根际溶磷伯克霍尔德菌Par...pp.对马尾松苗的促生作用_徐红云.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):274-285收稿日期：2022-10-08基金项目：国家自然科学基金项目（32160375），贵州省科技计划项目（黔科合基础2022一般 210）作者简介：徐红云，女，博士，讲师，研究方向：资源微生物、林木抗逆育种；E-mail:通讯作者：于存，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：林业资源微生物开发与利用；E-mail:根际溶磷伯克霍尔德菌 Paraburkholderia spp.对马尾松苗的促生作用徐红云1 吕俊2 于存2（1.贵州民族大学生态环境工程学院，贵阳 550025；2.贵州大学林学院，贵阳 550025）摘 要：为筛选溶磷效果较好的根际细菌（phosphate-solubilizing rhizobacteria,PSB），并明确其对马尾松苗的促生效果和作用机制。利用土壤稀释平板法进行 PSB 菌株的分离和纯化，通过形态学和 16S rDNA 分子测序等方法进行 PSB 菌株的鉴定，最后将PSB 菌株接种至马尾松苗，培养 60 d 后测定马尾松苗生长、生理、苗根际土壤理化性质和根际细菌群落结构和组成。结果表明：由马尾松根际土中分离获得溶磷能力较强的 3 个 PSB 菌株 WJ10、WJ25 和 WJ41 均为伯克霍尔德菌 Paraburkholderia spp.；3 个 PSB菌株对磷酸铝的增溶能力最强，其次是磷酸三钙、磷酸氢钙和磷酸铁；盆栽试验表明，3 个 PSB 菌株均可促进幼苗的生长，其中WJ25 对苗高、根长的促进效果最明显，WJ41 和 WJ10 次之。3 个 PSB 菌株对苗促生的主要机制包括，PSB 提高了马尾松苗的根系活力、叶绿素 b、可溶性蛋白等生长指标及氮、磷和钾等养分含量；同时，提升了根际土有效磷、速效钾、活性氮、土壤养分含量、土壤酶活性；此外，3 个 PSB 菌株的添加还影响了马尾松苗根际细菌群落的组成和多样性，促进了 Bacillus、Nitrosospira、Gemmata和 Cytophaga 等有益菌在根际土壤中的显著富集。综上，本研究筛选获得的 3 个溶磷伯克霍尔德菌，它们能够通过调控植物生理及改变根际微环境从而促进马尾松苗的生长。通过本研究，为马尾松根际溶磷细菌菌肥的开发和应用提供了理论依据。关键词：根际溶磷细菌；促生；伯克霍尔德菌；马尾松；根际微生物DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1226Growth Promoting of Pinus massoniana Seedlings Regulated by Rhizosphere Phosphate-solubilizing Paraburkholderia spp.XU Hong-Yun1 LV Jun2 YU Cun2（1.College of Eco-Environment Engineering,Guizhou Minzu University,Guiyang 550025;2.College of Forestry,Guizhou University,Guiyang 550025）Abstract:It is aimed to screen phosphate-solubilizing rhizobacteria（PSB）and to clarify its growth-promoting effect on Pinus massoniana seedlings and the mechanism.The soil-dilution plate method was used to isolate and purify the PSB strains.The PSB strains were identified by morphology and 16s rDNA sequencing methods.Finally,the masson pine seedlings were inoculated with PSB strains for 60 d,then the seedling growth and physiological indexes,soil physical and chemical properties,and rhizosphere bacterial community were determined.The results showed that three PSB strains（WJ10,WJ25 and WJ41）with strong phosphate-solubilizing abilities were isolated from the P.massoniana rhizosphere soil and belonged to Paraburkholderia spp.The three PSB strains had the strongest phosphate-solubilizing abilities to aluminum phosphate,followed by tricalcium phosphate,calcium monophosphate and ferric phosphate.Based on the pot experiment,the three PSB strains effectively promoted seedlings growth,with the best effects on the seedling height and root length promotion for WJ25,followed by WJ41 and WJ10.The main mechanisms of seedling promotion of the three PSB strains include:1）The PSB strains increased the root activity,chlorophyll b,soluble protein,nitrogen,phosphorus and potassium contents in masson pine seedlings;2）meanwhile,PSBs enhanced 2023,39(6)275徐红云等：根际溶磷伯克霍尔德菌 Paraburkholderia spp.对马尾松苗的促生作用磷是植物生长发育过程中的基本营养素，尤其是在幼苗生长的早期阶段1。尽管土壤中含有足够的磷，但植物只能获得极少量的磷，因为大多数土壤磷通过与钙（Ca2+）、铝（Al3+）和铁（Fe3+）等金属离子结合而转化为难溶的形式2-4。在中国，约有 95%土壤中的磷是难降解的磷形态，这大大限制了植物的健康发展5。克服这个问题的通常做法是使用化学磷肥。然而，频繁地投入化肥，投入成本增高的同时，也会恶化土壤健康，例如土壤压实、侵蚀、退化、生物多样性丧失和土壤微生物活性下降6。此外，由于磷肥是一种不可再生资源，如何有效减少目前磷肥的浪费，回收土壤中的磷资源也非常重要。溶磷细菌（PSB）可以通过酸化、螯合、交换反应和产生有机酸等将不溶性磷酸盐转化为植物可用磷的形式7-8。此外，它们还可以促进植物有益微生物群落的生长，提高土壤微生物活性9。使用 PSB 提高土壤磷可用性不仅可以减少化学肥料的用量，而且还可以减少因过量施用磷肥而造成的环境污染10。迄今为止，已经报道了许多 PSB 菌株，包括重要的属：气球菌属 Aerococcus、农杆菌属Agrobacterium、节杆菌属 Arthrobacter、芽孢杆菌属Bacillus、Delftia 属、肠杆菌属 Enterobacter、欧文氏菌属 Erwinia、黄杆菌属 Flavobacterium、克雷伯菌属 Klebsiella、微球菌属 Micrococcus、伯克霍尔德菌属 Paraburkholderia、假单胞菌属 Pseudomonas、根瘤菌属 Rhizobium 和黄杆菌属 Xanthobacter 等4-5,11。然而，大多数 PSB 都是由农作物的根际分离出来的，相比之下，由木本植物的根际土壤中分离 PSB 和应用的报告较少5。马尾松（Pinus massoniana Lamb.）是中国南方造林的重要用材树种之一12-13。仅以贵州省为例，该省的马尾松栽植面积占全省 287 万 hm2松林面积的 1/4-1/3。贵州是典型喀斯特地区，该省的土壤缺磷是一直以来阻碍马尾松人工林健康生长的重要因素14。虽然以往有较多报道利用菌根菌改良土壤磷进而促进马尾松生长的报道，但大部分菌根菌存在生长缓慢和易受环境因素影响的特点15。因此，在自然界中挖掘生长速度快且受环境因素干扰小的PSB 菌株，对解决磷限制马尾松生长发育具有重要意义。本研究在贵州省的健康马尾松根际土壤中分离和筛选高效 PSB 菌株；评价 PSB 对不同难溶性磷酸盐的溶磷能力；测试 PSB 菌株对马尾松苗生长、生理、土壤理化性质、根际微生物群落变化的影响，进而初步揭示 PSB 菌株对马尾松苗促生的作用机制。通过本研究为马尾松根际溶磷微生物肥料的开发和应用提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 供试土壤样品 土壤样品采集于贵州省贵阳市 20 年生的健康马尾松的根际，采集马尾松根系（直径小于 0.5 cm）后，轻轻摇动去除根上松散黏附的土壤，将根 4 mm 内紧密黏附的土壤（视为根际土壤）置于无菌塑料袋中，用于分离 PSB 菌株。1.1.2 供试种子 试验所用马尾松种子购买自贵州省都匀市马尾松林木良种基地。1.1.3 培养基 Pikovskaya（PVK）培养基：C6H12O6，10 g；Ca3(PO4)2，10 g，NaCl，0.3 g；KCl，0.3 g；MgSO47H2O，0.03 g；(NH4)2SO4，0.5 g；Mn-SO44H2O，0.03 g；FeSO47H2O，2.03 g；琼脂，20 g；蒸馏水，1 000 mL；pH 值，7.0；LB 琼脂培养基：胰蛋白酶，10 g；酵母提取物，5 g；NaCl，10 g，琼脂，20 g；蒸馏水，1 000 mL；pH 为 7.0。4 种不同磷源培养基：以 Ca3(PO4)2作为磷源的PVK 液体培养基；将 PVK 液体培养基中的 Ca3(PO4)2分别替换为 11.03 g/L 的 CaHPO42H2O、12.03 g/Lthe contents of available phosphorus,available potassium,active nitrogen,soil urease and phosphatase in rhizosphere soil;3）in addition,the addition of three PSB strains also affected the composition and diversity of the rhizosphere bacterial community,and promoted the significant enrichment of beneficial bacteria such as Bacillus,Nitrosospira,Gemmata and Cytophaga in the rhizosphere soil.In conclusion,the three Paraburkholderia spp.strains could promote masson pine seedlings growth by regulating plant physiology and changing rhizosphere micro-environment.This study provides a theoretical basis for the development and application of rhizosphere PSB fertilizer of P.massoniana.Keywords:phosphate-solubilizing bacteria;growth promotion;Paraburkholderia spp.;Pinus massoniana;rhizosphere microbiome生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6276的 FePO47H2O 和 7.90 g/L 的 AlPO4分别作为另外 3种不同磷源的培养基。1.2 方法1.2.1 马尾松根际溶磷细菌的分离和纯化 1.2.1.1 根际溶磷细菌的分离 将 10 g 供试土壤加入到装有 10 mL 无菌水的 50 mL 三角瓶中，在 120 r/min 的摇床上振荡 20 min 后，静置 10 min 得到 0.1 g/mL 的土壤稀释液，之后对此稀释液依次进行稀释，得到 10-2、10-3、10-4、10-5 g/mL 的土壤稀释液。然后分别将 10-3、10-4、10-5 g/mL 的稀释液涂布于 PVK培养基上，分离和纯化 PVK 培养基上产生明显透明圈（溶磷圈）的菌株作为高溶磷菌株的筛选。1.2.1.2 溶磷菌株溶磷能力的测定 将分离纯化的菌株分别接种至 PVK 固体培养基，通过测定透明圈直径（D）和菌落直径（d）计算溶磷指数（P solubilization index,PSI）；将分离纯化的菌株接种于含有 100 mL PVK 液体培养基的 250 mL 三角瓶中，在转速为120 r/min、30培养5 d后，4下8 000 r/min离心 10 min，收集上清液。使用抗坏血酸法测量失活菌株接种培养后可溶性 P 含量（AP0）和活性菌株接种培养后可溶性 P 含量（AP1），并计算溶磷率（PSR）。PSI 和 PSR 的计算方法如下：PSI=D/dPSR（%）=（AP1-AP0）/AP0100%1.2.2 根际溶磷细菌的鉴定 1.2.2.1 菌株形态学鉴定 参考常见细菌系统鉴定手册16进行菌株形态学的观察和生理生化的测定。并参考 Shen 等17方法对菌株进行电镜扫描 观察。1.2.2.2 16S rDNA 基因的分子鉴定 使用 XPure 土壤 DNA 提取试剂盒（中国成都兴白鸡生物技术有限公司）提取 PSB 菌株的总 DNA，采用细菌 16S rDNA通用引物27F（5-AGATTTGATCTGGCTCAG-3）和 1492R（5-GGTTACTTGTTACGATT-3）进行 16S rDNA 序列扩增18。PCR 产物纯化后送往中国成都新百济生物科技有限公司进行测序。将所得序列与GenBank 中的序列进行比较，使用 MEGA（v.7.0）软件通过 Neighbor Joining（NJ）方法构建系统发育树，鉴定完成后将分子序列提交至 GenBank，获取登录号。1.2.3 根际溶磷细菌对 4 种难溶性磷源的溶磷能力及 pH 变化 根据 1.2.1 中描述的方法，将溶磷效果较好的 3 个溶磷菌株（108 CFU/mL）分别接种于含有 4 种不同磷源的培养基中，并在 30、120 r/min上孵育 168 h。期间，每 24 h 吸取 1 mL 培养液，用于 P 溶解量（PSC）和 pH 值的测定，PSC（mg/L）=（AP1-AP0）。1.2.4 根际溶磷细菌对马尾松苗生长、生理及土壤理化性质的影响 试验处理：马尾松种子在 0.4%高锰酸钾溶液中浸泡 30 min 后，用无菌水洗涤 5 次后，然后平铺于无菌蛭石上，在室温下放置两周后，选择生长一致的马尾松幼苗，移植到装有灭菌土壤（马尾松林下土经 121高温高压灭菌 2 h）的塑料盆中，每盆栽植 3 棵幼苗。之后用 LB 液体培养基 10 mL细菌悬液（108 CFU/mL）接种到栽有马尾松苗的穴盆中。以相同体积灭活的细菌悬液作为对照。每个处理有 36 个穴盆。样品收集：以上处理幼苗在培养 60 d 后，将 12个穴盆的苗作为 1 个生物学重复进行生长指标的测定。同时收集新鲜的苗，迅速用液氮冷冻后于-80冰箱保存用于苗生理指标和植株养分含量的测定。收集不同处理苗根周围的土壤（2 mm 范围内），用于土壤理化性质、土壤酶活和根际细菌群落的测定。指标测定方法：幼苗高度、主根长度用卷尺测量，用电子天平测定鲜重。按照 Li 等8描述的程序测定干重。根系活力根据 Yin 等19的方法测定。根据 Zhang 等20的方法测定可溶性糖含量和叶绿素含量。根据 Chu 等21的方法，使用考马斯亮蓝G250 测定可溶性蛋白质含量。用 5 mL 浓 H2SO4和H2O2消化细磨的幼苗样品后，分析植物的总 N、总P 和总 K 含量22。根据标准方法23确定土壤化学性质，包括全氮、全磷、全钾、水解氮、有效磷和速效钾。3 种土壤酶（脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶）的活性按照 Lemanowicz 等24提出的方法测定。参考 Yu 等12的方法进行马尾松苗根际细菌群落的高通量测序和数据分析。使用 EZNA 土壤 DNA 试剂盒（Omega Bio-Tek），提取土壤总 DNA。使用通用引 物 341F（5-CCCTACACGACGCTTCCGATCTG-3）和 805R（5-GACTGGAGTCCTTGGCCACCG ATTC-2023,39(6)277徐红云等：根际溶磷伯克霍尔德菌 Paraburkholderia spp.对马尾松苗的促生作用3）扩增细菌 16S rRNA 基因的 V3-V4 高变区。使用Illumina MiSeq 测序系统（美国加利福尼亚州圣地亚哥 Illuminia）进行序列的末端测序。使用 FLASH、QIIME、Mothur、UPARSE 等软件进行序列合并、质量控制、OTU 注释等。最后参考 Tuomisto25方法统计根际细菌的群落组成和多样性。1.2.5 统计分析 以上每个独立实验至少重复 3次。使用 Microsoft Excel 2016（Microsoft，Redmond，WA）和 SPSS 21（IBM，New York，NY）对 P 溶解和马尾松生长实验的数据进行整理和分析。采用最小显著性差异（LSD）检验以 0.05 的概率水平比较不同处理的平均值。2 结果2.1 马尾松根际溶磷菌的分离与纯化通过在 PVK 培养基上进行溶磷菌株的筛选，获得 3 株 溶 磷 率 较 高 的 PSB（phosphorus solubilizing bacteria）菌株。3 个菌株在 PVK 上培养 5 d 后的溶磷圈较明显（图 1），其溶磷指数（PSI）分别为WJ10（PSI=3.8）、WJ25（PSI=3.9）和 WJ41（PSI=4.1）。在液体 PVK 培养基中的溶磷率（PSR）分别为 WJ10（PSR=17.31%）、WJ25（PSR=15.55%）和 WJ41（PSR=15.49%）。ABCA:WJ10;B:WJ25;C:WJ41图 1 溶磷菌株在 PVK 培养基上产生的溶磷圈Fig.1 Phosphate solubilization zones on PVK agar plates2.2 马尾松根际溶磷细菌的鉴定在 LB 琼 脂 培 养 基 上，菌 株 WJ10、WJ25 和WJ41 的菌落分别为白色、卵黄色和乳白色。所有菌株均为革兰氏阴性。3 个菌株的淀粉分解试验、甲基红试验和 Voges-Proskauer 试验结果均为阴性。WJ25 和 WJ41 的过氧化氢酶检测结果为阳性，WJ10的结果为阴性；WJ10 是唯一能产生明胶酶分解明胶的菌株。在扫描电子显微镜下，菌株 WJ10、WJ25和 WJ41 的个体形态分别为长杆状（图 2-A）、杆状（图2-B）和短杆状（图 2-C）。2.5m2.5m2.5mABCA:WJ10;B:WJ25;C:WJ41图 2 溶磷菌株在电子显微镜下的形态结构Fig.2 Morphological structure of PSB strain under elec-tron microscope3个PSB菌株16S rDNA基因序列比对结果显示，菌 株 WJ25 和 WJ41 与 Paraburkholderia caffeinilytica NR_152088.1 的序列同源性最高（分别为 99.41%和99.26%），而 WJ10 与 P.stabilis NR_041719.1 的 同源性最高，为 99.85%。基于 NJ 方法构建的系统发育分析表明，菌株 WJ25 和 WJ41 与 P.caffeinilytica关系更密切，而菌株 WJ10 与 P.stabilis 关系更密切（图 3）。因此，PSB 菌株 WJ10、WJ25 和 WJ41被鉴定为伯克霍尔德菌 Paraburkholderia spp.。菌株WJ10、WJ25 和 WJ41 的 16S rDNA 基因序列已提交GenBank 核苷酸数据库，登录号分别为 MT895647、MT895464 和 MT895634。2.3 根际溶磷细菌对不同磷酸盐的溶磷过程及pH变化规律从图 4 可以看出 3 个溶磷菌株对 4 种磷酸盐均有溶磷效果。其中菌株 WJ10 对 FePO42H2O、Ca3（PO4）2、CaHPO42H2O 和 AlPO4 4 种 磷 酸 盐的最大磷溶解量分别为 114.03 mg/L、175.35 mg/L、153.14 mg/L 和 177.46 mg/L（图 4-A）。菌 株 WJ25对 FePO42H2O、Ca3（PO4）2、CaHPO42H2O 和AlPO4的最大磷溶解量分别为 54.45 mg/L、120.23 mg/L、116.37 mg/L 和 132.98 mg/L（图 4-C）。菌 株WJ41 对 FePO42H2O、Ca3(PO4)2、CaHPO42H2O和 AlPO4的最大溶磷量分别为 89.86 mg/L、164.28 mg/L、115.17 mg/L 和 174.63 mg/L（图 4-E）。此外，测定3个菌株对4种磷酸盐在溶磷过程中的pH发现，溶磷培养基中的 pH 值在 24 h 之后迅速下降，之后生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6278稳定在 pH 3-5 的范围内（图 4-B，图 4-D，图 4-F）。2.4 根际溶磷细菌对马尾松苗生长、生理的影响3 个溶磷菌株可以促进马尾松苗的生长（图 5,图 6-A 和图 6-B）。与对照处理相比，接种 WJ10 菌株的幼苗主根长、地上部鲜重和根鲜重显著增加（分别 增 加 22.6%、54.1%和 75.0%）（P0.05）。接 种WJ25 菌株可显著提高幼苗高度、主根长度、侧根数、地上部鲜重、根鲜重、地上部干重和根干重（分别为 11.2%、38.57%、62.1%、51.4%、150.0%、50.0%和 100.0%）（P0.05）。接种 WJ41 菌株后，幼苗高度、主根长度、侧根数、地上部鲜重、根鲜重和地上部干重均显著增加（分别为 8.8%、19.5%、49.9%、37.8%、141.7%和 60.0%）（P0.05）。由图 6-F、图 6-G、图 6-H 可知，3 株溶磷菌对马尾松生理指标的影响显示，与对照处理相比，接种 WJ10、WJ25 和 WJ41 后，马尾松幼苗的根系活力、叶绿素 b、茎可溶性蛋白、根可溶性蛋白和茎可溶性糖均显著增加（P0.05）。接种 WJ10 的幼苗，以上 5 个生理指标的值分别增加了 5.5%、74.8%、193.8%、360%和 48.4%；接种 WJ25 的幼苗分别增加了 61%、56.1%、100.0%、160%和 77.3%；接种WJ41 菌株的幼苗，其增长率分别为 69.5%、86.9%、168.8%、100.0%和 65.1%（P0.05）。此 外，WJ10和 WJ41 对总叶绿素含量也有显著的正向影响（图6-H）。接种 WJ10、WJ25 和 WJ41 可显著提高马尾松苗对氮和磷的吸收（P0.05）（图 6-I）。接种 WJ41的幼苗总氮增加最多（40.3%），其次是接种 WJ25（26.0%）和 WJ10（24.7%）的幼苗。接种 WJ25 的幼苗的总磷增幅最大（19.5%），其次是接种 WJ10（16.3%）和 WJ41（8.1%）的 幼 苗。此 外，接 种WJ10 和 WJ41 的幼苗的总钾含量也显著增加（分别为 27.6%和 28.6%）（P0.05）。2.5 溶磷菌株对马尾松苗根际土壤养分和酶活性的影响接种 3 个 PSB 菌株显著增加了马尾松苗根际土壤的有效养分（P0.05）（图 7-A）。与对照处理相比，接种 WJ10、WJ25 和 WJ41 可显著提高土壤水解 N（分别为 24.4%、30.7%和 14.2%）、有效 P（分别为20.1%、9.7%和 18.3%）和速效 K（分别为 22.0%、34.6%和 33.5%）（P0.05）。此外，接种 PSB 的土壤中的总 N 也显著增加，而总 K 降低（P0.05）（图7-B）。同时，3 株 PSB 菌株均对土壤脲酶和磷酸酶活性有显著影响，但对过氧化氢酶活性无显著影响（P0.05）（图 7-C、图 7-D、图 7-E）。接种 WJ25 的土壤脲酶水平增幅最大（41.0%），其次是接种 WJ41的土壤（38.4%）和 WJ10 的土壤（35.6%）。接种W41 的土壤磷酸酶增幅最大（39.7%），其次是接种WJ25（38.9%）和 WJ10（28.5%）的土壤。2.6 接种PSB菌株对马尾松苗根际细菌群落的 影响接种 PSB 菌株的马尾松苗根际细菌的高通量测序结果显示，所有处理共鉴定出 3 753 个 OTU，其中 WJ25（2 244）和 CK（2 181）处 理 的 OTU 比WJ10（1 967）和 WJ41（1 877）处理的 OTU 更多（表WJ25(MT895464)WJ41(MT895634)Paraburkholderia caffeinilytica strain CF1(NR_152088.1)Paraburkholderia sediminicola strain HU2-65W(NR_044383.1)Paraburkholderia bryophila strain 1S18(NR_042593.1)Paraburkholderia metrosideri strain DNBP6-1(NR_146373.1)Paraburkholderia ginsengisoli strain NBRC 100965(NR_113964.1)Paraburkholderia xenovorans LB400(NR_029199.1)Paraburkholderia lacunae strain S27(NR_165707.1)Paraburkholderia phytofirmans PsJN(NR_102845.1)Paraburkholderia phenazinium strain A 1(NR_029212.1)Paraburkholderia megapolitana strain A3(NR_042594.1)WJ10(MT895647)Paraburkholderia stabilis strain LMG 14294(NR_041719.1)Paraburkholderia pyrrocinia strain 2327(NR_029210.1)Paraburkholderia contaminans strain J2956(NR_104978.1)Paraburkholderia ambifaria strain AMMD(NR_074687.1)Paraburkholderia metallica strain R-16017(NR_042636.1)Pseudomonas vancouverensis strain DhA-51(NR_041953.1)56715868100547425100404039373239130.020图 3 采用 Neighbor Joining 法构建基于溶磷菌株 16S rDNA 序列的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence in PSB strains using Neighbor Joining method2023,39(6)279徐红云等：根际溶磷伯克霍尔德菌 Paraburkholderia spp.对马尾松苗的促生作用1）。由 Shannon 和 Simpson 多样性指数可知，WJ10和WJ25处理的细菌群落多样性高于CK处理。然而，对比 ACE 和 Chao1 指数可知 WJ10 和 WJ41 处理的细菌群落丰度低于 CK 处理。4 个处理间门水平上的细菌群落组成存在显著差异（图 8-A）。在所有样本中，有 14 个相对丰度大于 1%的细菌门，包括蛋白杆菌 Proteobacteria、放线菌 Actinobacteria、酸性细菌 Acidobacteria、拟杆菌Bacteroidetes、双歧杆菌 Gemmatimonadetes、疣状杆菌 Verrucomicrobia、平霉菌 Planctomycetes、糖假丝酵母菌 Candidatus Saccharibacteria、Candidate division WPS-1、Chloroflexi、Parcubacteria、Firmicutes、Armatimonadetes 和 衣 原 体 Chlamydiae。其 中，变形杆菌 Proteobacteria、放线菌 Actinobacteria、酸性细菌 Acidobacteria、拟杆菌 Bacteroidetes、双歧杆菌 Gemmatimonadetes 和 疣 状 杆 菌 Verrucomicrobia 是马尾松根际土壤中的优势门，其累积相对丰度分 别 为 83.62%（CK）、78.91%（WJ10）、82.23%（WJ25）和 85.56%（WJ41）。然而，某些细菌门的相对丰度在不同处理中发生了变化。与对照相比，WJ10、WJ25 和 WJ41 处理中的酸性细菌门的相对04080120160200024487296120 144 168溶磷量P solubilization capacity/(mgL-1)培养时间 Incubation time/hFePO42H2OCa3(PO4)2CaHPO42H2OAlPO4A01234567024487296120144168pH培养时间 Incubation time/hB04080120160024487296120 144 168溶磷量P solubilization capacity/(mgL-1)培养时间Incubation time/hC01234567024487296120144168pH培养时间 Incubation time/hD04080120160200024487296120 144 168溶磷量P solubilization capacity/(mgL-1)培养时间 Incubation time/hE01234567024487296120144168pH培养时间 Incubation time/hFA 和 B：WJ10;C 和 D：WJ25;E 和 F：WJ41。图中的数据是均值，误差线是标准偏差，下同A and B:Strain WJ10;C and D:strain WJ25;E and F:strain WJ41.The data in the figure are means,and the error line is the SE.The same blow图 4 三个溶磷菌株对不同磷酸盐的溶磷能力及 pH 变化Fig.4 P solubilizing capacity of three PSB in four different phosphate medium and acidification of medium during the phos-phate solubilization图 5 接种溶磷菌株 60 d 后马尾松苗的生长差异Fig.5 Effects of three PSB strain inoculations on the growths of P.massoniana seedlings for 60 d生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6280丰度分别显著增加了 57.14%、33.19%和 71.01%；疣状瘤菌的相对丰度分别增加了 104.78%、41.15%和 310.53%；但放线菌的相对丰度分别显著降低了35.31%、20.26%和 70.81%（P0.05）。在属水平上，各处理与 CK 处理有显著差异（P0.05）。ACE 和 Chao1 指数与土壤速效磷、脲酶和磷酸酶呈负相关（P0.05）。辛普森指数与土壤水解氮、速效磷和脲酶呈负相关（P0.05）。3 讨论由于根际溶磷细菌能够从不溶性磷酸盐中释放可溶性磷的特点，使其在土壤磷循环过程中发挥着重要的作用。截至目前，从不同植物的根际土壤中分离出越来越多的 PSB 菌株，例如从杨树根际分离出的弗氏假单胞菌 Pseudomonas frederiksbergensis5；从玉米根际分离的芽孢杆菌属 Paenibacillus sp.、假单胞菌属 Pseudomonas sp.和鞘氨醇属 Sphingobium sp.8；以及从伪星际松 Pinus pseudostrobus 根际分离的罗勒铜杆菌 Cupriavidus basilensis、庆生红球dacbcabb00.010.020.030.040.050.06CKWJ10 WJ25 WJ41可溶性蛋白含量Soluble protein/(mgg-1)ShootRootcaaacbaab00.10.20.30.40.50.60.7CKWJ10WJ25WJ41鲜重Fresh weight/(gplant-1)ShootRootbbaa020406080100120CK WJ10 WJ25 WJ41根系活力Root activity/(g(gh)-1)babaa02468101214CKWJ10WJ25WJ41苗高 Seedling height/cmcbcaa02468101214CKWJ10WJ25WJ41侧根数Lateral roots/numberbaaa02468101214161820CKWJ10WJ25WJ41根长 Taproot length/cmbabaababaab00.050.10.150.2CKWJ10WJ25WJ41干重Dry weight/(gplant-1)ShootRootbcbaaaaababa0510152025Total NTotal PTotal K植株养分含量Plant nutrient content/(gkg-1)CKWJ10WJ25WJ41accaabbabbcaaa00.10.20.30.40.50.6Chlorophyll a Chlorophyll b Total chlorophyll叶绿素含量Chlorophyll/(mgg-1)CKWJ10WJ25WJ41ABCDEFGHIA：苗高；B：根长；C：侧根数；D：鲜重；E：干重；F：可溶性蛋白含量；G：根系活力；H：叶绿素含量；I：植株养分。不同字母代表差异显著（P0.05），下同 A:Seedling height;B:root length;C:lateral root number;