抗沉默功能蛋白1B在幽门螺杆菌感染的人胃癌细胞中的表达及其对AGS细胞株增殖和转移能力的影响.pdf

58 消化肿瘤杂志电子版2024年3月第16卷第1期J Dig Oncol(Electronic Version).March 2024.Vol 16.No.I 抗沉默功能蛋白1B在幽门螺杆菌感染的人胃癌细胞中的表达及其对AGS细胞株增殖和转移能力的影响蔡育志，高剑，黄永业，刘丁一，廖海华，张彤广州市番禺区中心医院消化中心，广东广州511400【摘要】目的检测组蛋白伴侣抗沉默功能蛋白1B(anti-silencing functional protein lB,ASFlB)在胃癌组织中的表达情况及其与胃癌患者预后之间的关系，探讨ASFlB对人胃癌细胞株ACS增殖、转移能力的影响以及可能的分子机制，分析ASFlB与幽门螺杆菌感染之间的关系。方法分析癌症基因组图谱数据库中泛瘤种的肿瘤组织和癌旁正常组织中ASFlB的表达情况，并通过实时荧光定量聚合酶链反应(realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测ASFlB在所收集的59例配对的胃癌组织及癌旁正常组织中的mRNA表达水平。分析Kaplan-Meier plotter数据库中胃癌患者ASFIB的表达水平与其预后之间的关系，后通过免疫组织化学检测胃癌组织芯片中ASFlB的表达水平并分析其与胃癌患者临床预后及临床病理参数之间的关系。通过小于扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术敲低胃癌细胞系ACS中的ASFIB表达，分组为siNC组（阴性对照转染细胞）、siASFlB#l组、siASFlB#2组及siASFlB#3组，后采用CCK-8、平板单克隆实验、Transwell小室迁移实验检测各组细胞的增殖、转移能力。分析基因表达综合数据库的数据集GSE27411中幽门螺杆菌阳性和阴性的胃癌组织中ASFlB的表达水平，并通过RT-qPCR及蛋白质印迹法检测ASFlB在幽门螺杆菌感染前后的胃癌细胞系ACS中的表达水平。结果相关数据库及我们的胃癌队列中的胃癌组织ASFlB的mRNA和蛋白表达水平均高于癌旁正常组织，且胃癌组织中高表达的ASFlB与胃癌患者不良预后相关。此外，与siNC组相比，敲低ASFlB组(siASFlB#l组、siASFlB#2组及siASFlB#3组）的细胞增殖和转移能力均减弱。最后，幽门螺杆菌阳性的胃癌组织及幽门螺杆菌感染后的人胃癌细胞ACS中的ASFlB表达水平均上调。结论ASFlB在幽门螺杆菌感染诱发的胃癌发生发展过程中可能起到重要的促进作用，且高表达的ASFlB与胃癌患者更早发生转移及较差的预后相关，可作为预测胃癌患者复发及预后的分子标志物。此外，敲低ASFIB可显著抑制ACS细胞的增殖和转移能力。【关键词】胃癌；抗沉默功能蛋白lB;幽门螺杆菌；细胞增殖；细胞转移Expression of anti-silencing functional protein 1B in human gastric cancer cells infected with Helicobacter pylori and its effect on proliferation and metastasis of AGS cell line Cai Yuzhi，伽Jian,Huang Yongye,Liu Dingyi,L加Haihua,Zhang Tong*Digestive Center,Guangzhou Panyu District Central Hospital,Guangzhou 511400,Guangdong,China*Corresponding author:Zhang Tong,E-m(1l,l: ObjectiveTo detect the expression level of histone chaperone anti-silencing functional protein lB(ASFlB)in gastric cancer(CC)tissues and its relationship with the prognosis of CC patients.To investigate the effects of ASFlB on the proliferation and metastasis ability of human CC cell line ACS and the possible molecular mechanism.To analyze the relationship between Helicobacter pylori and the expression of ASFlB.Method The expression level of ASFlB in various of tumor tissues and adjacent normal tissues in 基金项目：广州市科技计划项目(202102080538)通信作者：张彤，E-mail:-i;仑著消化肿瘤杂志电子版2024年3月第16卷第1期J Dig Oncol(Electronic Version).March 2024.Vol 16.No.I the cancer genome atlas database was analyzed,and then the mRNA expression level of ASFlB in 59 pairs of GC tissues and paired adjacent normal tissues of our cohort were measured via real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR).The relationship between the expression levels of A SFlB and the prognosis of GC patients in Kaplan-Meier plotter database was analyzed.Besides,the expression levels of ASFlB in GC tissue microarray were detected by immunohistochemistry,and then the relationship between ASFlB and clinical prognosis and clinicopathological parameters of GC patients was analyzed.Small interfering RNA(siRNA)technology was used to knockdown the expression of ASFlB in GC cell line AGS,and AGS cells were divided into siNC group(negative control transfected cells),siASFlB#l group,siASFlB#2 group and siASFlB#3 group.Then the proliferation and metastasis ability of different groups were detected by CCK-8,plate monoclonal assay and Transwell cell migration assay.The expression levels of ASFlB in GC tissues with positive and negative Hel比obacterpylori in gene expression omnibus database(GSE27411)were analyzed,and then the expression levels of ASFlB in GC cell line AGS before and after Hel兀obacterpylori infection were detected by RT-qPCR and western blot.Result The mRNA and protein expression levels of ASFlB in GC tissues of the database and our cohort were higher than those in adjacent normal tissues.Moreover,higher expression of ASFlB in GC tissues was correlated with the poorer prognosis of GC patients.Compared with siNC group,the ability of cell proliferation and metastasis were reduced in the ASFlB knockdown group(siASFlB#l group,siASFlB#2 group and siASFlB#3 group).Finally,the expression levels of ASFlB in Hel比obacterpylori-positive GC tissues and Helicobacter pylori-infected human GC cells AGS were up-regulated.Conclusion ASFlB may play an important role in the occurrence and development of GC induced by Hel比obacterpylori infection.Besides,high expression of ASFlB is associated with earlier metastasis and poorer prognosis of GC patients,which can be used as a molecular marker to predict recurrence and prognosis of GC patients.In addition,knocking down ASFlB significantly inhibited the proliferation and metastasis ability of AGS cell.Gastric cancer;Anti-silencing functional protein lB;Helicobacter pylori;Cell proliferation;Cell metastasis 59 胃癌(gastriccancer,GC)是全世界范围内发病率和死亡率最高的消化道恶性肿瘤。根据世界卫生组织发布的世界癌症报告显示，2020年我国新增胃癌病例47.9万，死亡人数37.4万，分别占全球胃癌新发和死亡病例的44和48.6%l一气胃癌起病隐匿，早期症状少，患者就诊时多巳是晚期，临床治疗也常因复发、转移而失败。因此，提高早期胃癌的检出率，改善胃癌患者临床治疗效果，进而使得胃癌患者的生存时间延长，巳成为胃癌患者治疗的目标。而相关问题的解决不仅有赖千整体医疗体系的完善以及治疗手段的提高，更有赖千对胃癌发生及恶性进展机制的充分认知以及挖掘有效的干预靶点和用千早期诊断的相关检测指标3。抗沉默功能蛋白1(anti-silencing functional protein 1,ASFl)最早是科学家在真核生物酵母中发现的，其属千组蛋白相关蛋白的伴侣蛋白，具有调节染色质的功能，并已被证明与多种肿瘤的发生发展密切相关4气哺乳动物中有2种ASFl亚型，分别是组蛋白伴侣ASFlA和组蛋白伴侣ASFlB。ASFlB是一种重要的组蛋白伴侣蛋白，最早在芽殖酵母中被检测出来，进一步研究显示其具有转录调节作用，并调控多种基因的表达，其主要功能是参与细胞增殖6-8。近年来，研究表明ASFIB与多种肿瘤的发生发展密切相关，例如，过表达ASFIB与乳腺癌预后密切相关，而ASFIB敲除后则会显著抑制乳腺癌细胞的增殖能力9。而Liu等10的研究发现ASFlB通过稳定周期依赖性激酶9(cyclin-dependent kinases 9,CDK9)蛋白表达来促进宫颈癌的恶性进展，初步揭示了ASFIB的促癌机制。此外，ASFIB在肝癌、前列腺癌及胰腺癌中的作用也逐渐被揭示11-13。然而，目前ASFIB在胃癌中的表达及预后价值仍不清楚。因此，本研究拟探讨ASFIB对人胃癌细胞增殖与转移能力的影响及其可能的机制，并探讨ASFIB表达水平在人胃癌细胞系感染幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)后的变化情况，初步探讨ASFIB在Hp感染引起的胃癌中所发挥的作用，并探讨其与胃癌患者预后之间的关系，进而为其作为胃癌的早60 消化肿瘤杂志电子版2024年3月第16卷第1期J Dig Oncol(Electronic Version).March 2024.Vol 16.No.I 期诊断、预防以及治疗的分子靶标提供一定的理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本胃癌组织芯片样本来自本院2013年1月至2017年12月接受胃癌切除手术并经病理证实为胃癌的患者94例，其中男51例，女43例，年龄3579岁，平均年龄(61.3土5.6)岁。用千实时荧光定量聚合酶链反应(realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)的新鲜胃癌组织及配对的癌旁正常组织取自本院2020年1月至2021年12月行根洽性胃癌切除术的胃癌患者59例，样本共59对，以距离胃癌组织25cm以外的为癌旁正常组织。所有患者均取得书面知情同意，并通过广州市番禺区中心医院伦理委员会批准（审批号：PYRC-2023-331)。AGS人胃癌细胞系购买自上海细胞基囚库。1.1.2 试剂及耗材DMEM-F12培养基、胎牛血清(fetalbovine serum,FBS)及1的双抗（青链霉素混合液）购自美国Gibco公司；SYBRGreen I试剂购自中国长沙AG公司；RNATRlzol、结晶紫购自日本TaKaRa公司；辣根过氧化物酶购自美国Millipore公司；小鼠抗人GAPDH单克隆抗体、兔抗人ASFIB单克隆抗体购自中国Abeam公司；ECL蛋白印迹底物购自美国Thermo公司；CCK-8购自中国Boster公司。1.2 方法1.2.1 生物信息学分析使用分析工具TIMER2.0(http:/timer.cistrome.org/)分析癌症基因组图谱(thecancer genome atlas,TCGA)数据库中的ASFIB在泛瘤种的肿瘤组织和癌旁正常组织中的表达悄况。使用分析工具GEPIA2(http:/gepia2.cancer- plotter 数据库(http:/ omnibus,GEO)数据库中的GSE27411数据集进行分析来探讨Hp阳性和Hp阴性的胃癌组织中ASFIB的表达水平。1.2.2 细胞培养AGS细胞在含有10%FBS、1青链霉素混合液的DMEM-F12培养基中培养，并置千37C、5%CO2培养箱中，常规进行换液。1.2.3 细胞转染培养AGS细胞至对数生长期，使用0.25的胰酶消化细胞，按照一定的比例转移至6孔板中，待细胞达到一定的密度后，进行转染，具体步骤参照Lipofectamine3000转染试剂说明书，分别转染阴性对照和敲低ASFIB的小干扰RNA(smallinterfering RNA,siRNA)，阴性对照转染细胞标记为siNC组，敲低ASFlB3条不同序列的转染细胞分别标记为siASFlB#l组、siASFlB#2组及siASFlB#3组。1.2.4 RT-qPCR RNA提取试剂盒(Magen,中国）被用千从胃癌组织、正常胃黏膜组织及细胞中提取总RNA，并使用Nanodrop测最RNA浓度。此后，使用反转录酶（艾科瑞生物公司，中国）将所得到的RNA反转录为cDNA,反应条件为首先37C 15 min,接着85 C 5 s，最后4C 30 min。之后，使用荧光DNA结合染料（艾科瑞生物公司，中国）进行qPCR反应，具体步骤按照说明书进行。引物来自中国天一辉远公司。GADPH作为内参基因，引物序列为：正义链5-TGCCTTGGCTTAGAGAC-3；反义链5-CTGCTATTCCGAATTC-3。用千检测ASFIB表达量的引物序列为：正义链5-ACACTGGAGTG AAGAT-3；反义链5-GCTGGAGCTGGGAGAAAT-3。后续根据相应的反转录及qPCR试剂盒的说明书进行实验。计算2-MCt值为ASFIB的相对表达最。1.2.5 蛋白质印迹法蛋白裂解液被用于从胃癌组织和胃癌细胞中提取其蛋白质组分，其中蛋白裂解液按照1ml裂解缓冲液10l磷酸酶抑制剂10 l苯甲基磺酰氮(100mmol/L)+1 l蛋白酶抑制剂的比例配置。而后对所得到的待测蛋白样品进行BCA定最浓度测定后，按照实验设计向每个泳道对应加入20g 蛋白进行电泳，再转移至聚偏二氝乙烯膜上，进一步使用5牛血清白蛋白室温封闭2h,一抗4C 消化肿瘤杂志电子版2024年3月第16卷第1期J Dig Oncol(Electronic Version).March 2024.Vol 16.No.I 61 孵育过夜。使用TBST洗涤蛋白膜3次，每次lOmin,然后使用相对应的lgG二抗室温孵育1h,再用TEST洗涤蛋白膜3次后，使用相应的曝光显色液进行曝光显色处理。1.2.6 CCK-8试验在96孔板中接种1000个各组(siNC组、siASFlB#l组、siASFlB#2组及siASFlB#3组）处千对数生长期的AGS细胞，并且每组设置6个重复，而后每天测量1块96孔板，测量方法为向每个孔中加入使用无血清培养基稀释的CCK-8溶液，后置千培养箱中孵育24h，最后使用酶标仪测定96孔板各孔的光密度(opticaldensity,OD)值，根据OD值作图即为细胞的生长曲线。1.2.7 单克隆试验将各组(siNC组、siASFlB#l组、siASFlB#2组及siASFlB#3组）处千对数生长期的AGS细胞分别接种千6孔板中，密度为500个孔。每隔3天对6孔板中的培养基进行更换。2周后，使用4多聚甲醒溶液固定各孔30min，而后使用1结晶紫染色15min,最后使用流水冲洗以去除结晶紫并拍照。1.2.8 Transwell细胞迁移和侵袭试验将各组(siNC组、siASFlB#l组、siASFlB#2组及siASFlB#3组）处于对数生长期的5xl04个AGS细胞重悬至300l无血清培养基中，并放詈千Transwell小室内，然后在24孔板内加入600l含有10%FBS的完全培养基。之后千一定的时间对Transwell小室进行固定染色处理，最后清洗去除多余的染料并使用倒置显微镜对不同视野进行拍照，并对各视野计数作图。1.2.9 Hp感染实验将AGS细胞按照一定的数鼠铺入6孔板中。24 h后，待细胞贴壁后，对1个孔中的细胞进行计数。此外，在OD=600nm测盘Hp菌液的OD值，并按照OD600=1时所对应的Hp菌液浓度为lx109 CFU/ml的标准计算Hp的CFU数，后按照细胞数目及Hp的CFU进行一定的感染复数(multiplicityof infection,M OI)值感染，并对不同感染比例的AGS细胞进行分组：空白组、Hp(l:20)组、Hp(l:50)组、Hp(1:100)组和Hp(1:200)组。感染24h后，对各组AGS细胞提取RNA及蛋白进行相应的检测。1.2.10 免疫组织化学将所收集的胃癌组织固定千甲階溶液内，使用石蜡进行包埋并将包埋后的标本切成3m厚的切片用千后续胃癌芯片组织中ASFIB的表达量检测。免疫组织化学染色采用Envision法：石蜡包埋的切片用二甲苯脱蜡，并在0.01mol/L乙二胺四乙酸缓冲液中使用高压灭菌器进行抗原修复。然后，切片使用3.0过氧化氢孵育20min并在室温下使用2山羊血清封闭30min。之后，切片在相应的一抗中4C下孵育过夜。第2天室温复温1h，再使用辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育30min。最后使用二氨基联苯胺溶液显色并拍照。使用以下规则对切片进行评分：按04分对阳性染色细胞的百分比进行评分(0分，无阳性细胞；1分，阳性细胞10%;2分，阳性细胞10%50%;3分，阳性细胞51%-80%;4分，阳性细胞80%），按03分对染色强度进行评分(0分，不染色，1分，弱染色；2分，中度染色；3分，强染色），最终的免疫组织化学评分为2个分数的乘积（范匮012分）。1.3 统计学方法应用GraphPadPrism 8.0统计软件进行数据统计分析和作图，正态分布的计最资料以均数叶示准差（反士s)表示，肿瘤组织与癌旁正常组织间的表达差异采用配对t检验进行比较；计数资料采用频数或率或百分比（）表示，采用卡方检验进行组间比校。生存分析采用Kaplan-Meier法以及Log-rank检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 胃癌组织和胃癌细胞系中的ASFlB表达量明显升高为探究ASFIB与胃癌恶性进展的关系，我们首先利用TIMER2.0分析了TCGA数据库中的ASFIB在泛癌中的肿瘤组织和癌旁正常组织中的表达水平悄况，结果显示ASFIB在21种肿瘤中的表达均上调（图1)。此外，通过使用GEPIA2对TCGA数据库中的34例癌旁正常组织和415例人胃癌组织的ASFIB基因表达进行分析，我们发现ASFIB在癌旁正常组织中的表达水平低千其在胃癌组织中的表达(PO.Ol，图2A)。进一步对数据库的数据进行分析，我们发现ASFIB的表达水平与胃癌恶性进展之间密切相关，胃癌分级越高ASFIB的表达水平也越高（图2B)。此外，我们的临床队列也显示癌旁正常组织中的ASFIB的62 消化肿瘤杂志（电子版）2024年3月第16卷第1期J Dig Oncol(Electronie Version),March 2024,Vol 16,No.l 10 8 64+Wd匕N60一。了！，；4织组常织正组旁瘤癌肿.T,T,1,;-T,_,.咖了，五，门，i，上了,，,，上T,，I,，,上血瞩上T,，让；T，,，嘈廿2上T,，上，幽.了，：，上Ti,了,，I,，上了，了，l，,I,，T阜T,;.r，血啊T,，,，,上T，一T，,J，上T,.,，上T,1,:-T,:,-T，,，今了咖瞩,上了,;，,上r,:,-T,1,-了,，1,，,4了,，_;T,.，,上了，.BLCA BRCA CESC CHOL COAD ESCA GBM HNSC K忙HKIRC T,1,;,.EC 了,iuc了,！iADT,_,isT TT,T,，iA c H T M c k s c R A s D REA PG PC D PRA D AA p SC u L D A u L c H u p R Kl 图1癌症基因组图谱数据库中多种肿瘤组织及癌旁正常组织中ASFlB的表达水平注：BLCA，膀胱尿路上皮癌；BRCA，乳腺浸润癌；CESC，宫颈鳞癌和腺癌；CHOL，胆管癌；COAD，结肠癌；ESCA，食管癌；GBM，多形成性胶质细胞瘤；HNSC，头颈癌；KICH，肾嫌色细胞癌；KIRC，肾透明细胞癌；KIRP，肾乳头状细胞癌；LIHC，肝癌；LUAD，肺腺癌；LUSC，肺鳞状细胞癌；PAAD，胰腺癌；PRAD，前列腺癌；PCPG，嗜铭细胞瘤和副神经节瘤；READ，直肠癌；SARC，肉瘤；SKCM，皮肤黑色素瘤；THCA，甲状腺癌；THYM，胸腺瘤；STAD，胃癌；UCEC，子宫内膜样癌；TPM，每100万个转录本的数址。A 10 B 100 80 丁千誕望60 40千-户 i 20,己已，,I 一。=.L胃癌组织癌旁正常组织I组II组皿组(n=415)(n=34)(n=12)(n=148)(n=246)图2癌旁正常组织及胃癌组织中的ASFIB基因的表达情况注：A，癌症基因组图谱数据库中ASFlB基因在胃癌组织和癌旁正常组织中的表达情况；B,癌症基因组图谱数据库中ASFlB基因表达水平与胃癌分级之间的关系，蓝色代表癌旁正常组织，橙色代表胃癌分级I级，绿色代表胃癌分级11级，棕色代表胃癌分级皿级；C,59例配对的癌旁正常组织和胃癌组织中ASFlB基因的表达水平。P0.001。80604020 誕奴祁gMSViii丁。癌旁正常组织(n=34)c 40 302010 誕讼宝gIJSV。*I I 癌旁正常组织胃癌组织mRNA水平低千配对的胃癌组织中的表达水平，两者之间的差异有统计学意义(n=59,P=0.0001,图2C)。最后通过RT-qPCR，我们发现与正常的胃黏膜上皮细胞(gastricmucosal epithelial cells,GES)-1相比，各胃癌细胞中ASFIB的表达水平明显升高（图3)。2.2 高表达ASFlB的胃癌患者表现为更短的生存期为了进一步证实ASFIB可以作为预测胃癌患者预后的临床分子标志物，我们对KaplanMeier plotter数据库的数据进行分析，结果显示高表达ASFIB的胃癌患者表现为更差的预后（图4A)。进一步对胃癌组织芯片进行分析，将免疫组织化学评分6分记为ASFIB低表达(38例），6分记为ASFIB高表达(56例），我们发现ASFIB高表达组与低表达组在肿瘤大小以及肿瘤是否发生淋巴结转移方面的差异具有统计学意义(P0.05)（表1)。此外，胃癌组织芯片的预后分析也显示高表达ASFIB的胃癌患者其预后差千低表达ASFIB的胃癌患者，两者之间的差异具有统计学意义(n=94,P0.001,图4B)。2.3 ASFlB促进胃癌细胞株AGS增殖活性为了探究ASFIB对胃癌细胞AGS增殖能力的影响，我们通过使用siRNA技术敲低了其ASFIB的表达，并通过RT-qPCR进行了效率的验证（图5A)。进一步使用用千细胞增殖能力测定的实验技术(CCK-8试验和单克隆实验）检测敲低ASFIB后胃癌细胞株AGS的增殖能力变化情况消化肿瘤杂志（电子版）2024年3月第16卷第1期J Dig Oncol(Electronie Version),March 2024,Vol 16,No.l 63 25 0505 211 斗妥奴恣gIJSV0.心谷令。翁。七今，志。，v 心00 图3ASFIB在各胃癌细胞中的表达情况邕GES-1为正常胃黏膜上皮细胞，其余均为胃癌细胞。P0.05,P0.01,P0.001。不同ASFlB表达患者临床病理特征比较（例）低表达组高表达组(n=38)(n=56)表1参数例数K值A 1.0 ASFIB(218115at HR=1.79(1.48 2.17)Log-rank P=8.8e-10 0.8 64 00 怖忙蚚劝、0.2,ASFIB表达量 低表达 高表达。风险暴露人数（例）低表达293高表达582100 50 100 总生存时间（月）20 28 140 158 150 B 80 一ASFIB高表达组一ASFIB低表达组Log-rank P0.001(o0)趾i射松、60 40 P值20 年龄60岁60岁性别男女病理类型腺癌其他肿瘤大小5 cm 5 cm 远处转移否是淋巴转移否是44 50 51 43 81 13 44 50 69 25 18 20 21 17 32 6 24 14 29 9 26 30 30 26 49 7 20 36 40 16 0.008 0.026 0.206 6.848 0.277 7.487 0.9286 0.8716 0.6503 30 60 90 生存时间（月）图4ASFlB与胄癌患者更差的预后相关注：A,Kaplan-Meier plotter数据库中数据显示高表达ASFlB的胃癌患者其预后更差；B，胃癌组织芯片中不同表达ASFlB的胃癌患者与预后之间的关系。120 0.0089 0.5987 0.0062 34 60 20 18 14 42 2.4（图5B和5C)。结果表明，与阴性对照细胞siNC组相比，转染siRNA-ASFlB质粒的AGS细胞的增殖能力明显降低，提示过表达ASFIB可能会增强人胃癌细胞系AGS的增殖能力。ASFlB促进胃癌细胞株AGS的转移能力为了验证过表达ASFIB将促进胃癌细胞AGS转移，我们进行了Transwell迁移和侵袭试验。我们发现相对千阴性对照细胞siNC组，AGS细胞在敲低ASFIB后，其迁移和侵袭能力均有明显下降，即穿过小室的细胞数目明显减少，表明ASFIB的表达上调可能会促进胃癌细胞的转移能力（图6)。此外，TCGA数据库显示胃癌组织中ASFIB的表达水平与上皮钙黏索(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)及基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)等基因的表达水平之间存在相应的关系，这也提示ASFlB可能是通过改变肿瘤细胞的形态，即调节肿瘤细胞的EMT转化来调控胃癌细胞的转移。Hp感染前后AGS细胞中ASFlB的表达为了探索ASFlB在Hp诱导的胃癌中的作用，我们首先对基因表达综合(geneexpression omnibus,GEO)数据库中的GSE27411数据集进行分析，结果显示Hp感染与胃癌组织中ASFIB的表达水平2.5 64 消化肿瘤杂志电子版2024年3月第16卷第1期J Dig Oncol(Electronic Version).March 2024.Vol 16.No.I 密切相关（图7A)。因此，我们推测ASFIB在Hp诱导的胃癌发生中起到至关重要的作用。通过使用Hp以不同的MOI值感染胃癌细胞AGS，我们发现Hp感染的AGS细胞中，ASFIBmRNA及蛋白表达水平均明显上调，并呈现出MOI浓度的依赖性（图7B和7C)。3 讨论胃癌患者就诊时已经处千晚期阶段是造成胃癌预后差的重要原因之一14。尽管近年来早期胃癌筛查技术得到了推广，胃镜也更加普及，但胃癌早期诊断率仍很低，这使得寻找胃癌早期诊断的A B C 2勹3-,-siNC组|1 siASF1B#1组飞 鄱1 目.siASF18#2组.siASF18#3组 2 I:_/勺芝 己、-/芦1勺*0 I.,.I I.,.I I I 采今令令4$夕令4$,$令4忒令各。第1天第2天第3天第4天第5天siNC组siASFIB#2组siASFJB#l组siASFIB#3组图5敲低ASFIB对人胃癌细胞系AGS细胞增殖能力的影响注：A,siRNA敲低AGS细胞ASFlB表达的效率验证；B,CCK-8试验用千检测敲低ASFIB对AGS细胞增殖能力的影响；C，单克隆实验用于检测敲低ASFlB对AGS细胞增殖能力的影响，图片为4多聚甲醒固定30min后再使用1结晶紫染色15min的平板照片（无放大）。“P0.01,P0.001。A siNC组siASFIB#I组siASFIB#2组siASFIB#3组B 淰屯郤恋250200150100500 栥令垂恙茎宦军举逆弓迦-迁移图6敲低ASFlB对人胃癌细胞系AGS转移能力的影响注：A,4多聚甲醒固定30min后再使用1结晶紫染色15min拍照(x40);B，图片的定量结果，P吟令t,帝令求帝701 未感染Hp感染，Hp 图7Hp感染促进胃癌组织及胃癌细胞ASFlB的表达注：A,GEO数据库(GSE27411)显示Hp感染促进胃癌组织ASFlB的表达；B,RT-qPCR检测Hp感染前后的AGS细胞中ASFlB的表达；C，蛋白质印迹法检测Hp感染前后的AGS细胞中ASFlB的表达。P0.05,PO.Ol,P0.001。消化肿瘤杂志电子版2024年3月第16卷第1期J Dig Oncol(Electronic Version).March 2024.Vol 16.No.I 65 分子标志物尤为重要15-1气胃癌的发生除了与亚硝酸盐和咸食等饮食因素存在密切的关联之外，Hp在诱发胃癌中也起到重要的作用，这使得其已被WHO列为胃癌的一级致癌物17。目前，大鼠研究表明，ASFlB在多种肿瘤中的表达水平明显上调，高表达的ASFlB与患者的预后差之间存在明显的相关性18-20。为探究ASFlB在胃癌发生发展中的作用及机制，我们首先对相关数据库中的数据进行分析，结果显示胃癌组织中ASFlB的表达明显升高。我们也使用临床样本并借助RT-qPCR技术进一步验证了数据库中的结论。此外，高表达ASFlB的胃癌患者的临床预后较差，且肿瘤直径较大和出现淋巴结转移的比例较多。最后，通过使用siRNA技术敲低AGS细胞中的ASFlB表达，我们发现敲低ASFlB的细胞显现出更差的细胞增殖活性和更低的转移能力。更为重要的是，我们发现Hp感染将显著上调胃癌组织及胃癌细胞中ASFlB的表达。这些数据均提示ASFlB与胃癌的发生发展之间存在千丝万缕的关系，其在胃癌中的作用使其有望成为预测胃癌患者复发及预后的分子标志物。ASFlB是一种重要的组蛋白伴侣蛋白，在人体中广泛分布。近年来的研究发现ASFlB与多种肿瘤的发生密切相关，并可通过多种方式促进肿瘤细胞的增殖。有研究指出ASFlB能够直接上调与DNA复制相关的基因的表达，进而弥补复制缺陷；然而，低表达ASFlB的细胞表现为细胞核数量减少及微核和核间的DNA桥的数量增加21。这项研究还表明ASFlB在有丝分裂过程中可能起到重要的作用，而肿瘤的增殖与其有丝分裂的速度又密切相关。此外，ASFlB还与微卫星的不稳定性、免疫微环境的细胞浸润以及DNA甲基化之间存在密切的联系22。这也提示我们ASFlB可以通过悯节免疫微环境中的免疫细胞的趋化及功能进而形成免疫逃逸的微环境，最终促进胃癌的恶性进展。在本项研究中，我们首先对相关数据库的信息进行分析，并进一步运用我们的临床队列进行验证，但临床样本数量仍较少。此外，我们还进行了细胞功能实验，结果显示敲低ASFlB可以抑制胃癌细胞的增殖和转移能力。然而，对千ASFlB是否能成为胃癌早期诊断及精准诊疗的分子标志物，我们仍需要更多的临床样本，以进一步证实其在胃癌组织中显著高表达，并与胃癌患者临床预后及是否发生淋巴结转移存在相关性。此外，ASFlB对胃癌细胞恶性生物学行为的影响，我们也需要通过体内实验进一步证实，对千其促进胃癌发生发展的分子机制也需要通过相应的实验去探索。参考文献 1 SMYTH EC,NILSSON M,GRABSCH HI,et al.Gastric cancerJ.Lancet,2020,396(10251):635-648.2 SUNG H,FERLAY J,SIEGEL RL,et al.Global Cancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries J.CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-249.3 杨欢，彭建军胃癌免疫治疗研究进展J/CD消化肿瘤杂志（电子版），2022,14(3):268-278.4 DAS C,ROY S,NAMJOSHI S,et al.Binding of the histone chaperone ASFl to the CBP bromodomain promotes histone acetylationJ.Proc Natl Acad Sci US A,2014,111(12):E1072-1081.5 EMMETT