基于疾病与活性化合物靶点网络研究牛舌草治疗大鼠脑缺血-再灌注损伤的作用.pdf

基于疾病与活性化合物靶点网络研究牛舌草治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的作用谭文溚胡博军黄贝张雯王淑美臧林泉杜冠华(.广东药科大学药学院广州.中国医学科学院北京协和医学院药物研究所药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室北京.河南大学药学院开封)摘 要 目的 基于脑缺血再灌注损伤与牛舌草中活性化合物靶点网络研究牛舌草治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的作用及机制 方法 采用线栓法制备脑缺血再灌注损伤大鼠模型缺血.再灌注 对大鼠神经功能进行评分三苯基氯化四氮唑()测定大鼠脑梗死体积 采用网络药理学的分子网络分析技术、蛋白质蛋白质相互作用网络、基因本体()生物过程富集分析、京都基因与基因组百科全书()信号通路分析、分子对接等方法研究牛舌草治疗脑缺血再灌注损伤作用机制 结果 牛舌草给药治疗能够显著改善脑缺血再灌注损伤引起的神经行为功能障碍减轻脑组织病理损伤 并且牛舌草能够通过 个缺血性脑卒中相关靶点调控炎症反应、细胞凋亡等生物过程干预肿瘤坏死因子信号通路、血管内皮生长因子信号通路和缺氧诱导因子 信号通路等发挥作用 结论 网络药理学及动物实验表明牛舌草通过多靶点、多机制整体联合治疗脑缺血再灌注损伤可有效降低脑损伤和保护神经功能关键词 牛舌草脑缺血再灌注损伤网络药理学中图分类号 文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()(.).().缺血性脑卒中()是指脑血管病变、血液成分异常或其他原因引发的脑血管狭窄或闭塞进而导致脑组织局部供血、供氧不足出现脑损伤和神经功能障碍 目前缺血性脑卒中已经成为全球人口死亡和长期严重残疾的主要原因之一 恢复缺血区域血氧供应是缺血性脑卒中的主要治疗目标 然而当梗死区域脑组织长时间缺血缺氧后恢复血氧供应时会释放过量的活性氧自由基()、激活炎症反应等损伤机制破坏细胞内蛋白质、脂质、核酸和组织结构导致继发性脑损伤和神经功能障碍这种现象被称为脑缺血再灌注损伤(/)是一个复杂的病理生理过程涉及多种损伤机制包括氧化应激、炎症反应、细胞内钙超载、线粒体功医药导报 年 月第 卷第 期能障碍和细胞凋亡等紫草科多年生草本植物牛舌草(.或 .)分布于我国大西南以及河北、陕西、甘肃、台湾等地是维吾尔族治疗心脑血管疾病的经典药材之一常用于异常黑胆质成熟剂、异常黑胆质清除剂和艾菲提蒙汤具有生湿补脑、祛寒补心、爽心悦智、润燥消炎、止咳平喘等功效 研究表明牛舌草可以调节丝裂原活化蛋白激酶()信号通路和核因子()信号通路激活核因子 相关因子()/血红素加氧酶()信号通路减少白细胞介素()、白细胞介素()、肿瘤坏死因子()等炎症因子的表达 并且牛舌草总黄酮可以调节心肌缺血再灌注损伤中凋亡相关蛋白的表达有效抑制心肌细胞凋亡 目前尚缺乏牛舌草治疗 损伤相关研究 因此笔者在本实验首先采用线栓法制备 大鼠模型确证牛舌草的治疗效果并结合网络药理学、分子对接、分子生物学探索其作用机制 材料与方法.实验动物 大鼠 只雄性 周龄体质量 级购自北京华阜康生物科技有限公司实验动物许可证编号:(京)实验动物合格证号:分笼饲养保持相对湿度 室温 自由进食、进水动物实验符合伦理学标准并得到中国医学科学院药物研究所伦理委员会的批准实验伦理审查批准号:收稿日期 修回日期 基金项目国家自然科学基金资助项目()中国医学科学院医学与健康科技创新工程重大协同创新项目()北京市科学技术协会青年人才托举工程()作者简介 谭文溚()男广西河池人在读硕士研究方向:神经药理学相关研究:电话:通信作者 臧林泉()男河南确山人教授硕士生导师博士研究方向:新药研发与分子药理学研究:通信作者 杜冠华()男山东滕州人研究员博士生导师博士研究方向:神经药理学、心脑血管药理学、新药发现与高通量药物筛选研究:电话:.实验材料牛舌草(购自新疆药都药业有限公司经新疆药都药业有限公司鉴定为正品批号:)、异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司批号:)、氯化三苯基四氮唑(美国 公司批号:)、多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司批号:).实验方法.牛舌草醇提取物制备牛舌草粉碎至粉末后称取 加 乙醇 浸泡 再加 乙醇 回流提取 提取 次合并提取液 提取液减压旋蒸回收乙醇得浓缩液 过滤用大孔吸附树脂进行纯化收集洗脱液 减压去除乙醇后真空冷冻干燥得固体粉末每克固体粉末含原药材 .动物造模与分组 模型制备:异氟烷吸入麻醉仰卧位固定大鼠沿颈正中线开口 钝性分离右侧组织和肌肉直至右侧颈总动脉()暴露在 近心端、颈外动脉()远心端、近心端和颈内动脉()近心端备线插入线栓前阻断、和 在 中部略开小口将线栓由 插入后导入 同时松开 近心端的止血夹继续将线栓插入至其颅内段自 分叉处插入的线栓长约 阻断大脑中动脉.后取出线栓结扎 近心端松开 实现再灌注 假手术组的大鼠手术是仅在暴露右侧颈总动脉颈外动脉颈内动脉阻断血液剪断颈外动脉并结扎血管即可完成 造模成功的 大鼠按随机数字表法分为模型对照组及牛舌草给药、组给药剂量按牛舌草醇提取物固体粉末计算 牛舌草给药组在再灌注后立刻尾缘静脉给药假手术组和模型对照组给予相应体积的.氯化钠溶液.神经功能评分再灌注后 进行神经功能评分采用 评分、测试和抓取力测试从运动功能、感觉功能和平衡功能 个方面评价大鼠损伤程度其中 评分和 测试的评分越高抓取力测试评分越低则表示大鼠损伤越严重 评分在 分则认为 模型制备成功并纳入后续实验.染色再灌注后 快速分离大脑并速冻将冷冻的大脑切割成厚度约 的冠状切片放置于 染色液中 避光孵育多聚甲醛固定然后拍照记录 使用()计算梗死体积 梗死体积 百分比总梗死体积(同侧半球体积对侧半球体积)/对侧半球体积.牛舌草化学成分、靶点和疾病靶点获得 在中国知网(:/./)、中国生物医学数据库(:/./)和 数据库(:/./)检索查询牛舌草已知且结构明确的化合物成分通过(:/./)获得相应 结构数据 将化合物 数据分别导入 数据库(:/./)(值 )、数据库:/./靶点选择概率()、()数据库(:/./)()检索 相关靶点将上述疾病靶点与牛舌草化合物作用靶点通过 .取交集获得牛舌草治疗 潜在靶点.蛋白相互作用网络图构建将牛舌草治疗 潜在靶点导入 数据库(:/./)获得蛋白质相互作用()网络数据之后应用 .软件建立 网络图 采用 分析牛舌草治疗 关键靶点并进行拓扑分析 同时应用 构建功能模块进行 功能分析.京都基因与基因组百科全书()信号通路和基因本体()生物过程分析将牛舌草治疗 潜在靶点导入 数据库(:/./)进行 信号通路分析和 生物过程富集分析分析牛舌草治疗 作用通路和生物过程.分子对接实验使用 数据库(:/./)在线平台检索 牛舌草治疗 关键靶点获得其 蛋白结构 在 数据库(:/./)下载牛舌草活性化合物 结构 将靶点与化合物 结构导入 进行分子对接利用结合分数()来评估牛舌草中活性化合物与其治疗 关键靶点的蛋白结合能力.统计学方法 应用 版统计软件()对实验数据进行处理相应指标使用均数标准差()表示采用单因素方差分析方法()进行统计学分析以.为差异有统计学意义 结果.牛舌草对 脑梗死体积和神经功能的影响 染色结果显示与假手术组比较模型对照组出现严重的脑损伤脑梗死体积显著增加(.)牛舌草给药、能够有效抑制缺血再灌注引起的脑损伤显著减少脑梗死体积(.)如图 所示神经行为学评分显示与假手术组比较模型对照组大鼠的神经行为和运动功能损伤严重 评分和 评分显著升高(.)抓取力测试评分显著降低(.)与模型组对照比较牛舌草各剂量组大鼠 评分均显著下降(.)抓取力测试评分显著上升(.)牛舌草给药组 评分显著下降(.)如图 所示.牛舌草潜在靶点 网络图分析通过数据库查询共获得牛舌草化学成分 个见表 在化合物靶点数据库检索药物作用靶点且与 疾病靶点取交集获得共有靶点 个作为牛舌草治疗 潜在靶点 将上述靶点导入 数据库并用 .版软件建立 网络图结果如图 所示 算法分析网络图获得关键靶点分别为蛋白激酶(/)、促分裂原活化蛋白激酶 ()、白细胞介素家族、信号转导和转录激活因子、转录因子()、血管内皮生长因子()、天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶 ()、基质金属蛋白酶()等见表.牛舌草治疗 靶蛋白模块分析 应用 算法分析牛舌草潜在治疗 靶点识别疾病靶蛋白相互作用的功能模块如图 所示 关键功能模块 主要涉及 信号通路、血管内皮生长因子()信号通路、缺氧诱导因子()信号通路、白细胞介素()信号通路等如图 所示 关键功能模块 主要涉及磷脂酰肌醇羟激酶蛋白激酶()信号通路、样受体()信号通路、趋化因子信号通路等见表 关键功能模块 主要涉及 细胞受体信号通路、细胞凋医药导报 年 月第 卷第 期 .牛舌草对 脑梗死体积的影响.牛舌草对 神经功能障碍的影响 与假手术组比较.与模型对照组比较.(神经功能评分实验 染色实验)图 牛舌草对 的影响.().表 牛舌草中活性成分.类别与化合物分子式分子量黄酮类.萜类.类别与化合物分子式分子量 .()().).()().).酚酸类或酚类 .().)续表 牛舌草中活性成分.类别与化合物分子式分子量(.).生物碱类.脂肪酸类或脂类 .类别与化合物分子式分子量 .糖类.烷烃类.其他.图 牛舌草潜在靶点 网络图.亡、型凝集素受体信号通路等见表.信号通路和富集分析 将牛舌草治疗 的潜在靶点导入 数据库进行作用通路和生物过程分析 生物过程富集分析显示生物学过程主要包括肽基丝氨酸磷酸化调节、趋化因子产生调节、星形胶质细胞激活、一氧化氮生物合成调控、通路调节等细胞组分主要包括过氧物酶体、内质网腔、溶酶体、神经元胞体等以及分子功能主要包括 结合、一氧化氮合酶活性、趋化活性、蛋白酶结合等如图 所示 信号通路分析显示牛舌草治疗脑缺血再灌注损伤作用通路主要涉及 信号通路、信号通路、信号通路、样受体信号通路等如图 所示.牛舌草成分对疾病靶点的结合能力 牛舌草潜在治疗 靶点与相关化合物通过 进行分子对接其中 与、与 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(/)、等蛋白的结合能力高于内在配体如表、图 所示 讨论近年来研究者对治疗 做出了许多探索发医药导报 年 月第 卷第 期表 拓扑学筛选的关键靶点.基因名称蛋白名称度中心度紧密中心度 /.关键功能模块.关键功能模块.关键功能模块 图 牛舌草治疗 关键功能模块.表 功能模块 和 富集分析.子网络条目功能模块 功能模块 功能模块 现各种不同治疗机制的药物以期满足临床治疗的需求但是 涉及多种病理机制包括氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、血脑屏障破坏和线粒体功能障碍等现有药物难以达到临床治疗目标 民族医药作为中医药重要组成部分经过各民族不断发展和应用自身的价值在不断被挖掘 牛舌草作为维吾尔族民族医药之一长期应用于心脑血管疾病治疗但其药效成分和具体治疗机制尚不清楚 本研究通过动物实验确证牛舌草对 的治疗作用并采用网络药理学和分子对接技术探讨牛舌草药效成分与作用机制采用线栓法制备 大鼠模型缺血.再灌注 模型对照组大鼠表现出明显的运动失调且脑组织出现显著梗死 牛舌草给药治疗能够显著改善脑缺血再灌注引起的神经行为和运动功能障碍减小脑梗死体积依据本研究的成分检索策略和靶点筛选方法利用网络药理学分析牛舌草活性成分靶点与 靶点之间的关系共获得共有靶点 个作为牛舌草治疗 的潜在靶点如、等主要涉及炎症因子、丝裂原活化蛋白激酶家族、基质金属蛋白酶家族、血管内皮生长因子家族、氧化还原酶家族等 分析显示牛舌草治疗脑缺血再灌注损伤 图 功能模块 和 富集分析.生物过程分析.富集分析图 牛舌草作用靶点的 生物过程分析和 富集分析.医药导报 年 月第 卷第 期表 分子对接结果.关键靶点对接化合物对接分数.关键靶点对接化合物对接分数.().与.与.与.与 图 分子对接模式图.作用通路主要包括 信号通路、样受体信号通路、信号通路、信号通路等 是一类 依赖性蛋白水解酶属于基质金属蛋白酶家族由 型胶原酶、层粘连蛋白和纤维连接蛋白组成 在 发生和发展中脑组织损伤会释放促炎症因子诱导 表达增加通过降解细胞外基质、破坏脑微血管和血脑屏障的结构完整性导致继发性脑水肿和脑损伤 属于丝氨酸/苏氨酸蛋白酶家族是/信号通路调节炎症反应的枢纽 会抑制 激活减少 磷酸化诱导细胞凋亡因子、细胞色素、等释放和激活导致炎症级联反应和细胞凋亡 属于丝氨酸/苏氨酸蛋白酶家族可以将细胞外信号传递到细胞核广泛参与细胞内的各种信号传递过程在 发展过程中 被激活促进 磷酸化并激活 诱导 苏氨酸/酪氨酸残基磷酸化与 和 等转录因子相互作用参与脑缺血再灌注损伤的炎症反应和细胞凋亡 分子对接结果显示牛舌草中活性成分与其治疗 的潜在靶点、等结合能力高于内在配体 由此可见牛舌草可能通过调节上述靶点发挥治疗 的作用综上所述本研究通过动物实验模拟 确证了牛舌草对大鼠 的治疗作用且采用网络药理学、分子对接、信号通路和富集分析等探索牛舌草分子网络机制 研究表明 牛舌草可能通过调节、等多个疾病靶点影响 信号通路、信号通路、样受体信号通路等调控炎症级联反应、氧化应激和细胞凋亡减轻 该研究结果为后续牛舌草研究及临床推广提供了参考依据但是对牛舌草化学成分研究有限网络预测结果多具有一定的局限性和不足参考文献 .:.():.():.():.():.():./.:.:.():.():.():.():./.:.陈义磊木合塔尔吐尔洪木尼热阿布都克力木.大孔树脂纯化牛舌草总黄酮的工艺优化.南开大学学报(自然科学版)():.胡甲乙.复方高滋斑片降血压药效及作用机制研究.武汉:湖北中医药大学:.依明尕哈甫王晓梅热娜卡斯木等.高效液相色谱蒸发光散射检测法同时测定牛舌草提取液中的 种单糖.食品安全质量检测学报():.胡博.牛舌草化学成分及其活性的研究.天津:天津大学:.陈长春庞战徐文文.维药牛舌草成分及药理活性研究.西部中医药():.李蒙华.意大利牛舌草总黄酮及其成分体外抗心肌缺血再灌注损伤活性及作用机制初步研究.乌鲁木齐:新疆医科大学:.():.医药导报 年 月第 卷第 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