内质网应激诱导的自噬对新生大鼠坏死性小肠结肠炎的影响.pdf

论着J Med Res,February 2024,Vol.53 No.2内质网应激诱导的自噬对新生大鼠坏死性小肠结肠炎的影响王丽红杨晓丽有李静摘要目的探讨抑制内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）诱导的自噬对新生大鼠坏死性小肠结肠炎（necrotiz-ing enterocolitis,NEC）的影响。方法首先建立新生大鼠NEC 模型，然后从中分离提取出肠上皮细胞，分为对照组、抑制组、诱导组。对照组正常培养，抑制组加4-苯基丁酸,诱导组加衣霉素处理2 4h。采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA）检测各组细胞炎性细胞因子肿瘤坏死因子-（t u mo r n e c r o s i s f a c t o r-，T NF-）、肠脂酸结合蛋白（intestinal fattyacid binding protein,I-FABP）的表达水平；实时荧光定量聚合酶链反应（real-timequantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测各组细胞ERS标志物葡萄糖调节蛋白7 8（glucose regulated protein78,GRP78）、氧调节蛋白150（oxygen-regulated pro-tein150,ORP150）的mRNA表达水平；Westernblot法检测各组细胞自噬相关蛋白LC3I/I、p 6 2 的表达水平。结果与对照组比较,抑制组p62表达明显增高，TNF-、I-FA BP、C RP7 8、O RP150、LC 3I/I 表达显著降低，而诱导组p62表达明显降低，TNF-、I-FA BP、C RP7 8、O RP150、LC 3I/I 表达显著增高,差异均有统计学意义（P0.05）。结论抑制ERS诱导的自噬激活可减轻NEC新生大鼠肠黏膜损伤和炎性反应，改善肠道屏障功能。关键词内质网应激自噬坏死性小肠结肠炎肠上皮细胞作用机制中图分类号R722Effect of Endoplasmic Reticulum Stress-induced Autophagy on Necrotizing Enterocolitis in Neonatal Rats.WANG Lihong,YANG Xiaoli,LI Jing.Shanxi Peoples Hospital,Shanxi 030000,ChinaAbstract Objective To investigate the effect of inhibiting autophagy induced by endoplasmic reticulum stress(ERS)on necrotiz-ing enterocolitis(NEC)in neonatal rats.Methods First,the NEC model of neonatal rats was established.Then,the intestinal epitheli-al cells were isolated and divided into three groups:control group,inhibition group and induction group.The control group was culturednormally,the inhibition group was added with 4-phenylbutyric acid,and the induction group was added with tunicamycin for 24hours.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was used to detect the expression of the cellular inflammatory cytokines tumor necrosisfactor-(TNF-)and intestinal fatty acid binding protein(I-FABP)in each group.Real-time quantitative polymerase chain reac-tion(RT-qPCR)was used to detect the mRNA expression level of the markers of ERS glucose regulated protein 78(GRP78)and oxy-gen-regulated protein 150(ORP150).Western blot was used to detect the expression of autophagy related proteins LC3 I/I and p62.Results Compared with the control group,the expression of p62 in the inhibition group increased significantly,the expression of TNF-,I-FABP,GRP78,ORP150,LC3 II/I in the inhibition group was significantly decreased,while the expression of p62 in the induc-tion group was significantly decreased,the expressions of TNF-,I-FABP,GRP78,ORP150,LC3 I/I were significantly increased,and the dfferences were statistically significant(P0.05).Conclusion Inhibition of ERS induced autophagy activation can alleviateintestinal mucosal injury and inflammatory response in neonatal rats with NEC and improve intestinal barrier function.Key words Endoplasmic reticulum stress;Autophagy;Necrotizing enterocolitis;Intestinal epithelial cells;Mechanism of action新生儿坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocoli-tis，NEC)是一种严重的急性肠道炎症性疾病。据报道，其发生率为3%15%11。其中高达50%的患儿基金项目：山西省卫生健康委员会科研课题（2 0 2 0 0 2 4作者单位：0 30 0 0 0 太原，山西医科大学儿科医学系（王丽红）；036200太原，山西省人民医院儿科（杨晓丽、李静）通信作者：杨晓丽，电子信箱：:106 文献标识码AD0I10.11969/j.issn.1673-548X.2024.02.021需进行手术治疗,且术后发生严重并发症（如脑瘫和认知障碍)的可能性很大2.3。研究发现,该病病死率为18.5%2 8.8%，而且在过去几十年里并没有明显变化4。此外,NEC患儿住院时间更长，治疗费用更高5。因此,探索NEC的发病机制及治疗方法已成为临床研究的重点。NEC有复杂的、多因素的病理生理学,潜在的作用机制尚不明确。Qiao等6 研究显示,内质网应激医学研究杂志2 0 2 4年2 月第53卷第2 期论着（e n d o p la s m ic r e t ic u lu m s t r e s s,ERS）可诱发肠道炎症，导致肠黏膜屏障破坏,进而诱发多种疾病。大量研究表明,ERS与克罗恩病和溃疡性结肠炎等炎症性肠病及结肠癌的发病机制有关7.8 。Lau等9 研究表明，ERS也可能与急性肠道损伤的发病机制有关。Zhu等10 报道,与肠道炎症密切相关的内质网是NEC发病机制的关键参与者,抑制ERS可改善 NEC大鼠肠道损伤。研究表明，自噬激活发生在NEC肠道组织中，抑制自噬可以对NEC起保护作用1.12 。王国琴等13 研究显示,ERS 和自噬两者之间存在着重要的联系。ERS介导的自噬机制非常复杂，但目前国内外对ERS诱导的自噬和NEC关系研究甚少。本课题组在前期实验中已成功建立新生大鼠NEC模型14。在此基础上,本课题拟从体外细胞实验开展进一步研究：建立新生大鼠NEC模型,分离提取出肠上皮细胞，检测炎性细胞因子、ERS标志物和自噬相关蛋白等的表达，探究抑制ERS诱导的自噬是否对NEC有保护作用，阐明其对NEC作用机制的影响，旨在为NEC的治疗提供实验参考。材料与方法1.实验动物与主要试剂：健康新生清洁级Spra-gueD a w le y（SD）大鼠10 只，雌雄不限，体质量510g，由山西省人民医院动物实验室（实验动物许可证号：SCXK晋2 0 190 0 0 1）提供，按无特定病原体（s p e c ific p a t h o g e n fr e e，SPF）级要求饲养。脂多糖（lip o p o ly s a c c h a r id e,LPS,血清型0 55B55）购自北京Sloarbio公司；衣霉素（tunicamycin，T m，ERS诱导剂）、4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid,4PBA，ERS抑制剂）均购自上海Macklin公司;LC3酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒、p62ELISA试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain re-action,RT-qPCR）试剂盒均购自日本TaKaRa公司；BCA蛋白含量检测试剂盒、LC3及p62抗体、羊抗免IgG-HRP均购自江苏凯基生物技术股份有限公司；引物由通用生物（安徽）股份有限公司合成。代乳品配制：雅培婴儿配方奶粉5g，脂肪乳50 ml,蛋白粉8 g，加灭菌水至10 0 ml。2.NEC动物模型的建立：所有动物实验方案均经山西省人民医院动物保护委员会批准伦理学审批号：（2 0 19）省医伦审字第10 5号。通过人工喂养+缺氧+冷刺激+LPS灌胃多因素联合在新生SD大鼠中诱导NEC模型。每天于8:0 0、12:0 0、16:0 0、20：0 0 时人工喂养新生大鼠4次配方奶（起始量为0.15ml,后逐渐增加）；每天于8：0 0、2 0：0 0 时进行缺氧应激（暴露于纯氮气6 0 s），然后置于冰箱进行冷暴露（4，10 min）；后于每天16：0 0 时经灌胃针注入LPS（10 m g/k g 稀释于配方奶中），连续2 天。空腹12h后以颈椎脱白法处死动物，收集肠组织（回盲部近端2 cm）用于后续实验。3.肠上皮细胞的提取、培养：如汪煜鹏15 所述，先进行试剂配制：细胞洗液：50 ml磷酸盐缓冲液（p h o s p h a t e b u ffe r e d s a lin e，PBS）+0.5m l青霉素（10 0 U/m l）、链霉素（0.1mg/ml）双抗；消化液：15mlDMEM/F12培养基+1.5mg中性蛋白酶(0.1mg/ml）+4.5m g 胶原蛋白酶XI（0.3m g/m l);分散液：1.0 0 g山梨醇+2.5ml胎牛血清+普通DMEM/F12培养基定容至50 ml;完全培养基：5ml胎牛血清+0.5ml青链霉素双抗+0.4mlEGF（2.5g/ml）稀释液+DMEM/F12培养基定容至50ml。参照沈雁等16 的方法,用细胞洗液将获取的肠组织反复冲洗3 5次后将其剪碎,吸取含碎肠组织的溶液到15ml的离心管中。加10 ml的冰PBS溶液,轻柔地吹打，反复几次直至上清液变澄清，16 0 99g离心3min，弃上清。向沉淀中加人适量消化液在37下消化30 min，每隔10 min摇匀1次，静置1min后取上清入15ml离心管中,重复上述操作2 次。向上清液中加10 ml分散液，吹打混匀，16 0 9 9 g离心3min，弃上清。沉淀用分散液重悬，重复5 6 次，直到上清液澄清。加入5ml完全培养基重悬，接种于培养瓶中,放入细胞培养箱（37、5%CO,)进行细胞培养，每2 3天换液1次，当细胞密度达8 0%9 0%后进行后续实验。4.分组及干预方法：取对数生长期的细胞分为3组：对照组（用不含药物的完全培养基孵育）、抑制组（加5mmol/L的4PBA处理细胞）、诱导组（加10g/ml的Tm处理细胞）,均处理2 4h6。5.ELISA检测炎性细胞因子：将待测样本室温放置2 0 min，于各反应孔中依次加入标准品和样本50l,每孔加人酶标试剂10 0 l,空白孔除外。用封板膜封板后振荡、混匀后置37 温育6 0 min。每孔加洗涤液人工洗涤5次,后加人50 l显色剂A、B,轻轻震荡混匀,37 避光显色15min，加终止液50 l终止反应。以空白孔调零,采用酶标仪记录450 nm波长.107J Med Res,February 2024,Vol.53 No.2论着处各孔的吸光度（A)值,绘制标准曲线并计算出各组样本肿瘤坏死因子（t u m o r n e c r o s i s f a c t o r，TNF-）、肠脂酸结合蛋白（intestinalfattyacid bind-ing protein,I-FABP)的质量浓度。6.RT-qPCR检测ERS标志物：利用Trizol试剂从培养的肠上皮细胞中分离总mRNA。然后,通过反转录试剂盒将提取的RNA合成为互补DNA。取cD-NA以-actin为内参进行RT-qPCR检测,运用RT-qPCR仪参照试剂盒说明书设置程序:95变性10min，然后9 5变性15s,60退火2 0 s,72延伸2 8个循环40 s。完成循环步骤后，7 2 再延伸5min。采用2-CT法计算葡萄糖调节蛋白7 8（glucoseregula-ted protein78,GRP78）、氧调节蛋白150（oxygen-reg-ulated protein150,ORP150）相对基因表达量。基因名称上游引物：AGGTTGTCTCCTGTGACTTCAAGAPDH(鼠)下游引物：CTGTTGCTGTAGCCATATTCATTG上游引物:TCGACTTGGGGACCACCTATGRP78下游引物：AGTGAAGGCCACATACGACG上游引物:TCAGCTATGGTGTCTTCCGCORP150下游引物：CACCGTTTGGTAGGTCACGA7.Westernblot法检测自噬相关蛋白：处理后的细胞在含有1%苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonylflouride,PMSF）、10%蛋白酶抑制剂和1%磷酸化抑2.各组肠上皮细胞ERS标志物mRNA比较：RT-qPCR检测结果显示，与对照组比较,抑制组GRP78、O RP150 的mRNA相对表达量明显降低,而诱导组明显增高，差异均有统计学意义（P0.05），详见图2。3.各组肠上皮细胞内自噬相关蛋白比较：West-ernblot法检测结果显示,与对照组比较,抑制组p62:108 制剂的冷RIPA（r a d i o i mmu n o p r e c i p i t a t i o n a s s a y,RIPA裂解液）溶液中裂解30 min，收集蛋白用于后续实验。通过聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid,BCA）蛋白试剂盒测定样品的蛋白质浓度。总蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PACE）电泳并转移至聚偏氟乙烯（polyvinyli-dene fluoride,PVDF)膜上。经5%脱脂牛奶室温封闭2h后,把膜与相应的一抗4下孵育过夜。次日,膜经Tris缓冲盐吐温2 0 溶液（tris buffered salinetween2 0,T BST）洗涤3次后，与相应的二抗室温下孵育2 h,TBST洗膜3次。采用成像分析系统扫描获得的印迹,用Gel一Pro32软件进行灰度值分析。通过将条带强度归一化为GAPDH带强度来确定每个通道的LC3/I、p 6 2 蛋白表达水平。表1RT-qPCR引物序列8.统计学方法：应用SPSS27.0统计学软件对引物序列(5-3)数据进行统计分析。计量资料以均数标准差（x s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法,以P0.05为差异有统计学意义。1.各组肠上皮细胞炎性细胞因子比较：ELISA检测结果显示，与对照组比较，抑制组TNF-、I-FABP水平明显降低，而诱导组的表达水平显著增高,差异均有统计学意义（Prdavd-16040200对照组抑制组诱导组图1各组细胞炎性细胞因子表达比较与对照组比较，*P0.05蛋白水平明显升高,LC3I 蛋白水平显著降低;而诱导组则相反,差异均有统计学意义（P0.05）,详见图3、图4。NEC的发病机制极其复杂,其发病与早产、配方奶喂养、肠道微生物菌群失调、炎症、缺氧缺血性损伤等有关，随之引发一系列病理生理变化,最终导致肠结果*100806040*20F0对照组抑制组诱导组讨论医学研究杂志2 0 2 4年2 月第53卷第2 期论着*10r86420LC3 ILC3 IIp62GAPDH对照组抑制组诱导组图3各组细胞自噬相关蛋白条带600F5004003008F*6420对照组抑制组诱导组图2 各组细胞ERS标志物mRNA相对表达量比较与对照组比较，*P0.05kDa黏膜屏障功能障碍、通透性改变、发生不可逆性损16146237对照组抑制组诱导组伤17 。参与NEC的炎性介质包括TNF-、白细胞介素等,TNF-参与活化多种炎性细胞，促进其释放大量的氧自由基和蛋白酶导致肠组织损伤18 ;还可诱导线粒体发生功能障碍甚至使其调亡，引发肠上皮细胞发生凋亡19。I-FABP在肠道缺血性疾病中的表达水平明显增高，可反映肠黏膜损伤程度和通透4322001000对照组抑制组诱导组图4各组细胞自噬相关蛋白表达比较与对照组比较，*P0.05性变化2 0 。此外,它还被认为是一种可预测NEC发疾病密切相关2 5。当ERS无法清除超负荷的折叠展并与肠组织坏死程度相关的生物学标志物2 1。紊乱蛋白时，细胞自噬将被激活以清除这类蛋白维持ERS和自噬在多种胃肠道疾病的发生、发展过程中起细胞稳态。据报道,ERS是NEC新生大鼠自噬的一重要作用。内质网主要参与蛋白质的加工和修饰，指种潜在诱导剂2 6 。自噬是一种广泛且高度保守的细导其正确的折叠和组装。在各种不利刺激的作用下，胞降解过程。LC3是自噬的关键指标,由于可溶性内质网功能发生紊乱，大量错误折叠蛋白质堆积就会LC3I型转化为脂质结合型LC3型是自噬的典型特启动ERs22。重度或持续的ERS则会激活炎症小征,因此使用LC3 I/I比率来评估自噬程度2 7 。体，甚至引起细胞凋亡2 3。在ERS发生时，内质网p62是一种能与 LC3 结合并被降解的应激蛋白,其含驻留蛋白CRP78首先从内质网膜上解离,以帮助被量与自噬水平呈负相关，也被认为是一种自噬程度的破坏的蛋白质重新折叠或降解，其表达水平可反映标志物2 8 。研究表明，NEC组TNF-水平高于健ERS的严重程度，被认为是ERS的生物学标志物康新生儿组，而且随疾病严重程度呈上升趋势，说明之一2 4其浓度与NEC临床分期密切相关2 9。ERS可调节ORP150作为一种机体应对应激时产生的重要肠上皮细胞的炎性反应,持续的ERS会诱导细胞凋ERS伴侣分子标志物，它的高表达与许多ERS相关亡，抑制ERS可能对NEC的肠道有保护作用30.1109*0对照组抑制组诱导组J Med Res,February 2024,Vol.53 No.2论着抑制ERS能够减轻细胞凋亡程度和抑制NEC的发展32 。在严重烧伤小鼠中，抑制ERS可减轻烧伤诱导的自噬激活，使肠道通透性减弱，减轻肠道损伤33。因此,以上研究表明,ERS自噬通路与肠黏膜屏障功能受损疾病（如NEC）的发病机制紧密相关,抑制ERS诱导的自噬可以减轻NEC肠组织的炎性反应。本实验发现,与对照组比较,抑制组的TNF-、I-FABP、G RP7 8、O RP150 m RNA 表达水平明显降低，LC3II 表达水平下调,p62表达水平上调，提示炎性细胞因子、ERS相关标志物表达降低，自噬水平显著下调,诱导组结果明显相反,证明抑制ERS通过阻止细胞内自噬激活显著降低NEC刺激的炎性细胞因子释放,减轻NEC肠上皮细胞的炎性反应,表明抑制ERS诱导的自噬可能是NEC肠组织损伤的保护机制。所以抑制ERS自噬通路可作为NEC肠组织损伤的治疗靶点。综上所述，抑制ERS可减轻NEC肠上皮细胞的炎性反应,其作用机制可能与阻断细胞的ERS自噬通路有关。本研究从ERS和自噬方面揭示了NEC的发病机制,为探索NEC的治疗提供了新思路。利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。参考文献1De Bernardo G.Necrotizing enterocolitis:from diagnosis to therapyJ.Curr Pediatr Rev,2019,15(2):672Pisano C,Galley J,Elbahrawy M,et al.Human breast milk-de-rived extracellular vesicles in the protection against experimental ne-crotizing enterocolitisJ.J pediatr Surg,2020,55(1):54-583Catalina B,Josef N.Necrotizing enterocolitis:long term complicationsJ.Curr Pediatr Rev,2019,15(2):115-1244Jones IH,Hall NJ.Contemporary outcomes for infants with necrotizingenterocolitis-a systematic review JJ.J Pediatr,2020,220:86-92,e35Stey A,Barnert ES,Tseng CH,et al.Outcomes and costs of surgicaltreatments of necrotizing enterocolitis J.Pediatrics,2015,135(5):el190-e11976Qiao L,Yan S,Dou X,et al.Biogenic selenium nanoparticles allevi-ate intestinal epithelial barrier damage through regulating endoplasmicreticulum stress-mediated mitophagy J.Oxid Med Cell Longev,2022,2022:39826137胡甜，申月明，曾亚。内质网应激在炎症性肠病免疫调节中的作用J国际消化病杂志，2 0 2 1，41（1）：15-188随何欢，赵海霞，朱丽莎，等。内质网应激自噬参与葫芦素E诱导的结肠癌细胞凋亡J西部医学，2 0 2 0，32（11）：16 0 416079Lau E,Lee C,Li B,et al.Endoplasmic reticulum stress in the acuteintestinal epithelial injury of necrotizing enterocolitis J.Pediatr Surg:110 Int,2021,37(9):1151-116010Zhu X,Cui N,Yu L,et al.Potential role of endoplasmic reticulumstress is involved in the protection of fish oil on neonatal rats with ne-crotizing enterocolitisJ.Sci Rep,2020,10(1):1-911Chen L,Lv Z,Gao Z,et al.Human beta-defensin-3 reduces ex-cessive autophagy in intestinal epithelial cells and in experimental ne-crotizing enterocolitisJ.Sci Rep,2019,9:1989012Tian YX,Mao MJ,Cao XQ,et al.Identification and validation of au-tophagy-related genes in necrotizing enterocolitis J.Front Pediatr,2022,10:83911013王国琴，张旭明，王胜超，等，内质网氧化还原酶1表达下调对结肠癌细胞增殖、调亡、迁移和自噬的影响J肿瘤，2 0 19，39(5):325-33414文刘晶自噬对新生大鼠坏死性小肠结肠炎模型的影响D太原：山西医科大学，2 0 2 215汪煜鹏小鼠小肠上皮隐窝的培养方法与鉴定D，遵义：遵义医科大学，2 0 2 016沈雁，王章流，钟继红，等基于PERK-eIF2-NFk B信号通路研究甘草酸苷对小鼠肠上皮细胞内质网应激的保护作用J中国现代应用药学，2 0 2 2，11：138 9-139417Choi YY.Necrotizing enterocolitis in newborns:update in pathophysi-ology and newly emerging therapeutic strategies J.Korean J Pedi-atr,2014,57(12):505-51318 Li Z,Sheng L.Significance of dynamic evolution of tnf-,IL-6and intestinal fatty acid-binding protein levels in neonatal necrotizingenterocolitisJ.Exp Ther Med,2018,15(2):1289-129219Baregamian N,Song J,Bailey CE,et al.Tumor necrosis factor-and apoptosis signal-regulating kinase 1 control reactive oxygen spe-cies release,mitochondrial autophagy and c-Jun N-terminal ki-nase/p38 phosphorylation during necrotizing enterocolitis J:OxidMed Cell Longev,2009,2(5):297-30620Yin M,Li ZH,Wang C,et al.Stellate ganglion blockade repairs in-testinal mucosal barrier through suppression of endoplasmic reticulumstress following hemorrhagic shockJ.Int J Med Sci,2020,17(14):214721Heida F,Hulscher J,Schurink M,et al.Intestinal fatty acid-bind-ing protein levels in necrotizing enterocolitis correlate with extent ofnecrotic bowel:results from a multicenter study J.J Pediatr Surg,2015,50(7):1115-111822Cao P,Chen Y,Guo X,et al.Fusobacterium nucleatum activates en-doplasmic reticulum stress to promote crohns disease development viathe upregulation of CARD3 expression J.Front Pharmacol,2020,11:10623Zhang Z,Zhang L,Zhou L,et al.Redox signaling and unfolded pro-tein response coordinate cell fate decisions under ER stress J.Red-0 x Biol,2019,25:10104724FFeng J,Chen Y,Lu B,et al.Autophagy activated via GRP78 to alle-viate endoplasmic reticulum stress for cell survival in blue light-me-diated damage of A2E-laden RPEs J.BMC Ophthalmol,2019,19(1):1-925享郭晓宇，高宇。分子伴侣氧调节蛋白150 在内质网应激相关疾病医学研究杂志2 0 2 4年2 月第53卷第2 期中的研究进展J中国老年学杂志，2 0 17，37（2 3）：5995599726Qi Z,Chen L.Endoplasmic reticulum stress and autophagyJ.AdvExp Med Biol,2019,1206:167-17727Guo JM,Xing HJ,Cai JZ,et al.H2S exposure-induced oxidativestress promotes LPS-mediated hepatocyte autophagy through thePI,K/AKT/TOR pathwayJ.Ecotoxicol Environ Saf,2021,209:11180128朱晨露，杜家如，姚言雪，等沉默ATG5及ATG7可抑制顺铂介导的耐顺铂睾丸癌细胞的自噬和增殖J南方医科大学学报，2 0 2 1,41(5)：6 57-6 6 329胡利霞，方红霞，细胞因子与新生儿坏死性小肠结肠炎的相关性J.中国妇幼健康研究，2 0 19，30（1)：19-2 230Li B,Lee C,Chuslip S,et al.Intestinal epithelial tight junctions andpermeability can be rescued through the regulation of endoplasmic re-（上接第2 8 页）4Burke DT,Carle GF,Olson MV.Cloning of large segments of exoge-nous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors J.Science,1987,236(4803):806-8125Shizuya H,Birren B,Kim UJ,et al.Cloning and stable maintenanceof 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coliusing an F-factor-based vector J.Proc Natl Acad Sci U S A,1992,89(18):8794 87976Spirhanzlova P,Dhorne-Pollet S,Fellah JS,et al.Construction andcharacterization of a BAC library for functional genomics in Xenopustropicalis J.Dev Biol,2017,426(2):255-2607Gong S,Kus L,Heintz N.Rapid bacterial artificial chromosome mod-ification for large-scale mouse transgenesis J.Nat Protoc,2010,5(10):1678-16968Luo M,Wang YH,Frisch D,et al.Melon bacterial artificial chromo-some(BAC)library construction using improved methods and identi-fication of clones linked to the locus conferring resistance to melon Fu-sarium wilt(Fom-2)J.Genome,2001,44(2):154-1629Zhao Z,Xie X,Liu W,et al.STI PCR:an efficient method for am-plification and de novo synthesis of long DNA sequences J.MolPlant,2022,15(4):620-62910Johnson SJ,Wade-Martins R.A BACwards glance at neurodegener-ation:molecular insights into disease from LRRK2,SNCA and MAPTBAC-transgenic miceJ.Biochem Soc Trans,201l,39(4):862-.86711Zhang Y,Zhang X,OHare TH,et al.A comparative physical mapreveals the pattern of chromosomal evolution between the turkey(Me-leagris gallopavo)and chicken(Callus gallus)genomesJ.BMC论着ticulum stress by amniotic fluid stem cells during necrotizing enterocol-itisJ.FASEB J,2021,35(1):e2126531Li P,Fu D,Sheng Q,et al.TUDCA attenuates intestinal injury andinhibits endoplasmic reticulum stress-mediated intestinal cell apopto-sis in necrotizing enterocolitis J.Int Immunopharmacol,2019,74:10566532Afrazi A,Branca MF,Sodhi CP,et al.Toll-like receptor 4-medi-ated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces