毛细管等电聚焦.ppt

毛细管等电聚焦等电点，pI正负电荷相等时对应的pH两性离子n细胞色素C10.6n胰蛋白酶原9.2n鲸肌红蛋白7.6n马肌红蛋白6.6nBeta-乳球蛋白 5.2n转铁蛋白 4.3pI7的蛋白质在不同pH处的荷电情况等电聚焦的原理等电聚焦的原理具有一定pI的蛋白在电场中建立的pH梯度介质中，当所处位置的pH低于pI时带正电荷，向负极移动；在高于pI的pH位置时带负电，向正极移动；在等于pI处不动。不同等电点组分被聚焦在不同位置而达到聚焦和分离的目的。Capillary Iso-Electric Focusing-CIEFn高分辨率（分辨率可达0.005 pH）n快速n微量n在柱检测如何在电场方向上产生pH梯度？如何维持建立的pH梯度的稳定？毛细管中pH梯度的建立CH2=CHCOOHCH2=CHNH2(CH2-CH)mNH2(CH2-CH)nCOOH丙烯酸乙烯氨聚两性电解质两性电解质的合成0+-pH/x阳极端(酸性电解质）阴极端（碱性电解质）两性电解质的电荷与pH的关系0+-pH/x阳极端阴极端pI两性电解质中的蛋白CIEF操作过程CIEF分辨能力取决于：扩散系数电场强度pH梯度淌度的pH梯度CIEF 中的谱带移动n正极移动：在正极加电解质如NaCl，使聚焦后分离的谱带向该极移动n负极移动：在负极，加电解质如NaCl，使聚焦后分离的谱带向该极移动n压力移动，加电压的同时施加压力，实现移动的同时保持聚焦状态n扫描检测分离谱带，无需谱带移动xpH阴极端阳极端阳极移动示意图，阳极加入中性盐xpH阴极端阳极端阴极移动示意图，阴极加入中性盐CIEF中加电加压转移方法CIEF分离蛋白混合物CIEF Analysis of anti-CEA MAbCIEF测定等电点CIEF蛋白定量分析CIEF分析过程：载入，聚焦，迁移（检测）CIEF试验要点n内壁经处理的毛细管n两性电解质（1）和样品充入毛细管n电极液20 mM 磷酸为阳极液，20 mM NaOH为阴极液n加电压聚焦，46kV，聚焦稳态后电流下降到起始的1025n聚焦区带的转移和检测操作注意事项操作注意事项浓缩沉淀：由于局部高度浓缩，有可能导致蛋白沉淀阻塞。需要加添加剂，如PVA等对蛋白质pI影响小的非离子表面活性剂。检测：因为通常所用两性电解质在低UV有吸收，因此UV检测通常在较高波长，即280 nm进行。比较CEIFCZE原理电解质等电点两性电解质淌度缓冲溶液区带宽度随时间变窄随时间变宽进样方法混合在支持电解质中塞状进样区带浓度被浓缩被稀释CIEF和CZE比较医学资料仅供参考,用药方面谨遵医嘱