基于外表面修饰的固态纳米通道用于生物标志物分析的研究进展.pdf

CHINESE JOURNAL OF APPLIED CHEMISTRY2024年1月87-99应用化学第41卷第1期D01:10.19894/j.issn.1000-0518.230304基于外表面修饰的固态纳米通道用于生物标志物分析的研究进展袁丽珍 林妮娅张云帆胡晶晶娄筱叮夏帆（中国地质大学（武汉）生物地质与环境地质国家重点实验室，纳米矿物材料及应用教育部工程研究中心，材料与化学学院，武汉430 0 7 4）摘要生物标志物，如离子、小分子、蛋白质、多糖、核酸和细胞，参与生物体的构建，在生命过程中发挥重要作用。准确检测这些生物标志物对于疾病研究、早期诊断、药物评估和人类健康监测具有重要意义。外表面功能化固态纳米通道在纳米通道的外表面进行修饰，消除了对靶标分子的限制，通过基于离子信号的变化，提升了检测的速度和灵敏度。本文从外表面修饰的固态纳米通道在生物标志物检测方面进行综述，简要介绍了固态纳米通道外表面功能化的方法，重点总结了外表面修饰的固态纳米通道在生物标志物分析上的研究进展，简要展望外表面修饰的固态纳米通道所面临的挑战与发展机遇关键词纳米通道；外表面；生物标志物中图分类号：0 6 54文献标识码：A文章编号：10 0 0-0 518(2 0 2 4)0 1-0 0 8 7-13生物标志物是正常生理过程、致病过程或暴露/干预反应的可测量指标，可以反映生物系统与潜在危害(可能是化学、物理或生物危害)之间的相互作用，可能是功能性的生理反应，也可能是细胞层面的生化反应，还可能是分子间的相互作用，因此建立准确、灵敏和方便的生物标志物检测方法对于疾病研究2 、早期诊断3、药物评价4 和人类健康监测5 具有重要意义。离子、小分子、蛋白质、多糖、核酸和细胞等物质参与生物体的构建，在大多数生物功能中起着关键作用。大多数疾病(如癌症)的发生和预后均与这些物质的变化有关6 。因此,对离子、小分子、蛋白质、多糖、核酸和细胞等生物标志物进行高灵敏、特异性地检测，对于研究其基本功能、了解生物过程和发展分子诊断具有重要意义。目前，科研工作者已经开发出了多种检测生物标志物的方法，如荧光法7 、酶联免疫吸附测定8 、比色测定9 、聚合酶链式反应(PCR)10和表面等离子体共振和电泳1 等。这些方法可以检测存在于血液、尿液和唾液中的生物标志物。然而，昂贵的仪器、复杂的样品制备和缓慢的检测速率限制了这些检测技术的广泛应用。固态纳米通道传感系统具有小型化、灵敏度高、分析速度快、无标记和操作简单等优势而备受关注2 。基于固态纳米通道的传感系统主要分为两组：内壁修饰固态纳米通道和外表面功能化固态纳米通道13。内壁修饰固态纳米通道可以实现对各类靶标的原位和实时检测，然而，由于纳米通道的直径有限，内壁修饰固态纳米通道无法实现对大于纳米通道孔径的生物标志物（如细胞）的原位和直接检测141。外表面功能化固态纳米通道可以在纳米通道的外表面进行修饰，大的外表面积，使生物靶标识别的可能性提高，也不受目标大小的限制。近年来，外表面功能化固态纳米通道已被广泛研究，实现了对离子、小分子、蛋白质、多糖、核酸和细胞的直接检测本文综述了外表面功能化固态纳米通道在生物标志物分析的研究进展。内容主要分为3个部分：首先，简要介绍了固态纳米通道外表面功能化的方法；其次，重点总结了外表面修饰固态纳米通道传感器在生物标志物检测方面的研究进展，按检测目标分类，包括离子、小分子、生物大分子和细胞（图1）；最后，总结并展望了外表面修饰的固态纳米通道所面临的挑战与发展机遇。1固态纳米通道外表面功能化固态纳米通道是指直径在1 10 0 nm且通道的长度远大于孔径的结构，因固态纳米通道具有良好的2023-10-05收稿；2 0 2 3-12-15接受国家自然科学基金（Nos.22090050，2 19 7 412 8，52 0 0 32 57）资助*E-mail:88第41卷应用化学八八探针目标物生物大分子细胞离子小分子红米通道阳离子气阴离子图1本综述内容概览Fig.1The content of this review几何结构、尺寸、机械稳定性、易于改进以及具有宏观量子隧道效应等优点，使固态纳米通道成为材料学、物理化学和生物医学等领域的重点研究对象15。纳米通道功能化是丰富纳米通道性能的重要方式，可以有效拓宽纳米通道的应用领域。采用一系列功能化技术，如物理气相沉积、化学气相沉积、化学镀层、原子力沉积、等离子体聚合、共价键接枝、自组装单分子层以及层层自组装等16 ,将特定功能性小分子、特定功能的聚合物、配体分子、核酸适配体、抗体以及纳米颗粒等功能分子或者涂层，通过共价键或者非共价键作用，对称或非对称方式修饰到纳米通道表面，可以赋予纳米通道可以面向各种场景应用的性质和功能。在基于固态纳米通道的传感系统中，外表面功能化固态纳米通道的检测主要是基于离子信号的变化来实现的，通过对外表面探针的接枝密度、电荷密度、润湿性和带电性的调控实现对生物标志物的检测17-2 2外表面修饰的固态纳米通道用于生物标志物检测在近些年的发展过程中，基于固态纳米通道的传感器凭借表面功能化和选用功能分子作为探针，实现了对生物标志物的广泛检测。本节按检测目标分类，对外表面修饰的固态纳米通道在离子、小分子、生物大分子和细胞等生物标志物分析检测的研究进展进行总结，2.1离子的检测生命体内的各种离子在维持生命体各种生命活动中扮演者不可或缺的作用，如维持细胞和生物体的酸碱平衡、构成细胞某些复杂化合物的重要组成成分等。这些离子的缺乏或者过量均会导致生命体的正常生命活动出现严重的问题。例如，汞离子在体内积累会严重影响身体健康2 3。目前，已有电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、荧光、比色和电化学等方法来检测汞离子浓度。然而，昂贵的仪器、复杂的样品制备和缓慢的检测速率限制了这些检测技术的广泛应用，开发高灵敏度和快速检测的离子检测工具具有相当重要的意义。Yan等2 4 报道了一种通过外表面功能化固态纳米孔道特定识别汞的传感方法，如图2 a所示，将硫脲连接的2 D共价有机框架（JNU-3）作为识别单元，共价键合在多孔氧化铝薄膜（AAO)的外表面上，由于硫脲连接的JNU-3与Hg（I）具有强特异性亲和力,JNU-3AAO可检测0.01100pg/mL的汞离子，检测限低至3.2 8 fg/mL,10pg/mL下Hg（I)重复测定11次的相对标准偏差仅为3.8%。硫脲连接的JNU-3和Hg（I）可以在9 0 s内实现相互作用，提高了检测Hg（I）的速度。除了提高检测速度，提高检测离子的灵敏度也是目前研究者们面对的主要问题之一。受生物纳米89第1期袁丽珍等：基于外表面修饰的固态纳米通道用于生物标志物分析的研究进展孔协同效应的启发Jiang等2 5 在固态纳米通道的内壁涂覆亲水性DNA探针（DNAIWVHydapile）,，外表面涂覆疏水性涂层（NoneOSuyambati）构建具有协同效应的固态纳米通道传感器（图2 b）。外表面修饰的疏水性涂层（NoneOSyaplali）导致纳米通道的有效直径减小，可以阻止干扰元素进入纳米通道，通过与内表面修饰相结合实现在复杂环境中对离子的准确检测，使汞离子的检测限降低至1nmol/L，提升了检测灵敏度。a201OHOHOHOHR2=0.990616(%)NHAAOJNU-3AAO-Hg()0/(-1)H12HNAPTESHg(ll)8HNNHo4NHzNH2NHNH22NH21JNU-3HNTp,Pa-SOHN0inSitu-3-2-1023AAO-NH2JNU-3AAOIg(CHg(u)(pg mL:)bDNAIWVrydrophite+DNAOSHiydrophilieLowSensitivitySensing:LODio5nM-NoTarget-TargetSignalReadoutClosedOpenVoltage(V)DNAIWWiriydrophilie+NoneOSHiydrophobicHigh Sensitivity-No TargetSensing:LOD1nM-TargetSignalReadoutClosedOpenVoltage(V)Biological NanoporeDNAProbeDNAaOSHydrophilicSolid-State NanochannelDNAIWHydroplicNoneaOSHydrophobicTargetlonicCurrent图2（a）JNU-3 A A O 的纳米流体传感器检测汞（I）示意图2 4）；（b）仿生固态纳米通道（DNAIWHydrophilicDNAOSuydaphale 和DNAIW,Fig.2(a)Schematic illustration of JNU-3AAO-based nanofluidic sensor for the detection of Hg(I)24;(b)Schematic diagram of bio-inspired solid-state nanochannels(DNAIW,2.2小分子的检测除了离子，基于纳米通道的传感器也被用作分子传感的新平台2 6 。Xia等2 7 利用亚甲基蓝的共价标记和阳离子RuHex探针的静电吸附，建立了一种双电流信号生成的纳米通道传感平台，实现在限域空间内检测腺苷三磷酸（ATP）。该平台利用亚甲基蓝电活性标签标记,组装后的DNA框架作为分子开关，介导电子转移(ET)产生电解电流(EC)信号，并引导跨膜离子传输(IT)产生IC信号。DNA内层框架上大量吸附的RuHex离子进行电化学还原，通过ET过程产生EC信号，自由存在的RuHex离子被ATP分解时，逃离纳米通道的内部空间，从而产生明显的信号变化，实现对ATP的灵敏检测氯霉素(CAP)作为一种常见的兽药抗生素，被广泛用于治疗伤寒、霍乱和脑膜等传染病。然而,食物90第41卷应用化学中微量的CAP残留可能会对人体产生严重的副作用2 8 。团因此，Yan等2 9 开发了一种基于适配体自组装功能化的纳米通道传感器用于检测食品中的CAP(图3a）。C A P适配体（Apt)接枝到氨基功能化AAO上（A p t A A O），A p t 在AptAAO进一步自组装成AAs功能化的AAO（A A s A A O）。A p t 与CAP的选择性相互作用导致Apt从AAsAAO分离，引发AAsAAO纳米通道灵敏电流变化，从而实现对复杂样品中CAP的精确测定。开发的AAsAA0纳米通道传感器显示出从0.32 16 0 0 pg/mL的宽线性范围，检测限低至0.1pg/mL,相对标准偏差为2.9%的高精确性，以及在牛奶、奶粉和蜂蜜样品中加标CAP的回收率为93.4%102.2%，实现了宽线性范围、高精度和高灵敏度的CAP检测。a1NH,NH,NH,1.81.2OHCS3OHC-A0.6AAO-NH2Apt-AAOAASAAO8.0-1.0-0.5oo0.5OHOHOH1.0-0.6Voltage(V)AAOAAO.NH,-1.2Apt-AAOAASAAO-1OHC-MAASQAAO-2AAOApt-1.8AASQAAO-3ChannelWallAptamerLinkerCAPAASOAAO4bCu,SenanochannelCu,Senanochannel+S-Npx30Cu,Senanochannel+R-Npx150CuSeL-PenL-CysL-GluL-GInAAOs-NaproxenR-NaproxenSCuSeL-penicillamine.PBSC8001=-87.2LogC+665.2R=0.993600-CHOflOW400Hydrophilic CPs200-HCHONH2N=CH210:101091010-710105104103CHCHo(M)图3（a）用于检测CAP的AAsAAO纳米通道设计示意图及检测结果的I-V曲线图2 9；（b)用于检测萘普生的Cuz_Se/AAO纳米通道示意图30 1；（c)用于检测甲醛的CP/AAO固态纳米通道示意图31)Fig.3(a)Schematic illustration of JNU-3AAO-based nanofluidic sensor for the detection of Hg(II)and I-V plot ofthe test results 291;(b)Schematic diagram of Cu,Se/AAO nanochannels for the detection of naproxen 301;(c)Schematicdiagram of CP/AAO solid-state nanochannels for the detection of formaldehyde 3ai手性分子具有非对称性质，其镜像异构体（对映体)在生物学、医药学和化学合成等领域中具有不同的生物活性、药效和化学反应性质。因此，准确检测手性分子的存在和浓度对于药物研发、药物安全性评估、环境监测和化学合成等方面具有重要意义。Kuang等30 1采用界面自组装技术构建了一个含有手性配体且纳米孔尺寸可定制的大规模非均膜体系，用以检测具有手性结构的萘普生（图3b）。该体系由91第1期袁丽珍等：基于外表面修饰的固态纳米通道用于生物标志物分析的研究进展带负电荷的零维Cuz-SeNP阵列组成。通过将带负电荷的L-青霉胺（L-pen)插人Cuz-,Se（L-p e nCuz-Se）膜中，提高离子整流，在近红外区域（8 0 0 16 0 0 nm）表现出圆二色性（CD)带，在1440 nm处最大强度为16 4.5mdeg。此外，通过控制层数、减少孔径和调整功能配体，导致整流增加到114。青霉胺的加入使得对萘普生的高对映选择性识别成为可能,其显示出极高的灵敏度，检测限低至0.0 2 7 nmol/L。甲醛（HCHO)是一种常见的挥发性有机物，广泛用于化工行业，人一旦吸人过量的甲醛，容易患上白血病。因此，检测甲醛的存在和浓度对于保护人体健康非常重要。目前，已经发展出多种甲醛传感器，但这些传感器主要集中在改变探针的成分和结构上，而很少研究界面润湿性对传感器性能的影响。由于甲醛在水中的溶解度较高，传感器的纳米通道应具有较强的亲水性，以确保甲醛可以自由地扩散到纳米通道中并与探针充分接触。然而，过多的亲水性基团会导致“淹没”现象，即过高的膜渗透性会严重削弱纳米通道的整流效应和检测性能。基于此,Zhang等31 受生物水通道的启发,提出了一种后修饰可调控纳米通道亲水/疏水性平衡的策略（图3c）。通过利用2-氨基对苯二甲酸在AAO纳米通道上可控地原位组装配位聚合物（CPs)来调节亲水/疏水平衡，以促进HCHO检测。研究发现CP/AAO异质体中的疏水/亲水平衡对于HCHO的有效检测起到了重要作用。疏水的AAO屏障层有助于支撑限制效应，而亲水性CPs可以最大限度地降低接触电阻并增加活性胺单元的数量，从而促进HCHO富集和反应，更有效地形成亚胺。对HCHO的定量分析，经过优化的CP/AAO展现出从10 0 pmol/L1mmol/L的宽线性检测范围2.3生物大分子的检测2.3.1蛋白质的检测蛋白质是生命的物理基石，它们在生物体的结构功能、催化调节、运输和储存等方面发挥着重要作用，对蛋白质的高灵敏检测有助于深入了解生物过程。蛋白质由2 0 种不同的氨基酸组成，这些氨基酸折叠成不同的空间构型，造就蛋白质特定的3D结构32)。核酸适配体是一类短单链DNA（s s D NA）、RNA（s s R NA)或XNA（异种核酸，一种合成核酸类似物），可以通过核苷酸碱基互补配对、氢键、T-T堆积和静电作用力等多种相互作用力发生自身适应性折叠后形成特定的三维结构来适应具有高亲和力和特异性的靶标3。基于此,Xia等34 将凝血酶适配体通过共价键固定在离子通道的外表面来检测血清中的凝血酶（图4a）。当目标生物分子与适配体发生反应时，会阻塞通过纳米通道-离子通道的离子流动，同时表面电荷和空间位阻效应也会影响传质性能的变化，利用电化学检测器可以实时监测传质性能的变化。在最佳pH值条件下，凝血酶的检测限可以低至0.2 2 fmol/L。同样,Kuang等35 通过对金纳米颗粒进行功能化修饰粘蛋白1（MUC1)适配体和自组装，制备了具有高比表面积的离子通道（图4b）。通过调控金纳米膜阳极氧化铝离子通道的最佳层数，并在层间编码适配体，建立了离子整流比与MUC1浓度之间的关系，实现了对MUC1的高灵敏检测。随着2 0 19 年冠状病毒的爆发，快速、高度特异性和灵敏性的检测试剂盒的研发成为研究热点。现有的综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)检测方法主要基于酶促反应，需要昂贵的试剂，限制了在资源匮乏地区的普及使用。基于此,Li等36 设计了一种新的即时检测工具。如图4c所示，使用S1适配体对多孔阳极氧化铝（PAA)进行功能化，以特异性捕获和检测SARS-CoV-2刺突S1蛋白。当靶标被适配体捕获时，纳米通道表面的空间阻碍和电荷密度的变化将影响离子传输，导致电流大幅下降。结合电化学技术，SARS-CoV-2刺突S1蛋白无需酶促反应，一步灵敏地检测SARS-CoV-2,检测限低至1fmol/L，且检测结果与RT-PCR结果完全一致，实现了快速、简便和高灵敏检测。蛋白质水解是指用酶将蛋白质分解成多肽和氨基酸，是一种不可逆的翻译后修饰过程37 。当当纳米通道上的探针被蛋白酶水解后，由于固态纳米通道的“限域效应”，引起表面电荷或者空间位阻变化导致固态纳米通道的离子电流发生显著的变化，从而有“信号放大”的作用38-39 。基于此，Li等40)构建了非对称纳米通道原位自组装肽,用于监测细胞质基质中的基质金属蛋白酶（MMP)（图5a）。在固态纳米通道的表面修饰短肽单元，建立仿生细胞/细胞质基质界面，当MMP与多肽连接位点发生反应时，离子电流发生变化，实现对细胞外基质中MMPs的动态监测。此外,Xia等41 提出了一种利用纳米通道外表面的润湿性变化来检测肿瘤标志物的策略。研究人员在纳米通道的外表面修饰了一种含有92第41卷应用化学aAptamerProteinbMUC1KCIKCKCIS1Aptamer-2koumen-st-4SARS-CoV-2-6SpikoProteinS1100.5000510Potential(M)图4（a)凝血酶识别检测原理示意图34；（b)基于Au-AAO离子通道检测MUC1的示意图35；（c)用于检测SARS-CoV-2的适配体功能化纳米通道示意图36Fig.4(a)Schematic diagram of the principle of thrombin recognition detection4;(b)Schematic illustration of thedetection of MUC1 based on the Au-AAO ion channel 351;(c)Schematic illustration of the aptamer-functionalizednanochannels for one-step detection of SARS-CoV-2136l亲水部分（CRRRR）、M M P-2 切割部分（PLGLAG）和疏水部分（Fn）的两性肽探针（图5b）。在MMP-2的作用下，由于疏水部分的释放，外表面的亲水性会增加，从而导致离子电流的增加。研究人员还通过调节亲疏水部分中苯丙氨酸（F）的数量（n），将检测限降低到1ng/mL（n=6），相比于n=2时提高了50 倍。除了高灵敏的检测MMP-2,该研究还证明了MMP-2的表达与细胞周期有关，在G1/S期表达水平最高。除以上2 种策略，Majumdar等42 通过调控固态纳米通道的表面电荷进行蛋白酶的检测（图5c）。选择胰蛋白酶作为检测方案的示范，当胰蛋白酶切割涂在二氧化硅纳米通道表面的聚-L-赖氨酸时，纳米通道表面电荷密度发生改变，通过监测纳米通道的离子导电性，实现对胰蛋白酶的灵敏检测，结果表明纳米通道传感器的灵敏度可达到5ng/mL除以上提及的非共价识别和酶水解多肽外，利用蛋白质上富含的琉基基团也可实现蛋白质的检测和蛋白质状态的鉴定。具体来说,近来Lou等3开发了一种含马来酰亚胺基团的四苯乙烯基(MI-TPE)外表面探针修饰的纳米通道阵列传感平台通过输出光电双信号实现未折叠蛋白质的检测，此外，根据单个硫醇基团的变化还可以用来区分蛋白质的折叠和未折叠状态的能力(图6)。半胱氨酸是最少暴露在折叠蛋白质表面的残基,蛋白质的展开将增加暴露的半胱氨酸硫醇基团,通过在纳米孔道外表面修饰可以与硫醇结合的MI-TPE探针，当纳米通道阵列外表面探针MI-TPE与硫醇结合后，由于MI-TPE的光致电子转移淬灭以及分子内运动的抑制，外表面上的MI-TPE荧光团被激活。同时,外表面增加的表面电荷密度也导致了跨膜离子电流的增强。通过这种机制,该平台能够识别含有不同疏基数量的模型蛋白质的折叠和未折叠状态，且2 种信号的整合为特定蛋白质构象提供了一个明显的信号，从而提高识别的可靠性。基于对细胞中未折叠蛋白含量的高灵敏度检测,有望实现正常细胞和亨廷顿病突变细胞的准确区分。93第1期袁丽珍等：基于外表面修饰的固态纳米通道用于生物标分析的研究进展eetaPeptideSelf-AssemblyEcMproteasessecreated bytumorcellsDisintegratedK+cr1MMP-2OtherMMPsCPLGVRKLVFFKKbHydrophobicMMP-2deavageMMP-2siteresiduecleavageMMP-2HydrophiioPoSnAAO-AUPOs-AAO-AUHyaroghilieAAOAUAAO-AUC12b10Polylysine8工2Trypsin010101102103104105TrypsinConcentrationng/ml图5（a）PA A 上的肽自组装用于动态监测仿生细胞/细胞质基质界面的MMP示意图140)；（b)多肽探针功能化的固态纳米通道检测MMP-2的示意图41l；（c)胰蛋白酶裂解胰蛋白酶-聚-L-赖氨酸反应实验程序示意图742Fig.5(a)Schematic diagram showing the peptide self-assembly on the block layer of PAA for dynamic monitoringof MMP activities at the biomimetic cel/ECM interfacel0);(b)Schematic of the solid-state nanochannel detection ofMMP-2 by peptide probe functionalization*l;(c)Schematic drawing of experimental procedures for the trypsin-PLLcleavage reaction1422.3.2多糖的检测多糖在大多数生物过程和事件的发展和维持中起着重要作用，包括细胞间相互作用、癌细胞转移和免疫系统活动(44。某些疾病的产生和发展通常也伴随着蛋白质糖基化(45。目前,已经开发了一些用于检测细胞表面多糖的方法，例如质谱46 、核磁共振47 、色谱法48 、光谱测定法49 和电化学技术50 ，上述方法大部分需要预富集，并且通常需要大量样品。当样品资源稀缺且昂贵时，分析将变得具有挑战性。因此，非常需要开发检测简单、小型化、灵敏高和特异性强的传感器。基于此，Wang等51设计了基于纳米通道-离子通道的超灵敏、无标记检测细胞表面糖类的方法（图7）。研究利用PAA的非对称纳米通道-离子通道以及由纳米通道阵列引起的放大离子电流和由非对称几何引起的离子电流整流效应，赋予PAA灵敏的离子电流响应。固定在纳米通道-离子通道表面的刀豆蛋白A能与多糖特异性结合，基于此原理构建的纳米流体器件可用于实时和无标记的选择性识别和检测糖基。此外，由于离子通道的亚纳米尺寸，探针固定和糖类识别在PAA的外表面上进行，避免了样品对PAA纳米通道的堵塞。结果表明，可以成功检测浓度在10 fmol/L10nmol/L范围内的糖类，检测限约为10 amol/L,明显低于大多数先前的工作。94第41卷应用化学Current signalsFluorescencesignalsPosnanochannelarray+FPPofPoS+FPVoltageKCurrent signalsPos+UFPInputOutputPos+UFPosPUnfuldeu.proteinVoltage(UFP)FluorescencesignalsOS+URPPOS+URPMI-TFanti-interferenceprobeatos(Aos)AFProbeatos(Pos)Unfoldedreduced proteinVoltage(URP)xLowtransmembraneHightransmembraneioniccurrentioniccurrentxLowfluorescenceVHighfluorescenceactivationqulescentstateactivatedstateOHYAAOmembraneAuMEAMCHMI-TPEMI-TPE+Proteinunfoldinglonic current图6用于鉴定未折叠蛋白的外表面功能化纳米通道阵列的示意图43Fig.6Schematicrepresentation of POSfunctionalized nanochannel aray used to identify unfolded proteins4sjBareOAPTESAPTES30?GAGAConAGly0?COnA-30Cellsurface-60glycan-1.0-0.50.00.51.0Potential(V)图7PAA膜表面改性检测多糖原理示意图511Fig.7Schematic diagram of the principle of PAA membrane surface modification detection of polysaccharides2.3.3核酸的检测核酸包括脱氧核糖核酸（DNA)和核糖核酸（RNA）,是由许多核苷酸单体组成的生物大分子化合物，是生命中最基本的物质之一。微小RNA(miRNA)被认为是癌症诊断和预后中的一种生物标志物52 ,近几年发展的检测方法通常需要大量的样本，对于一些样本稀缺或价格昂贵的样本的检测是非常困难的53。因此，开发用于miRNA检测的小型化、高灵敏度和特异性的生物传感器仍然具有挑战性以及重要的临床意义。Xia等54 开发了一种生物仿生纳米通道-离子通道杂交系统，结合电化学检测器，用于无标记、超灵敏地检测细胞中的miRNA（图8 a）。首先，在纳米通道-离子通道杂交膜的外表面固定了单链DNA（s s D NA)作为探针，ssDNA可以与细胞中的目标miRNA杂交。由于杂交系统的独特传质特性，可以使用电化学技术实时、灵敏地监测DNA-miRNA杂交动力学。该系统可以轻松检测到0.1fmol/L0.1mol/L的miRNA，检测限为15.4amol/L,远远低于大多数报道的工作。更重要的是，由于离子通道的超小尺寸,DNA探针的固定和杂交过程可以在离子通道的外表面进行，有效避免通道的阻塞和损坏，从而显著提高了可重用性和准确性。95第1期袁丽珍等：基于外表面修饰的固态纳米通道用于生物标志物分析的研究进展DNA被认为是纳米通道分析中强大的探针，能够解决特定目标识别和高效信号转换的问题，这是由于DNA具有可编程和可预测的Watson-Crick碱基配对。因此，它可以通过已验证的扩增技术,如PCR和滚环扩增(RCA),被植人到具有数百到数千个碱基对的DNA扩增子中5-6 。Gao等57 提出了一种集成的纳米通道分析策略，通过将高负电荷的RCA扩增子固定在纳米通道外表面上，实现了通过空间电荷效应增强离子信号的目标识别（图8 b）。由于高负电荷的RCA扩增子具有10 0 nm的尺寸，离子电流急剧增加了7 454%。在孔径（2 6 8）nm的聚对苯二甲酸乙二酯膜的单个纳米通道的外表面上，由miRNA-21触发的RCA扩增子实现了对miRNA-21的单碱基错配检测，灵敏度达到了6 fmol/L。理论和实验结果均表明，离子信号随着每个纳米通道的局部表面电位的增加而增加，并通过降低纳米通道的孔隙率密度而进一步增强。该体系利用DNA作为识别分子，构建了一个高灵敏度和特异性的传感平台，对于操纵离子传输，离子电路的潜在逻辑门控和渗透能量转换的潜在离子筛选方面具有应用前景。aX0.3BareAPTMS0.2SSDNAAPTMSSSDNAmiR-10bmiR-10D0.10.0-0.1-1.0-0.50.00.51.0Potential(M)b3Targetlonic signalenhancedbyRCAampliconPhimerAnnealingLigationPhi29T4Dntp图8（a)纳米通道-离子通道杂化物表面改性和检测miRNA示意图54）；（b）D NA 靶标通过T4多核苷酸激酶反应触发的RCA过程示意图57 Fig.8(a)Illustration of surface modification and miRNA detection on the nanochannel-ionchannelhybrid54);(b)Schematic illustration of the RCA process triggered by DNA targets through the T4 polynucleotidekinase reaction illustration of surface modification and miRNA detection on the nanochannel-ionchannel hybrids2.4细胞的检测癌症统计数据显示,9 0%的癌症相关死亡是由癌症转移引起的58 。当肿瘤细胞从原发肿瘤部位转移到外周血时,它们将成为循环肿瘤细胞(CTCs）。因此,在早期发现CTCs对癌症的有效治疗具有重要意义(39-0。Wang等11提出了一种利用纳米通道-离子通道杂交体与电化学检测技术相结合的方法，实现对CTCs的高效捕获和灵敏检测（图9 a）。通过在孔径 50 nm的AAO离子通道表面固定可以选择性地与CCRF-CEM（一种CTC)细胞膜上高表达的跨膜受体蛋白酪氨酸激酶7 结合的适配体探针sgc8c，实现对CTCs的选择性捕获。被捕获的CTCs有效地覆盖离子通道人口，从而阻塞了纳米通道-离子通道杂交体中的离子流动，导致传质特性的变化。此外，由于阵列通道相对于单一通道具有放大响应的特点，检测灵敏度可以大幅提高。对于急性白血病CCRF-CEM,该体系成功检测到110 2 10 个cell/mL,检测限为10 0 个cell/mL。本方法为CTCs的捕获、检测和释放提供了一种简单、灵敏和无标记的技术，在癌症的早期临床诊断和治疗中具有巨大的潜力。然而，纳米孔道小的表面积和相对光滑的表面是有效捕获细胞的一个大挑战。离子通道的超小尺寸可能会阻止相对较大的药物分子或带负电荷的分子不能通过，这会限制其在细胞下游分析中的应用，如药物分析运输、筛查和癌症治疗。Li等6 2 构建了灵敏的多模态（化学、电和光学)平台来研究细胞原位行为。通过树状聚合物（聚酰胺,PAMAM)和二硫化碳连接AuNPs,形成树枝状聚合物-Au纳米颗粒网络(DAN)薄膜，原位自组装到孔径 40 nmAAO的表面形成了DAN/AAO杂交膜（图9 b）。由于AuNPs的高表面-体积比和PAMAM的高密度结合位点,形成的网络形成更大的表面积，从而暴露更多的功能基团，导致DAN/AAO杂交膜上更加不对称的结构和表面电荷密度分布，从而导致明显的整流离子96第41卷应用化学1.0VblankcapturereleaseKCICCRF-CEMBenzonaseNucleaseCBenzonasenucleaseModificationK*Cellsgc8cCaptureBlankCaptureReleaseReleaseDetectionPotential(V)图99（a）纳米通道-离子通道杂化体上CTC捕获和释放过程的示意图6 1；（b）C T C 捕获和释放过程的示意图以及DAN/AAO混合体的相应I-V曲线6 2Fig.9(a)Diagrammatical illustration of the CTCs capture and release process on the nanochannel-ion channelhybrid 61;(b)Schematic demonstration of the CTCs capture and release processes and the corresponding I-V curvesof the DAN/AAO hybrid c2(ICR)输运。DAN/AAO杂化表面上氨基的存在使阴离子选择性杂化膜能够产生ICR现象，也能促进阴离子选择性。此外，ICR性质可以通过电解质溶液的离子价态和pH值来调控。ICR增强了制备的DAN/AAO杂交膜生物分析的能力，可以实现对CTCs的灵敏捕获和检测，检测限为8 0 个cell/mL,并具有良好的可重用性3结论与展望综上所述，随着固态纳米通道的进步，基于外表面功能化固态纳米通道的生物传感器可以在基于离子信号的变化下实现对离子、小分子、蛋白质、多糖、核酸和细胞等一系列靶标的高灵敏检测毫无疑问，基于外表面功能化固态纳米通道在生物标志物检测方面取得了重大进展。然而，在生物标志物检测方面仍然存在一些挑战。例如，实际样品中的检测通常需要进行繁琐的预处理，希望外表面功能化固态纳米通道的检测能够实现简化甚至消除对样本的预处理。此外，复杂环境中生物标志物产生假阳性信号，导致对生物过程的错误判断或相关疾病的误诊，希望外表面功能化固态纳米通道可以实现复杂环境中那个多样本的同时检测，从而显著提高诊断准确性。最后，基于纳米通道传感器的传感原理尚不清楚，当静电效应、尺寸排阻效应和润湿性变化3种效应同时影响靶标与探针分子相互作用时的离子电流时，目前的技术无法判断哪种效果在目标识别中起主要作用。无论如何，基于外表面功能化固态纳米通道的研究远未结束。随着先进的微纳米加工和表征技术的快速发展，我们相信在不久的将来，基于外表面功能化固态纳米通道可以取得令人振奋的成就。参考文献1淳彩璞，王凌志，赵宏，等乳腺癌生物标志物研究新进展J兵团医学，2 0 2 3，2 1（4）：57-59.CHUN C P,WANG L Z,ZHAO H,et al.New progress of breast cancer biomarkers researchJJ.J Bingtuan Med,2023,21(4):57-59.2 CASTRO SESQUEN Y E,SARAF S L,GORDEUK V R,et al.Use of multiple urinary biomarkers for early detection ofchronic kidney disease in sickle cell anemia patients J.Blood,2020,136(Supplement 1):30.3 YAN B.Photofunctional MOF-based hybrid materials for the chemical sensing of biomarkers J.J Mater Chem C,2019,7(27):8155-8175.4 XU D,XIAO H,WANG S,et al.Universal and sensitive drug asses