬浮液的测色等等之间的关系有了更深层次的理解。对贵金属纳米粒子的光学性质的研究在理论和实践上都具有重要的意义。从理论上说，它对于系统研究纳米量级结构和引起光学性质变化的局部环境因素，以及预测结构的变化等起到了十分重要的作用。从实践上说，如果纳米结构的光学性质可调试，则它可以应用于表面增强光谱9-13，光学滤波器14,15，等离子体设备16-19和传感器等领域。 目前局域表面等离子体共振(LSPR)的形成以及它载体上的金和银纳米粒子的光学特性都具有很大的吸引力20,21。金和银纳米粒子在各种纳米光学的应用，如生物芯片22-25，以及纳米尺度26方面都得到了广泛的重视和研究。被测溶液和固定在衬底表面的粒子之间的反应能够引起的生物分子层厚度的变化，而基于LSPR的检测方法就能够对这种即时变化进行检测27,28。我们知道，纳米粒子，如金和银，在可见光区域有强吸收作用，这就是通常所说的LSPR吸收。这种LSPR现象发生时，入射光子频率同金属纳米粒子或金属岛传导电子的整体振动相匹配。纳米量级的粒子在紫外-可见光区域表现出独特的光学响应29,30，它们的吸光率随着光子能量的减少呈指数衰减（被称为Mie散射），在这个区域会出现LSPR带，对于粒子材料来说，它是叠加而成的。研究显示，表面等离子体能量和强度对粒子结构和周围环境媒介等很多因素敏感31-36。贵金属纳米粒子由于其独特的光学特性，即它们有在普通金属的光谱中不存在的强烈等离子体共振光谱吸收带37，同时，基于LSPR的设备还能够与简单光学系统同时建立，这也使得对贵金属纳米粒子基于LSPR派生的各种传感器的技术研究十分热门。 由于纳米材料与生物高分子、蛋白质、核酸等在尺寸大小上具有相同的量级，所以在生物医学领域，基于LSPR的各种传感器技术的研究和优化的工作也在进行之中。生物领域中的药物研究、生物传感、细胞标记、定点诊断、分子动力学研究以及载体治疗等方面的应用，都是以生物分子和纳米材料之间的相互作用为基础的。LSPR纳米传感器在检测生物分子方面应用很广泛22,38,39。生物传感技术被应用于大蛋白和抗体的检测。以通过NSL技术（纳米球光刻术）制得的银纳米粒子为例，当增加被吸附物层的密度和厚度时，会产生连续波长的红移。纳米粒子表面的分子的大小和密度决定波长的移动响应，表面结合的配体和溶液中的目标分子共同决定系统的检测能力。因为系统显示没有非特异性结合22，所以整个反应归因于分子间的配对选择。LSPR纳米传感器的性能优化可通过调整纳米粒子的大小和形状实现32,40。理论计算表明，纳米粒子角上的电磁场强度放大区域40以及整个可调传感区域，与环绕在纳米粒子周围的平均感生电磁场有关32。于是，随着进一步的研究成果，我们可以将纳米传感器应用于相关生物系统中来进行诊断操作，如老年痴呆症的诊断。基于LSPR技术的无标记光学生物传感器在继承了很多传统SPR传感器的优良特性的基础上，实时无标记监测分子动力学相互作用的能力也得到了进一步的发展。这种生物传感器容易制造，使用方便，只需要紫外-可见光分光计或者平板扫描仪辅助。值得注意的是，无标记光学生物传感器在基于阵列的形式下，能够方便并多元化实现高度检测生物分子之间的相互作用。二、LSPR定义 LSPR现象是仅限于金属纳米粒子（有时被当作金属簇）和金属纳米结构中的传导电子共振现象41-45。它发生在金属纳米结构中，如纳米粒子，纳米三角形46，纳米岛42等。当光子跟金属纳米粒子中的传导电子振动相匹配时，就会产生LSPR现象。用入射波长能够激发共振的电场激励LSPR，会产生强光散射，出现强表面等离子体吸收带，同时局部电磁场增强。纳米粒子在紫外光区域表现出唯一的光学响应30，吸光率随着光能的减少呈指数衰减（Mie理论），出现LSPR带。表面等离子吸收带的频率、最大吸收波长和强度高度取决于材料的化学成分（金，银，铂等贵金属），纳米粒子的尺寸，分布和纳米结构形状，以及它们周围的环境31,32,36,47。LSPR器件制作十分容易，它不需要特殊的系统结构，如衰减全反射（ATR）光学或波导耦合器件，它可以通过利用NSL等技术达到很高的小型化程度。这些性能使基于LSPR的传感器得到了高度的关注。当入射光子频率与金属纳米粒子中的自由电子的集体振动发生共振时，会产生LSPR现象。最简单的纳米粒子光学响应模型是Mie理论，它描述长波长段球形金属颗粒的消光量。具体形式如下37：其中，E()为消光量， 即吸收和散射光量的总和；NA是纳米粒子的局部密度；a是金属纳米球体的半径；m是金属纳米球体周围介质的介电常数（假设为正实数，且与波长不相关）；是入射光波长，i是金属纳米球体介电常数的虚部；r是金属纳米球体介电常数的实部。容易看出，当分母中的共振项(r+2m)2接近零时， 即达到了LSPR的共振条件。从这个最原始的模型中可以看出，掩埋于周围介电环境中的金属纳米球体颗粒的LSPR光谱特性取决于以下几个方面：纳米粒子的半径a、纳米粒子材料（i和r）以及纳米粒子周围介质的介电常数m。进一步研究表明，在实际情况中，即纳米粒子不是球体时，吸收光谱将取决于纳米粒子的直径、高度和形状。在这种情况下，分母中的共振项应写作其中是形状因子项11，用来描述纳米粒子形貌比例。5:1的纳米粒子形貌比率所对应的的值从2（对于球体来说）最大可增加至17。此外，很多样品为沉积在衬底表面的纳米粒子集合。因此，LSPR还取决于粒子间距和表面绝缘常数。LSPR消光导致波长的选择性吸收并伴有极大的摩尔消光系数，大概31011L/(Mcm)48，效率相当于106个荧光分子51产生的共振瑞利散射49,50，以及在纳米粒子表面增强的局部电磁场，这是在所有表面增强光谱中观测到强烈信号的原因，如表面增强拉曼散射(SERS)和表面增强荧光31,32。 由式(1)还可以看出，贵金属纳米粒子的最大消光位置高度取决于周围环境的电介质性质，并且纳米粒子最大消光波长的移动能够被用于检测纳米粒子周围由分子引起的变化。因此，至少有4种不同的基于纳米粒子的传感机理，它们均取决于LSPR消光变化或者LSPR max散射强度变化。这些机理分别是：(1)来自类似于荧光染料标记的纳米粒子标记中的共振瑞利散射39,50,51,52-57，(2)纳米粒子聚合58-63，(3)纳米粒子表面电荷转移的相互作用46,64-68，(4)局部折射率变化22,28,32,38,46,69-75。三、LSPR与SPR的区别多项研究表明，基于LSPR的纳米传感器的传导机理与平面传感器的传导机理一致，是SPR传感器的拓展和延续。在近20年来，SPR传感器，利用折射率的原理来探测接合在金属表面76上或其附近的分析物，并且被广泛的用于检测一系列的分析物的表面接合相互作用，包括小分子的吸收77, 79, 80，配体受体结合77, 81-83，蛋白质在自组装单层膜上面的吸收84-86，抗体抗原结合87，DNA和RNA杂交88-91以及蛋白质DNA的相互作用92。就SPR技术来说，它有三个明显的缺点：(1)SPR的共振角和共振波长的移动检测模式需要大量的光学阵列来实现87,93,94；(2)局限于一些平方微米量级的信号传感元的尺寸,特别典型的是10m10m 95；(3)实时性不强。比较SPR和LSPR传感器，它们非常明显的区别是折射率的灵敏度和特征电磁场的衰变波长。由于SPR传感器具有大折射率灵敏度(2106nm/RIU)79，所以，SPR响应经常通过单位折射率的变化来体现。LSPR纳米传感器，从另一方面上说，折射率灵敏度则逊色一些(2102nm/RIU)46。可以看出LSPR纳米传感器在这方面上比SPR传感器低了4个量级，表面上SPR传感器在灵敏度上要比LSPR传感器高10,000倍，但事实并不如此。就现阶段应用研究中所需要的灵敏度来说，两个传感器都可以很好的满足要求。特征电磁场的短的可调的衰变长度ld，可以使LSPR纳米传感器的灵敏度提高31, 32。LSPR纳米传感器的ld大概在5-15nm或者光波长的1-3%，并且取决于尺寸，形状，以及纳米粒子的成分；SPR传感器的衰变长度大约在200-300nm或是光的波长的15-25%的。由此可见，二者在这方面具有很大的区别79。SPR和LSPR的最小足纹也是不同的。在实际中，SPR传感器需要至少1010m2的区域进行传感实验。对于LSPR传感器，这个尺寸可以通过单一纳米粒子技术最小化为大量独立的传感元件（1010个纳米粒子在一个2mm2点位上，纳米球直径=400nm）或纳米粒子（直径约为20nm）57。这种纳米粒子方法能够达到和SPR传感器一样的效果，由此它的像素尺寸可以减小到100nm2以下。由于更低的折射率灵敏度，LSPR纳米传感器不需要温度控制，而SPR传感器（大折射率灵敏度）需要。另外，LSPR和SPR传感器之间最值得关注的区别就是造价。已经投入商业使用的SPR设备的造价在150,000到300,000美元之间，而处于实验阶段的便携式LSPR系统的造价则少于5,000美元。由于LSPR中的消光现象是由纳米粒子对光的吸收和散射造成的，因此LSPR的实现不需要表面等离子体共振(SPR)那样庞大的实验装置。LSPR技术可以制作出体积小、系统设置简单的生物传感器，较传统的SPR生物传感器有很大的差别。但是，这两种传感器之间存在着一个相同的关系。它们的全响应都能够通过如下等式来描述79： 这里max是波长移位响应，m是折射率灵敏度，n是折射率由吸收引起的折射率变化量，d是有效吸收层的厚度，ld是特征电磁场的衰变长度。值得注意的是，对于平面LSPR传感器，这个等式在数值上说明了传感器上吸附物的影响。当用于LSPR纳米传感器的时候，这个指数方程不仅近似于吸收物层的响应，还对它的响应在数值上作了详细的解释31,32。同SPR传感器类似，LSPR纳米传感器的灵敏度取决于距离，而距离取决于来自纳米粒子表面电场的平均诱发区域。为了清晰的说明，列表总结LSPR技术与SPR技术的比较如下（表1）：表1 LSPR传感器与SPR传感器的比较特性SPRLSPR无标记检测可以78,80,89,100可以22,38,46,57距离影响1000nm7930nm（尺寸可调）31,32折射率灵敏度2106nm/RIU77,79,81,972102nm/RIU31,46模式角位差94，波长差，成像消光22，散射39, 57，成像39, 57温控要求需要不需要化学识别SPR-RamanLSPR-SERS场移植不可以可以商业应用开始尚未造价$150,000-$300,000$5,000（多粒子），$50,000（单粒子）空间分辨率1010m95,1011个纳米粒子39, 57,96非特定约束最小（取决于表面化学成分和清洗）77,97,98,100,102最小（取决于表面化学成分和清洗）22实时测量时间范围=10-1-103s，平面扩散 77,80,98,99,103时间范围=10-1-103s，幅射扩散57多通道能力可以93,104可以并有研发潜力小分子灵敏性好77更好31微流体兼容性有有研发潜力四、DDA算法离散偶极近似算法(DDA)是近年发展起来的一种数值方法，原则上对任意形状及尺寸的纳米颗粒的吸收、散射及消光等光学特性进行计算。DDA算法与实验测得的紫外-可见吸收光谱的结合已成为认识纳米颗粒的结构特点及光学性质的重要手段之一，在计算光与金属纳米颗粒的相互作用方面具有较强的优势。为计算任意大小及形状的纳米颗粒的光学性质，DDA算法首先将该颗粒视为N个立方单元构成的集合体，再把每个立方单元视为电偶极子来处理105。任一个电偶极子与局域场的相互作用表示为（忽略频率因子eiwt）式中表示单个偶极子的极化率；由入射光场和其他偶极子在该处所形成的偶极场两者组成，即式中，E0为入射光电场的振幅，k为波矢，相互作用矩阵如下：在这个公式中有如下关系：将式(5)与(6)代入式(4)并整理可得到：再将此式写作矩阵形式：对于包含N个电偶极子的体系来说，P和E都是3N维矢量，A为3N3N的对称矩阵。解此3N复线性方程可求得极化矢量，从而消光系数(包括吸收与散射两部分)可由以下方程求得106： 以螺旋银纳米结构为例，通过DDA计算，我们可以发现这种结构可以很好的实现等离子体峰调制和电场分布排列。随着螺旋体半径的增加，主要的等离子体峰受到s偏振，右旋圆偏振，以及左旋圆偏振入射的影响而发生红移。即使不改变结构，通过把入射光从左旋圆偏振改变为右旋圆偏振，等离子体峰也能够实现可调。除此之外，最大电场的空间分布可以通过改变入射光的偏振方向来调节：对于位于主要的等离子体峰波长的s偏振光来说，最大电场分布在螺旋横截面附近，或者接近螺旋中轴线，这是由于强耦合作用形成的；而对于圆偏振光，根据入射方向，最大电场会位于螺旋的顶端或者底部。所以，对于传感和分析领域来说，通过使用不同的入射偏振，我们可以从空间上断定被分析物在螺旋中的位置。因此，我们可以获得空间分辨的被分析物信息。在实际中，它可以在亚微米量级内判定被分析物的空间分布情况。5LSPR传感系统的基本构造5.1 基于光纤的生物传感系统 如图1所示这个系统包括一个激光器(Hitachi HL6320G laser diode, 635 nm, 10mW; Thorlabs LDC500 laser diode controller; Thorlabs TEC2000 temperature controller; Thorlabs TCLDM9 laser mount)，一个斩波器(Stanford Research SR540)，一个光纤耦合器，一条传感光纤，一个样液池(10mL)，一个光接收器(Thorlabs PDA55)，一个锁相放大器(Stanford Research SR830)。将乙酰胆碱(ACh)溶液放入样液池中，并使LSPR传感器水平放置。在达到平衡后，在容器中放入特定量的对氧磷，60秒后会产生一个新的稳定响应，它们之间的反应可在2到4分钟内测量。图1 LSPR生物传感器系统的示意图5.2 基于反射的光纤(RFO)传感系统 RFO对于高压的构造如图2所示。这个系统由一个激光器(Hitachi HL6320G laser diode, 635nm, 10mW; Thorlabs LDC500 laser diode controller; Thorlabs TEC2000 temperature controller; Thorlabs TCLDM9 laser mount)，一个斩波器(Stanford Research SR540)，一个分光器，一个锁相放大器(Stanford Research SR830)，以及一个图片接收器(Thorlabs PDA55)组成。图2的放大部表示没有覆盖的光纤穿过一个1/16英寸的PEEKTM联合管套筒。PEEKTM联合接线至一个热控制的高压室中，接线管为1/4英尺长，0.065英尺厚的不绣钢高压管，在450 K下可以承受高达70MPa。高压室的温度通过循环水浴(Wisdom, model LC-06)保持误差在0.05K内。在高压室中使用镍镉-镍铝热电偶(Thermocoaxe Type K)测量待测液样温度，热电偶通过铂温度计(Guildline, model 9540)校准。温度测量的精确度在0.01K之内。压力测量使用仪器为精确度在0.05MPa内的50.4MPa的压力变换器(Sensotec, model AG-300)。高压源容器用来供给超临界二氧化碳(SCCO2)，高压液体泵(Shimadzu LC-8A)把被分析溶液压入高压室。每个测量至少重复5次。测量受体单位浓度时，归一化强度会发生变化，从而可以确定金纳米粒子修饰的LSPR光纤传感器的灵敏度。图2 高压条件下基于反射的光纤传感系统示意图6LSPR传感器的构造 目前出现的各种新型的，把生物识别反应转换成放大的光电信号的设备的基础是纳米金和银粒子所产生的局域表面等离子体共振光谱及其电学性质。T. Schalkhammer107曾详细地论证了1个金属镜面上能够结合聚合物隔离层、生物反应层和与生物识别相结合的纳米金属簇，借助于簇与镜面偶极分子之间的相互作用(连接或解离)，通过产生的共振增强光谱从而转换成清晰可检测的光学信号，如图3所示。图3 放大了的金属簇光学生物传感器组成 图4所示的是基于电光调制的LSPR生物传感器，左上图为该生物传感器的实物照片，右上图为该生物传感器的截面示意图。这种LSPR生物传感器的设备结构制作在x-剖面，y-方向的LiNbO3上，这种材料具有优异的电光效应。这种生物传感器由一对电极，钛扩散的波导，以及涂覆了人血清白蛋白(HSA)的金纳米粒子的传感区域组成。在共面电极上加电压可以使电场沿Z方向传播，这样就可以通过电光系数r13来调制折射率。图4 基于电光调制的LSPR生物传感器的设备结构7LSPR传感器制作工艺7.1 基于电光调制的LSPR生物传感器的制作1020 C下在衬底上扩散20nm厚的条形钛，整个过程持续6小时，就可形成波导。利用光刻和热蒸发技术制成300nm厚的带有电极的铝膜，电极间距分别为40，60和80m，对应波导宽度分别是20, 40和60m。为了防止电极由于液体分析物的增加而短路，在衬底的传感区域上沉积一个4nm长，300nm厚的SiO2开口层。向沸腾的HAuCl4溶液中加入柠檬酸钠即可制取金纳米粒子，粒子直径的平均值是22.64nm，标准差是2.32nm。为了在LiNbO3上固定金纳米粒子，使用羟基团和3氨丙基三甲氧基硅烷对衬底表面的末端分子进行化学修饰。金纳米粒子通过光刻和旋涂选择性沉积在表面上。把经过化学修饰的表面108浸泡在HSA的磷酸二氢钠溶液中，就可使HSA在纳米粒子表面自合成。完整的LSPR生物传感器如图4所示。被分析物为阻滞剂（心得舒），它可以按照1:9配置乙腈和去离子水溶液制取。7.2 在玻璃表面固定金纳米棒 80C下，用RBS洗涤剂清洗玻璃衬底，并使用超声波降解标本10分钟。在用水冲洗干净后，把载玻片放在1:1的甲醇/盐酸溶液中，超声波降解30分钟后，再一次用大量水冲洗，然后使用乙醇冲洗。接下来，将载玻片置于烤箱中在60C下进行烘干，烘干过程大概需要12小时。在冷却后，将载玻片放在10%的巯丙基三乙氧基硅烷(MPTES)的乙醇溶液中反应15分钟，使玻璃表面形成硫基硅烷自组装单层膜(SAM)结构。将这些经过处理的载玻片在乙醇中彻底清洗并再一次使用超声波降解（每一个载玻片持续5分钟）。最后，把载玻片放入烤箱，保持温度为120C，烘干过程持续3小时69,109,110。金纳米粒子棒固定在硫基硅烷SAM的玻璃表面上之前，要进行精密离心过滤过程，去除金纳米棒悬浮液中多余的溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)。悬浮液均匀分布在三个管中并在4500rpm下进行30分钟离心（Beckman模式J21-21离心机，配有JS-13.1旋转器），过滤掉一半悬浮物。将纳米棒悬浮液重新悬浮，同时将每个试管中的溶液稀释为30mL，再次离心，过滤所有悬浮物。接下来，将每个试管中的纳米棒悬浮液再次稀释至30mL并悬浮，再一次离心。在过滤悬浮物后，金纳米棒会互相组合，最终可以得到总体积为75mL的水悬浮液，将经过修饰的硫基硅烷玻璃载玻片置于此悬浮液中，约12小时后，即可完成金棒芯片的制备。7.3 金纳米线表面结合自组装分子7.3.1 金纳米线阵列芯片的制作 在硅基板上旋涂浓度为1.25%的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)溶液，膜厚约50nm，在150C下烘烤半小时，去除水气并使PMMA排列定型。使用原子力显微镜(AFM)(Smena-HV, NT-MDT, Russia)进行纳米压印，力学常数为40N/m，探针针尖直径约20nm (NSC15, MikroMasch, Russia)。这个过程主要是在铺有PMMA的硅基板上刻划出纳米凹槽后，用电子枪蒸镀系统。蒸镀时，要先蒸镀厚度约为1nm的钛层，再蒸镀厚度为20nm的金层。制作过程中还要辅助剥离与清洗过程。最后，可以得到线宽小于100nm金纳米线阵列，流程示意图如图5所示。图5 金纳米阵列制作流程示意图7.3.2 自组装分子层结合在室温下，把制作好的金纳米线阵列芯片浸入浓度为10-3M的十八烷硫醇(ODT)酒精溶液中，经过一段特定时间后取出芯片，立即用酒精清洗并用氮气枪吹干。最后，在空气中用加热板在100C下烘烤约10分钟，确保残留在芯片上的水分完全去除，进而可以得到表面结合了ODT分子的金纳米线阵列。7.4 利用NSL技术制作Ag纳米微粒 纳米球光刻术(NSL)是一种纳米加工制造技术。利用这种技术能够控制表面限定的纳米微粒的形状、尺寸和结构（见图6）。利用这种技术合成面宽约为100nm，高为500nm的Ag纳米三角形微粒，并采用LSPR光谱测量法测量微粒的光学特性。纳米微粒的消光波长极大值随吸附物质发生位移，导致靠近纳米微粒表面处的局部反射发生改变。为制备生物传感用LSPR纳米传感器，首先用自组装单层膜使Ag纳米三角形微粒具备吸附功能；其次利用零长度耦合试剂将生物素共价连接吸附到羧基上。 如图6所示，Ag纳米微粒的制作步骤如下：(1)清洁基片；(2)将单一溶剂聚苯乙烯纳米球滴落覆盖在基片上；(3)烘干六边紧密填充的纳米球单层膜，形成纳米球掩模；(4)Ag蒸发沉积在样品上；(5)在乙醇中进行超声波降解去除纳米球掩模；(6)制备出Ag纳米微粒样品。图6 银纳米微粒的NSL加工工序7.5 银纳米结构薄膜目前，出现了一种新颖的制作银纳米结构薄膜的方法，在制作过程中，反应溅射AgOx薄膜量较之以往减少了 110,111。这种方法具有如下优点：(1)可以在圆片级区域上制作均匀的银纳米结构薄膜；(2)不需要额外加热；(3) AgOx的还原所需时间短。这些优点使得这种方法不单适用于批量生产银纳米薄膜，而且适用于制作低成本的LSPR传感芯片。银纳米薄膜在LSPR生物传感器方面的应用具有很大的潜力，它可以用于检测生物素和链酶亲和素分子间的反应。通过反应离子刻蚀(RIE)还原AgOx薄膜可以制取银粒子的纳米结构薄膜111,112。在总压强为0.5Pa的氩氧混合气体（40%氩气，60%氧气）中对纯银靶(99.99%)进行反应射频磁控溅射，经过抛光的硅晶片上（尺寸为1010mm2）可沉积一层厚度为50nm的AgOx薄膜。然后AgOx通过两个RIE刻蚀过程被还原为Ag。第一个刻蚀过程在CF4(2sccm)，H2(30sccm)和O2(10 sccm)的混合气流中进行，整个过程持续1分30秒；第二个刻蚀过程在H2(30sccm)和O2(10sccm)的混合气流中进行，整个过程持续8分钟。第一个刻蚀过程让银纳米粒子成核，而第二个刻蚀过程是核的生长过程。7.6 金纳米井芯片的制作在金纳米岛芯片上旋涂（在500rpm下持续5秒钟，然后在1500rpm下持续30秒）SU-8100 (Microchem, USA)，涂层厚度为200m，然后在95C下前烘100分钟。在波长为365nm处进行紫外曝光（每次能量密度为630mJ/cm2），可以形成一个88的井(=800m)阵列图案。在曝光后，在95C下进行30分钟后烘，然后将其置于SU-8显影液中，进行3分钟弱超声处理，就可以去除井区域不交联的SU-8树脂并使部分井中的金纳米岛表面曝光。图7为金纳米岛井芯片的制作过程原理图。向金纳米岛芯片表面的井中放入0.2L不同含量GST-hIL6细胞裂解液，然后将井芯片在25C下放置在密闭的培养皿中，以防止样品溶液蒸发。然后将芯片用磷酸盐缓冲溶液(PBS)和去离子水彻底冲洗，并用氮气风干。图7 金纳米岛井芯片的制作过程原理图8LSPR传感技术的工艺方法8.1 光学系统的材料和技术8.1.1 一种匹配生物传感器的光纤探针的制作把多模态光纤(G50/125 3002, Fujikura Ltd., Japan) 新切割的端面放在N-s2-氨基乙基3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(SILAACE S320, Chisso Corp., Japan) (50mM)的乙醇溶液及5% 的乙酸溶液中，在室温下浸泡十分钟。用乙醇冲洗光纤，然后放在烤箱里，在120C下进行硅烷化。在此之后，把光纤浸泡在金纳米粒子的水溶液中。一段时间后金纳米粒子就被固定在光纤的端面上。由于金纳米粒子有超过80%的重现性，因此这个过程大概产生约20%的覆盖范围，这对于目前的用途来说是足够的。8.1.2金纳米粒子修饰的光学纤维的制备 多模态塑复合二氧化硅光学纤维(model F-MBC)（从Newport (Irvine, CA)购买）芯直径为400m，包层直径为430m。在样液池中以3:7混合过氧化氢(浓度30%)和浓硫酸，光纤裸露部分(2cm)在此混合液中清洗30分钟。清洗过后，将光纤裸露部分浸泡在1%MPTMS的甲苯溶液中。8个小时后，取出光纤并用甲醇清洗，去除表面的多余单体。在经过彻底清洗之后，把光纤裸露部分放入吸光率大概为1的金溶胶中。经过5小时后，在芯表面上可以形成自合成金纳米粒子单层。随后，经过修饰的光纤要依次用水，甲醇和三氯甲烷冲洗。8.2材料表面图案加工工艺8.2.1纳米刻蚀图案过程纳米刻蚀图案过程如图8所示。首先沉积一层金属铬薄层(2nm)增强金层同衬底的黏合。接下来，通过电子束蒸发技术在玻璃衬底上沉积厚度为40nm的金层，并在金薄膜上旋涂不同浓度的聚苯乙烯(PS)溶液（质量分数分别为1.5，0.8，0.5%，PS的分子量为45,730)。聚合薄膜在玻璃过渡温度Tg以上退火并且选用预先设定的混合PDMS模式刻蚀。刻蚀过程在真空中150C，1.60kPa低压下进行，持续30分钟到1小时。图8中，方案A适合高PS浓度，由于PS膜足够厚，所以可填充在PDMS和衬底之间的圆柱孔；方案B适合低PS浓度，质量分数在0.8%之下，由于PS膜很薄，所以对于缝隙只能部分填充。PS薄膜在毛细管力的作用下延PS壁上升并且在壁周围形成环形波动。PS图案经过CF4/O2的RIE处理后，可以去除衬底表面多余PS层。RIE过程改进了PS图案的形体尺寸。在冷却到室温后，用氩离子粉末掩模2分钟，使PS图案位于金阵列图案的后面。离子刻蚀的直流偏置是400V，同时要保持氩气压在510-4Torr以下。注意，带有波浪边缘的薄环形PS点最后制成的金环图案如图8B所示。最后，使用超声波在甲苯中降解衬底15分钟去除残余PS掩模。我们使用氨基烷链硫醇(AUT)的SAM对金岛表面进行修饰，如图8的C部分所示。为了保证经过AUT修饰的SAM在金岛上能够良好生长，我们先将样品放在AUT溶液中，经过24小时后，彻底冲洗并在纯氮气中吹干。然后使用含有10mM双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯(BS3)的PBS溶液活化金图案阵列。然后，把衬底放在质量分数为10%的端氨基聚酰胺-胺(PAMAM)G4树状大分子的甲醇溶液中，锚定的PAMAM会同活化生物素sulfo-NHS-LC-biotin共价结合形成胺基键。把经过生物素修饰的金点和环阵列放在20M的链霉亲和素(SA)溶液中曝光，从而诱发SA结合在经过生物素修饰的金表面上。用带有单色仪双光束系统的紫外-可见近红外光谱仪(JASCO: V-570)测量LSPR，扫描波长分布在300到2500nm区域内，光源是非偏振的卤钨灯(2002500nm)。在介质中，我们使用AFM (Seiko Instruments: SPA400)在接触模式下拍摄纳米阵列的图像。在图8中，A, B分别表示利用厚和薄的PS膜形成点和环图案。C表示利用端氨基PAMAM树状大分子的SAM作为中间耦合层在金图案上固定SA蛋白质的过程。在这个过程中，我们使用活化生物素Sulfo-NHS-LC-biotin交联SA蛋白质。图8 压印光刻和离子刻蚀制作金岛纳米图案示意图8.2.2 利用NSL拓展技术制作纳米孔阵首先要对衬底（熔融石英，25mm25mm1.5mm）进行化学处理使其表面具有亲水性。将衬底浸在硫酸/过氧化氢为3:1的溶液中，最少持续2小时。然后将衬底在超纯水中清洗，接下来将其置于超纯水溶液/氢氧化铵/30%过氧化氢为5:1:1的溶液中并使用超声波作用持续1小时。最后，衬底在超纯水中彻底清洗并且置于超纯水中保存，待使用时再从水中取出，60 C下在空气中被烘干。接下来，将新制备的超纯水滴落在衬底上并使其扩散，所需水量取决于胶体溶液的浓度和所用纳米球的直径。胶体纳米球溶液（直径390nm，4%的固体来自于Duke Scientific Corps）最初为团状，浮在水膜上，所以要对它进行扩散处理，使其浓度在衬底表面各处均匀分布。然后，把样品放入烤箱中，在60C下烘干，烘干过程持续1小时。由于水气蒸发，纳米球自合成为六边形紧密堆积的单层阵列，可以作为光刻掩模。最后，要在纳米阵列中热蒸发银。在二氯甲烷中使用超声波作用去除纳米球后，留下来的即为三角形银纳米粒子阵列。若要利用此技术制作更大的纳米粒子阵列和纳米孔阵，在蒸发银之前要使用氧等离子体对纳米球进行反应离子刻蚀。Haginoya等人首先使用了这个附加步骤，利用在经过刻蚀的纳米球阵列区域蒸发铂钯抗蚀剂，他们成功地制取到硅孔阵113。如果把刻蚀时间从50s增加到120s，纳米球的直径就会减少，这就导致样品的金属纳米粒子尺寸持续增加，最后合并成与纳米粒子阵列相同周期的孔阵。 概括说来，整个过程如图9所示，其各部分小图示意如下：(1)滴落移液管中的胶体溶液；(2)纳米球随着液体的蒸发而排序；(3)银蒸发在非酸蚀（左）和酸蚀（右）的纳米球阵列上；(4)纳米球被移除之前的俯视图；(5)在纳米球被去除后形成的离子阵列（左）和孔洞（阵列）。图9 制作过程示意图8.2.3 利用CP技术在纳米粒子层表面形成图案微接触印刷技术(CP)是一种多功能技术，它使得在微米和微米以下量级结构的表面图案的产生变得容易(Xia and Whitesides, 1998)。对于复杂的纳米粒子层结构，首先使用乙醇清洗金包层硅晶片和弹性聚二甲基硅氧烷(PDMS)图案，然后把它们用氮气流中吹干。接下来，在含有1mM十八硫醇(C18)的乙醇溶液中印刷图案。1分钟后，图案用氮气风干并且轻轻的压在晶片上。2分钟后，撤去图案，用乙醇冲洗衬底并在氮气流中烘干。把裸露的表面区域在新制备的10mM巯基乙酸盐(TG)的微孔水溶液中曝光。经过1小时后，表面用微孔水清洗干净并用氮气吹干。向粒子层表面滴落一层由350nm的PS粒子组成的粒子悬浮液。微孔水、EDC/PBS溶液（100mL的 PBS中，1-乙基-3-(3-(二甲基氨)丙基)碳化二亚胺(EDC)的质量是1.25-2.50mg）的体积比是2:1:4。持续1小时曝光之后，用微孔水轻轻冲洗衬底并在氮气流中风干。纳米粒子仅仅被TG覆盖的区域吸收。然后，采用与同性表面相同的处理方法对其金属化即可。注意，这个方法与Kaltenpoth等人于2003年提出的方法不同，因为这里的胶状纳米粒子是在吸收之前形成的。9LSPR传感器的应用实例