可视化检测技术在生化分析领域中的应用研究进展.pdf

CHINESEJOURNALOFAPPLIEDCHEMISTRY2024年1月21-38应用化学第41卷第1期D01:10.19894/j.issn.1000-0518.230235可视化检测技术在生化分析领域中的应用研究进展李凯璇陈晋荣！邹倩倩？时鹏飞！刘丽赏*张书圣1*1（临沂大学医学院，临沂2 7 6 0 0 0）2（临沂市中医医院检验科，临沂2 7 6 0 0 0)摘要可视化检测技术是通过待测物的刺激引发一系列反应产生光学信号，进而在裸眼或者图像处理技术的辅助下，实现对待测物进行定量的技术。将可视化检测技术应用于生化分析领域中，可以有效降低检测成本，并改善依赖专业仪器、专业人员和操作繁琐等问题。本文介绍了近15年来可视化检测技术在生化分析领域中的最新研究进展，根据产生的信号可大致分类为颗粒计数法、比色法、液晶传感、距离信号和侧向流动试纸条等方法。最后，本文对可视化检测技术的优势以及挑战进行了分析，并对可视化检测技术的开发及其在生化分析领域的应用前景作了展望。关键词可视化；生化分析；颗粒计数；距离信号；显色分析中图分类号：0 6 2 5文献标识码：A文章编号：10 0 0-0 518(2 0 2 4)0 1-0 0 2 1-18目前,生化分析技术可以对蛋白、糖、核酸、毒素和金属离子等多种靶标进行定量检测，已经在药品检验、法医鉴定和临床诊断等多个领域发挥重要作用。随着社会的发展，生化分析技术也迎来了新的挑战，很多情况下,均需要对靶标进行现场即时检测(POCT)1-3。但这些靶标往往具有尺寸小、含量低的特点4)，直接且准确检测及定量十分困难，而实验室中的技术往往依赖专业仪器，存在体积庞大、操作复杂和不方便携带等缺点，导致无法实现现场即时检测5。因此，降低检测成本，提高检测效率，减少仪器依赖，进而实现现场即时检测是生化分析研究的重要方向 6,尤其是新型冠状病毒感染的肺炎疫情的爆发使得即时生化分析技术的开发成为需求热点 7-8。开发出如验孕试纸条、血糖计等便携以及不依赖专业仪器的方法一直有迫切的需求和广阔的市场前景 9,可视化检测方法的发展提供了一种新颖的解决方案，视觉传感系统可以联合智能手机，尤其是在资源有限的地区具有巨大的应用潜力 10-14。近近年来，基于多种读取信号的可视化分析传感技术已经开发，如基于颗粒计数的可视化检测方法，可以直观地看到检测结果，并进行简单的计数定量检测 15,基于颜色变化的比色分析法，通过检测体系的颜色变化达到检测效果 16,基于液晶传感的光学检测方法，在偏光下观察液晶基底的颜色变化来检测靶标 17,基于距离变化的可视化检测方法通过微流控等装置，可以直接定量检测结果18，以及基于侧向流动试纸条的检测方法，操作简便，结果直观，可适用性强【19。这些新方法不仅具有良好的检测性能，同时满足简便经济等实用性；因此这些新技术的开发推动了可视化生物检测的发展与进步，并为今后现场即时检测的实现奠定了技术基础1基于颗粒计数的可视化技术颗粒计数是免疫分析的前沿技术，可以实现早期诊断，对生物标志物在1amol/L1000 fmol/L范围内实现定量分析，理论上颗粒计数方法可以实现对单个分子的检测 2 0。Zhou等 2 1首先提出了一种使用金纳米颗粒（GNP)探针辅助夹心的技术，利用GNP探针制成抗体功能化芯片，与抗原结合后通过扫描电子显微镜（SEM)对金纳米颗粒计数来实现靶标的检测，并以标准癌胚抗原为例进行了验证。如图1A所示，首先使用抗癌胚抗原（CEA)抗体标记GNP，并将抗体修饰到硅片上，当CEA与硅片上的抗体结合后，加入GNP修饰的二抗与其复合物形成三明治夹心结构，通过SEM扫描后即可观测计数。此方法需要借助SEM仪器才能实现计数检测，无法实现在条件有限区域的即时检测。Zhou等 2 2 随后尝试利用T72023-08-07收稿2 0 2 3-11-10 接受国家自然科学基金（Nos.21675076,22076073）和国家级大学生创新创业训练计划（No.202210452011）资助*E-mail:;22第41卷应用化学噬菌体斑点作为读取信号，进行肉眼定量检测如图1B所示，此方法依赖于2 种探针，一种是同时固定有T7噬菌体和与目的基因互补寡核苷酸的金纳米颗粒T7-GNP,另一种探针为能与目的基因互补的寡核苷酸修饰的磁性微粒（MNP）。靶miRNA的存在使得上述2 种探针形成类似于三明治 结构的复合物，引人竞争性金结合肽与GNP结合，将T7噬菌体从复合物中释放，磁分离T7噬菌体后将其接种到宿主细菌培养基上，通过对培养基上的斑点进行计数即可量化目标基因，此方法对单靶点和双靶点miRNA的检出限分别是3和5amol/L。在此方法基础上,Xu等 2 3又使用不同噬菌体对不同靶标(H9N2病毒)实现了可视化检测。如图1C所示，用抗噬菌体抗体和抗禽流感病毒（AIV)抗体修饰的M13噬菌体与GNP结合，得到M13-GNP探针，用抗AIV抗体修饰磁性微粒得到M13-MNP探针。2 种探针均可结合H9N2病毒的血凝素蛋白形成具有夹层结构的复合物，夹层结构复合物经过磁分离处理后接种到宿主细胞（ER2 7 38)的琼脂板上，M13噬菌体上携带大肠杆菌LacZ基因，经过培养可以产生色泽明显、肉眼可见的亮蓝色斑块。通过对培养皿血上的斑块计数即可实现对靶标简便的、直观的和灵敏的定量，具有对检测设备要求低、易操作和可用肉眼观察等优点。ABAUMMPMMPMMPGNPAnti-CEAantibodiesGNPProbeCEAAntibody ChipCLaserMNPH9N2GoldnanoparticleMMPMagneticmicroparticleMNPmiRNA-capturingbGreen phageplaqueoligonucleotide1miRNA.capturingGreenfluorescentT7GNPM13phageYanti-AlVantibodyoligonucleotide2b:MNP probeCompetingpeptidea:M13-GNPprobeC:M13-GNP/H9N2/MNPTargetmiRNA图1（A）G NP探针辅助SEM计数芯片原理图 2 1；（B）以噬菌体-金纳米生物材料为探针进行靶miRNA的计数 2；（C）利用噬菌体-金纳米颗粒为探针进行靶病毒的肉眼计数 2 3Fig.1(A)Schematic of CNP probe-assisted SEM-counting chip/2l;(B)The phage-gold nanobiological materialwas used as a probe for gross enumeration of target miRNA12;(C)Macroscopic counting of target viruses usingphage-gold nanoparicles as probes:aChen等 15尝试将气泡作为识别信号，通过智能手机拍照并计数从而实现对靶蛋白分子的定量，原理如图2 所示，首先利用捕获抗体修饰磁性微球，捕获靶蛋白分子后形成“捕获抗体-磁性微球-靶蛋白分子”复合物，进一步与铂纳米颗粒(PtNPs)结合后形成夹心复合物。使用外磁场将夹心复合物与过氧化氢溶液一起沉入微泡芯片上的方形微孔阵列内，GNP可以催化过氧化氢分解产生氧气，方形微孔阵列中因为氧气的积累而出现明显的微泡，借助智能手机上配备的移动镜头（9 倍放大）可以清晰的观察到借助图像分析程序，对智能手机拍摄的在各种条件下产生的微气泡进行计数，从而实现定量分析。使用此方法用于前列腺切除术后前列腺特异性抗原(PSA)的检测，,其检测检出限为2.1fmol/L。同时使用此方法来检测人绒毛促性腺激素亚基(-HCG)的含量以此来判断是否存在早期妊娠,其检出限为0.034 U/mL。Kim等 2 4提出了一种基于原位生成多面体铜纳米壳的可视化DNA检测方法，原理如图3所示。将目标DNA捕获在玻片上后，与修饰互补DNA的金纳米颗粒形成三明治复合物，然后将玻片浸人铜多面体纳米壳（CuP)增强溶液中，借助在金纳米颗粒（AuNPs）上的聚乙烯亚胺(PEI)的作用，使CuP在金纳米23李凯璇等：可视化检测技木什化分析领域中的应用研究进展第1期颗粒上以一种可控的形式生成,并且不会有明显的非特异性生长。在10 min内，就可检测载玻片上的铜多面体的橙色可见斑点。这种方法不需要分析仪器的辅助就可以检测到低至8 x10-15mol/L的DNA（炭疽序列)以及2 7 0 0 个病毒拷贝（临床粪便样本中的诺如病毒）。此方法在检测限度、动态范围、易操作性、成本、检测时间以及样品总量等方面表现优越AMagneticbeadCDMicrobubbleETargetMicrowellArrayMicrochip!CapturePDMSChamberAntibodyDelectionSupportingGlassSlideNeutrAvidin-PtNpMobleParyleneCLayerAntibody-BiotinMicroscopeH,o,Solution200BSmartphoneF2H,00Magneticbeads2H,0H,o,SolutionMicrobubbleMicrowellMicrobubblePDMSMagnet图2基于铂纳米粒子的微气泡分析原理图 15Fig,Schematic of platinum nanoparticle based mierobubbling ssay isWAuCuPenhancementTargetnanoprobeDNARoomtemperature10minTargetDNA-captured2mmMicroarrayedAunanoprobesCuP-enhancedDNAassayresultCaptureDNA(invisiblespots)(visiblespots)图3基于CuP增强的裸眼DNA检测方法原理图 2 4Fig.3Schematic of the CuP-enhanced naked eye DNA detection method242基于液晶传感器的可视化检测液晶(Liquid crystal)是介于晶体与液体之间的中间状态，同时具有晶体和液体的特性，比如灵敏的反应取向、弹性应变和双折射的性质 2 5。在液晶表面发生的化学或生物相互作用会导致内部液晶分子的取向变化，而液晶分子取向的变化会导致宏观的液晶光学信号改变 2 6 ,液晶分子的这一独特性质被应用于生物分子的可视化分析。Shen等 2 7 开发了一种以液晶的表面固定化为基础的DNA检测方法，发现适当长度的单链DNA(ssDNA）作为探针固定在三乙氧基甲硅烷基丁醛（TEA）修饰的固体表面时可以导致液晶的同向取向，检测原理如图4所示。作者将不同浓度的ssDNA探针固定在有TEA修饰的玻片上，液晶的同向取向可由含有2 2 个碱基且浓度为20nmol/L的ssDNA探针经过表面固定处理后实现。液晶形成同向取向后的光学图像是灰暗的，一旦靶DNA与ssDNA特异性结合，就会破坏LCglassslideslassslidedglassslideglass.sides5CBSSDNAdsDNATEA图4基于液晶的表面固定单链DNA杂交检测 2 7 Fig.4Liquid crystal-based detection of DNA hybridizationusing surface immobilized single-stranded DNA2724第41卷应用化学的同向取向状态，进而产生明亮的光学外观，这一光学信号可以通过交叉偏振器被肉眼观测到，其检测限约为0.1nmol/L。这种DNA测定方法具有较强的特异性，不需要荧光等特殊标记并且操作简便 2 7 许多阳离子尤其对液晶的锚定作用有很大的影响 2 8-2 9，尤其是Nat，只需要少量吸附就可以达到破坏液晶取向的目的 30 。基于DNA带负电荷的特性，可利用DNA与金属离子形成络合物来改变液晶的取向 31,这种现象可被用来反映DNA的存在，但无法保证钠离子-DNA络合物中的DNA是特异性的靶DNA还是非特异DNA。Liu等 32 引人了可以特异识别靶标DNA的肽核酸（PNA），与DNA带负电荷不同的是，肽核酸是电中性的，不会与金属离子结合形成络合物，从而不会影响液晶的方向。如图5所示，PNA可以被用为特异性探针，固定在反应表面，使其与靶DNA互补杂交，而不会与非特异DNA分子杂交，DNAw/wsodiumionADNAw/osodiumionBPNAw/wsodiumionCPNA/DNAw/wsodiumionD图5液晶法检测DNA的原理（红色探针代表DNA而蓝色探针代表PNA)321Fig.5Principles for detection of DNA by using LC(Redprobes represent DNA whereas blue probes represent PNA)2以此来影响液晶方向判断是否为靶DNA，此方法可检测到6 0 0 bp的靶DNA，达到10 fmol/L的检测限 32 。赭曲霉毒素（OTA)是一种可以侵害动物肝脏与肾脏的真菌毒素,对人体具有极其致命的危害,可能存在于人们日常食用的食品与饮料中。为了能够高灵敏检测低浓度的OTA,Khoshbin等 33 探索了一种液晶型核酸适配体传感器。在OTA存在的条件下,DNA在三乙氧基硅烷/N,N-二甲基-N-(3（三甲氧基硅基)丙基）-1-十八胺氯（APTES/DMOAP)修饰的玻璃基板表面上形成型结构，会诱导液晶分子发生取向变化，这一现象是本技术的基础。在没有OTA存在的情况下,DNA链会呈现型结构。一旦体系内存在OTA,那么型结构就会与OTA结合，进而导致DNA链与特定适配体的结合受到干扰。此时液晶的取向由会发出亮光的随机取向状态转换为光亮灰暗的同向取向状态。在偏振光学显微镜的观测下，适配体传感器的光学图像由明亮变灰暗。如图6 所示，液晶型核酸适配体传感器在各个不同浓度的OTA溶液中存在时发出的亮度不同，该传感器可以在低至O.63amol/L的超痕量水平下检测OTA，该传感器还可以灵敏地检测存在于葡萄汁、咖啡，甚至人血清内的OTA3(A)(B)(C)(D)(E)(F)(G)(H)图6适配体液晶传感器在不同浓度OTA存在下的偏振光图像33Fig.6The polarized images of the LC-based aptasensor in the presence of the various concentrations of OTA33125李凯璇等：可视化检测技术在生化分析领域中的应用研究进展第1期3基于比色法的可视化检测方法比色传感器通过使用纳米酶或纳米酶样材料来催化伴随颜色变化的化学反应，从而实现检测。此外，化学或生物分析物的比色识别也可以通过金属纳米颗粒独特的颜色特性来实现。基于比色分析的检测方法因其低成本、便携和易操作等优势，可通过肉眼实现对靶标的定量，广泛适用于POCT1.34-35。3.1基于金纳米颗粒的比色分析方法金纳米颗粒具有独特的局部表面等离子共振性质，且其与金纳米颗粒的形状、尺寸、颗粒间距和表面性质相关，因此可以将金纳米颗粒开发为显色底物，达到肉眼识别的效果 36 37 。例如，金纳米棒长度改变会导致其溶液显示出颜色变化并被肉眼识别，基于这一现象，Ma等 38 利用待分析物引发的刻蚀使金纳米棒缩短，呈现出不同的颜色。如图7 A所示，不同浓度的过氧化氢在Fe2存在的条件下产生自由基，可以使金纳米棒发生蚀刻而缩短从而显示出不同的颜色，覆盖了从40 0 7 6 0 nm的可见范围。将其与传统酶联免疫吸附方法（ELISA)相结合，可实现蛋白质生物标志物的检测，如图7 A所示，附着在抗体-抗原-二抗夹心复合物表面的过氧化氢酶催化过氧化氢分解，产生的自由基，使金纳米棒发生蚀刻，从而可视化检测蛋白质分子。基于同样原理，他们进一步对小分子及miRNA-21进行了可视化检测（图7 B），溶液的最终颜色与目标蛋白的浓度密切相关。ACBH20+02HO+OOH+H2OH2021.00Fe2+140.50300450600750CatalaselabeledWavelength/nmCaptureTargetb14YantibodymoleculeantibodyInitial AuNRAuNRafteretching图7（A）NEQ 法用于H,O,的可视化定量。（B)提出的NEQ-ELISA蛋白质可视化半定量检测的原理日38 1Fig.7(A)Naked-eye semiquantitative(NEQ)assay for visual quantification of H,O2.(B)Principle of the proposedNEQ-ELISA for visual quantification of proteins38除金纳米棒长度的变化外，金纳米颗粒的聚集和分散行为使其表现出依赖距离的光学信号，导致溶液发生从红色到紫色的颜色变化并可被肉眼识别 39-2 。Liu等 43 设计了一种以金纳米颗粒比色检测和杂交链反应（HCR)扩增为基础的DNA测定方法，如图8 所示，他们设计了两个发夹式辅助探针H1和H2,H1末端的片段I（蓝线）与H2的片段I（蓝线）互补,H2的端片段（红线）可以与H1的片段I（红线）杂交，且HI的片段I也可以与目标DNA杂交（绿线）而打开发卡HI,进而杂交H2,每个靶基因均可以引发H1和H2发夹之间杂交链式反应，形成缺口双螺旋。形成的缺口双螺旋dsDNA较硬不容易弯折，与带负电荷的AuNPs之间的产生强烈排斥，导致金纳米颗粒在盐作用下聚集。因此，在胶体溶液中观察到淡紫色到蓝色的颜色变化，从而实现靶DNA的肉眼观测。该检测系统除具有金纳米粒子比色法的传统优点外，还具有以下优点：1)避免了酶的引入，操作简单易行；2)具有超高的检测灵敏度，仪器检测的比色检测限为50 pmol/L，肉眼检测的比色检测限为10 0 pmol/L；3)它对完全匹配的目标寡核苷酸和单碱基对错配的目标具有高度的区分度。基因编辑技术可以在定点修饰和编辑生物体的基因或转录物,通过识别测试样本中的特定序列来实现检测病原体的功能 44,簇状规则间隔的短回文重复序和相关蛋白(CRISPR-Cas)系统可以对DNA/RNA识别并编程，在互补靶标存在的条件下可以将ssDNA或ssRNA反式切割 45-46 。该系统为检测DNA提供了一个全新的思路：同时向细胞内递送靶向该DNA的CRISPR-Cas系统和非特异性ssDNA荧光报告基因（即荧光剂与猝灭剂双标记的序列），一旦检测到目的DNA，CR ISPR-Ca s 系统将启动，与此同时，荧光26第41卷应用化学targetStep2StepStep3H1H2Step3Step2notargetSaltSalt图：使用金纳米粒子和杂交链式反应扩增的高灵敏度比色检测DNA的示意图 43Fig.8 Schematic of high sensitive colorimetric detection of DNA by using gold nanoparticles and hybridizationchain reaction amplification43报告基因也会被剪切，从而释放出荧光信号，达到诊断的目的 47 。Yuan等 48 提出了一种以CRISPR/Cas系统为基础的AuNPs比色基因传感平台策略，如图9所示。在该检测平台中，通用连接子ssDNA或ssRNA被设计为Cas12a或Cas13a系统的反式裂解底物。此外,设计了一对通用的金纳米粒子-DNA探针，用于与连接ssDNA或ssRNA杂交，在没有靶点的情况下，反式裂解不会被激活，因此连接ssDNA或ssRNA在反应系统中保持完整。AuNPs-DNA探针对将经历杂交诱导的交联以形成聚集状态；当Cas12a/crRNA和Cas13a/crRNA分别识别其靶DNA和RNA时，连接子ssDNA和ssRNA将被降解。AuNPs-DNA探针对失去了杂交的连接子,因此变得分散,导致肉眼可见的颜色变化,从而实现了裸眼基因检测。基于CIRSPR/Cas的比色平台具有探针的广泛适用性、高灵敏度、可用于现场检测以及能与等温反应条件兼容等优点。Cas12a/crRNACas13alcrRNALinkerDNALinkerRNAWMWLLTargetdependentTargetdependentWtrans-cleavagetrans-cleavageTargetRNATargetDNACas12a/crRNACas13a/crRNALinkerDNALinkerRNAMSMWWMNotrans-cleavageNotrans-cleavageNotargetDNAactivityactivityNotargetRNA图9基于CRISPR/Cas的比色基因检测原理图 48 Fig.9Schematic diagram of colorimetric gene detection based on CRISPR/Cas48以AuNPs为基础的银信号增强检测方法也是一种可视化检测方法。Taton等 49 研究了一种利用纳米颗粒来标记寡核苷酸并使用常规平板扫描仪来分析DNA的方法。首先，用寡聚核苷酸分别修饰透明平面和金纳米颗粒，接着将靶DNA与修饰后的AuNPs放人反应缓冲液中,因为靶DNA与寡聚核苷酸可以互补杂交，那么将会在反应平面形成三组分夹心结构。在较高浓度（1nm)靶DNA存在的条件下,反应平面因杂交较多AuNPs呈现浅粉色。而在较低浓度（10 0 pmol/L)靶DNA存在的条件下，颜色变化较小，难以肉眼观测。因此他们将银离子放入反应体系，银离子被AuNPs表面存在的苯二酚还原为金属银，此时就会产生可视化的现象。使用纳米粒子还原银离子的信号放大方法后，该体系检测的灵敏度比27李凯璇等：可视化检测技术在生化分析领域中的应用研究进展第1期类似的荧光检测方法高出2 个数量级。Ji等 50 将汞离子介导的构象分子信标（MB)和AuNPs聚集等方法相结合，设计了一款用于检测DNA分子的新方法。如图10 所示，在靶DNA不存在的条件下，连接DNA将会与汞离子发生结合，从而导致MB形成非活性环状结构。此过程将不会使聚腺苷功能化的AuNP(A-AuNP)发生聚集,而是处于分散状态，通过加入还原剂催化银还原反应，反应平面上将会出现肉眼可分辨的黑斑。而当靶DNA存在时，由于靶DNA对连接DNA的亲和度要大于汞离子对靶DNA的亲和度，所以靶DNA会优先与连接DNA发生杂交反应,从而使MB解开非活性的环状结构。杂交后的链状DNA的多胸腺末端可以与A-AuNP发生反应，从而导致金纳米颗粒聚集，从反应表面上表现为斑点上银沉积减少，即斑点颜色变淡。此种检测DNA的方法操作简便，无需标记DNA，并且具有高灵敏度和高特异性等优点。*、*一日Hybridization7AggregationSliverlonTargetDNALink DNAHydroquinoneCaptureDNAAuNPs+Hg2+图10用视觉扫描策略检测DNA分子信标(MB)方法的原理图 50)Fig.10Schematic of the DNA molecular beacon(MB)detection method using the visual scanning strategy503.2其它比色分析法基于比色法在即时检测领域的巨大潜力，除基于金纳米材料的比色方法，多种其它原理的比色方法得以开发，例如氧化还原反应、矿化反应和染料控释等。Hao等 51 以4种不同颜色的染料为信号指示剂，通过调节pH值克服染料相互干扰，开发了一种pH分辨比色生物传感器，用于同时检测赭曲霉毒素A（O T A）、黄曲霉毒素B1（A FB1）、伏马菌素B1（FB1)和微囊藻毒素-LR（M C-L R）,策略如图11所示。探针1和探针2 与适配体是部分互补链，并与适配子同时杂交形成氧化石墨烯组装体。靶点的存在会与适配子结合并导致组装的解离,在生物识别和磁分离之后,pH值作为一个新的维度来控制从石墨烯中释放染料的顺序，以量化目标，通过调节溶液的pH值可以依次获得4个靶点的浓度。同时，氧化石墨烯的DNA导向自组装和磁分离相结合也避免了生物传感器制造过程中繁琐且高成本的化学修饰过程。这种生物传感器为多靶点检测提供了一种简单、快速、准确和低成本的新策略。HAFB1+MC-LRtargetsOTA+FB1OHGOallochroicdyes(PPMCCBTPMV)Massistant DNAprobe1assistant DNAprobe2Fe:O./GOMOTAaptamer AFB1aptamer FB1aptamer MC-LRaptamer图11用于同时多目标检测的pH分辨比色生物传感器策略 51Fig.11Schematic of pH-resolved colorimetric biosensor for simultaneous multiple targets detection s128第41卷应用化学Long等设计了一种基于纳米纤维膜和3种不同扩增方法的超灵敏疾病DNA标志物的多扩增纳米纤维传感比色技术，检测原理如图12 所示。多重扩增反应包括催化发夹自组装（CHA)扩增、脱氧核酶催化比色反应和葡萄糖氧化酶(GOx)生物催化。纳米纤维膜作为电位传感界面的材料，将DNA酶催化的比色反应、葡萄糖氧化酶生物催化反应以及催化发夹组装扩增反应结合到一起，用来检测艾滋病毒（HIV）D NA 靶标序列。当靶DNA不存在时，多功能纳米纤维膜不会发生颜色变化。当反应系统中加人418 nmol/L的靶标DNA时，发生CHA扩增反应，具体表现为：靶DNA作为启动子，触发级联杂交反应，此时被生物素标记且固定在纤维纳米膜表面的H2与H1形成双螺旋结构。H2DNA片段在G-四链体与血红素结合时会形成DNA酶,在葡萄糖氧化酶生物催化产生的过氧化氢存在的条件下,DNA酶可以催化无色的2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）离子ABTS2-氧化为绿色的ABTS。反应体系的颜色由无色变为绿色，通过颜色变化就可以实现靶DNA的肉眼观测。此种检测方法经济实惠、能够裸眼检测目标DNA，可实现人体血清样本痕量DNA的检测与单碱基错配的辨别。OVHICHAtargetWrecyclingHI-H2ABTSABTS2-00000112H20H202glucoseglucoseH20ABTS02gluconicacidPSDBDGOXavidinbiotin-H2targetH1hemin图12基于多重扩增纳米纤维传感平台的目标HIV可视化检测原理图!Fig.12Schematic diagram of targeted HIVvisual detection based on amultiplex amplifiation nanofiber sensing plafomNicholas等 52 1利用酶-DNA纳米结构组成的集成电路来直接检测感染细胞中的病原体核酸，系统内设置的酶级联反应可以快速产生肉眼可见的颜色变化，原理如图13所示。该集成电路含有酶辅助的纳米复合物，由一系列酶-DNA纳米结构组成。适配体与从水生栖热菌提取的（Taq）D NA 聚合酶结合并使Target recognitionTarget-independent signalingVisualdetectionRecognitionSignalingnanostructurenanostructure000000000000000000000Inactive0000000000polymeraseSelf-priminghairpinTargetDNABiotindNTPActiveBound HRPpolymerase图13病原体核酸的可视化和模块化检测原理图52Fig.13Schematic diagram of visualization and modular detection of pathogen nucleic acids s2?29第1期李凯璇等：可视检测技术在生化分析领域中的应用研究进展其失活，当互补靶DNA存在时，适配体发生解离并激活TaqDNA聚合酶。被激活的TaqDNA聚合酶以一种不依赖靶点的方式延长作为信号的颈环序列，生物素标记的脱氧核苷酸(dNTP)被添加到信号纳米结构上并进一步固定辣根过氧化物酶（HRP），从而产生的视觉信号可以通过肉眼观测，并通过智能手机量化，该方法具有测定速度快（2 h）、灵敏度高（10 amol/L）等优点。Zhou等 53 设计了一种应用生物矿化辅助扩增（BMA)技术灵敏检测DNA的方法。该方法利用AuNPs探针可以诱导硅酸盐的生物矿化的特性，将二氧化硅形成、放大的过程应用于生物芯片的视觉信号读取上，策略如图14所示。第1种探针（AuNP-S)是一种同时具有目标识别寡核苷酸DNA1和生物矿化能力硅酸盐蛋白功能化的AuNP。第2 种探针（AuNP-O探针）是低聚乙二醇（OEG)衍生物封盖在AuNP表面制成。当被修饰的反应表面与靶DNA、A u NP-S探针结合后，AuNP-S探针上的硅酸盐就会催化SiO,的合成，同时可以捕捉AuNP-O探针。最后，银金属就会在AuNP-S与AuNP-O结合的位置上发生沉积，银金属的选择性沉积使信号的可视化检测更加灵敏。abUAuSilicaSynthesisSilverSignalGenerationAuNPSilicateinDNA1Molecule2JVVVDNA3MDNA4图14生物矿化辅助扩增（BMA)策略的示意图 53)Fig.14Schematic representation of the biomineralization-assisted amplification(BMA)strategy53Piao等 54)提出了一种基于聚合二氧化硅纳米粒子探针光散射的人乳头瘤病毒(HPV)DNA芯片检测方法。HPV靶DNA被夹在固定于芯片上的捕获DNA和固定在普通二氧化硅纳米颗粒上的探针DNA之间，三者形成“三明治”夹心结构。发生DNA杂交的部位会呈现亮白色，可以轻易被肉眼和简便检测平台检测到。而杂交方法有2 种，分别为两步DNA杂交和三步DNA杂交法，其中三步法比两步杂交法光散射信号更强，更易被捕捉到。此种检测方法无需使用复杂的检测仪器就可以实现可视化检测，其操作简便和性价比高的优点为便携式检测试剂盒的开发提供了基础。4基于距离变化的可视化检测通过精巧设计，可以将分析信号转换为距离变化来构建一个传感系统，从而实现对目标分子的实时可视化检测。这种方法可以结合微流控的分析器件或者纸基平台来构建，通常将距离的显著变化作为传感信号，以提供可见的定量读数，而无需昂贵的仪器或复杂的数据处理。基于距离的可视化检测方法本节以YangChaoyong团队的研究进展为例进行了介绍。Song等 设计了一种多路容量条形图芯片（MV-Chip)用来对DNA进行定量检测。该方法利用过氧化氢酶催化过氧化氢分解产生的氧气，可以推动有色墨水沿着通道涌动形成墨水柱，根据墨水柱运动的距离实现可视化定量靶标，全过程无需附属仪器、数据处理或计算机的图形绘制的辅助。如图15所示，采用了“火箭式”推进装置对信号进行放大，以此提高检测灵敏度。靶DNA杂交过氧化物酶探针，进入反应系统后，会引人过氧化氢酶作为引发剂使推进剂发生响应，并借助反应中沉积的金属铂膜对信号进行放大，经过级联放大后，系统会产生更多的氧气，从而使墨条走得更远，此时就可以通过墨条对靶标进行可视化检测。基于三级级联放大反应，该芯片的灵敏度比未放大的芯片提高了约10 0 0 倍，血清等复杂基质对信号强度的干扰可以忽略不计。30第41卷应用化学a)Airoutlet-CSlideRedinkRtH.ODNAAssay-b)d11CatalasePtPtPtH20202H20202CatalasePlatinum(Pt)图15一种用于DNA可视化定量的多级容量条形图芯片原理图 5Fig.15Schematic diagram of a multistage capacity bar graph chip for DNA visualization and quantification sZhu等 56 利用酶包埋、适配体交联等技术，可制得响应型水凝胶，在刺激物作用下可以调节流体流动性质。进一步将容量条形图芯片（V-Chip）与响应水凝胶相结合，如图16 所示，首先将Au核/Pt壳纳米颗粒（AuPtNP)封装在水凝胶中，当水凝胶与引人的靶标结合后，就会立即溶解并释放内部的AuPtNPs,以此有效催化H,O,分解，产生大量的O,移动V-Chip中的墨条移动，通过读取墨条的移动距离，可以直观地量化靶标的浓度 56 。OdnSupIsBDdnSupsDyeGelOReservoirNegativeforPressureSampleLoadingIncubationLoadingCatalysisReadingERiseupDyeH.0Target2AptamerH:02BubbleAptamer-targetAUPINPScomplexGelSoiAUPNPs图16AuPt纳米颗粒封装的目标响应水凝胶与容量条形图芯片读出定量即时检测方法原理图 56 Fig.16AuPt schematic diagram of nanoparticle-encapsulated target-responsive hydrogel and volumetric bar graphchip readout quantitative point-of-care detection methodsWei等 57 开发了一种通用的即时检测平台，可基于微流体纸质分析设备（PAD)同时检测多个目标，并使用目标响应水凝胶介导流体流动和信号读数。如图17 所示，在没有靶标存在的情况下，流道中会形成水凝胶，从而导致PAD中的流动停滞，使彩色指示器无法到达最终的观测点，最后产生“off的七31第1期李凯璇等：可视化检测技术在生化分析领域中的应用研究进展信号。相反，在靶标存在时，由于靶标与适配体的优先相互作用，系统中不会形成水凝胶。这使得自由流体在PAD中流动，将彩色指示器带到观测点，并产生肉眼可见的“on信号。Adding SamplewithouttargetAdding SamplewithtargetHydrophilicreservoirLayer:L-Apt layerP-SA&P-SBlayerFoodcolorlayerStopwithFlowwithSignal offSignal onHydrophilicchannelHydrophobicpaperL-AptP-S.AP-SBTargetL-Apl&TanetCompleGelSol图17基于微流控纸基的分析装置(PAD)原理图 57 Fig.17Schematic diagram of a microfluidic paper-based Analysis Device(PAD)5)随后Wei等 58 又开发了含糖水凝胶集成纸基分析的装置（DiSH-PAD），如图18 所示，以适配体为交联剂合成了一种含有诱捕型葡糖淀粉酶(GA)的含糖水凝胶。当靶标存在时,水凝胶发生分解并释放GA到反应中，将淀粉水解为葡萄糖。将GOx和无色的3,3-二氨基联苯胺(DAB作为底物，修饰在PADs上的亲水通道，当葡萄糖通过毛细血管作用沿通道移动时，GOx将葡萄糖转化为H,O2。此外，DAB被辣根过氧化物酶（HRP)转化为棕色不溶性聚3,3-二氨基联苯胺po