松材线虫病防治核心技术专业方案修订版.doc

松材线虫病防治技术方案（修订版）此件为国家林业局相关印发松材线虫病防治技术方案（修订版）通知（林造发35号）附件，请结合当地实际落实落实。为保护中国森林资源安全和造林绿化结果，促进经济和生态建设稳步发展，遏制松材线虫病严重发生和扩散蔓延势头，提升防治成效，特制订本方案。一、疫情普查监测（一）疫情普查1普查范围本行政区辖内全部松林。关键是和疫区毗邻地带、交通沿线、港口、风景区、松木制品生产和使用单位、建筑工地、仓库、驻军营房、城镇、木材集散地、移动通讯站、电视发射台、高压线塔、电缆线路、光缆线路及高压线路等地域周围松林。2普查内容（1）疫情发生区查清发生分布范围、发生面积（以小班面积为准，孤立松林以实际面积统计）和病死树数量，绘制发生分布图表（省级到县级、县级到小班），计算病死树株率和经济损失，掌握疫情发生情况，为制订年度防治计划提供依据。（2）非疫情发生区查清发觉枯死松树分布地点、树种、面积、枯死株数、松褐天牛危害情况，绘制松树枯死情况分布图表（省级到县级、县级到小班）。3普查时间通常地域每十二个月普查工作不得少于1次。在松褐天牛十二个月两代地域普查时间为910月份；松褐天牛十二个月一代地域普查时间为810月份。关键区域每十二个月普查工作最少2次，除在秋季开展普查外，在春季还应开展疫情普查工作。松褐天牛十二个月两代地域在45月份进行；松褐天牛十二个月一代地域在34月份进行。4普查方法（1）踏查。依据当地松林分布特点，设计出便于观察全部林分踏查路线；沿踏查路线用目测方法或借用望远镜查找有没有当年枯死树，或针叶褪色，或针叶黄化，或针叶枯萎，或针叶呈红褐色等症状松树，选择取样对象。（2）详查。依据踏查结果，对可疑发病林分深入抽取一定数量样品，进行分离判定，确定是否发生疫情。（二）疫情监测1定时巡查监测还未发生松材线虫病地域，以县（市、区）为单位，组织专业技术人员每个月对关键地域（见普查范围）周围松林进行巡查，凡发觉松树有感病症状，立即取样分离判定，确定是否有松材线虫。2定点监测在发生区边缘地带设置固定监测点，定时调查，发觉松树枯死立即取样分离判定，确定是否有松材线虫。3其它辅助监测技术（1）打孔流脂监测在松材线虫病发生区或其边缘，选择外观正常、针叶无显著变色松树，用直径1厘米1.5厘米打孔器或皮带铳子在松树主干上打一可见木质部圆孔（孔位尽可能选择垂直位置），观察打孔后松脂流出情况，初步判别健康树和疑似罹病树。春、夏、秋季，打孔后二十四小时即可进行观察，冬季打孔后48小时72小时进行观察，对流脂情况进行判别：一级流胶（健康树）：松脂从孔口流下，超出孔口边缘；二级流胶（疑似罹病树）：松脂沉积在孔口下缘；三级流胶（疑似罹病树）：松脂渗出到圆孔壁上，呈粒状；四级流胶（疑似罹病树）：孔壁上无松脂流出。对疑似罹病树进行取样分离镜检，确定是否有松材线虫。要注意松树树种之间流脂差异，马尾松要较黑松表现迟缓。（2）诱捕器监测于松褐天牛羽化期在林间设置诱捕器诱捕松褐天牛活体进行监测。每个诱捕器之间距离为100米，诱捕器下端距地面1.5米左右。将诱捕到松褐天牛成虫活体剪碎后用贝尔曼漏斗法进行分离，再判定是否携带松材线虫。一旦发觉松褐天牛携带松材线虫，则在诱捕点周围100米范围内对枯死松树和濒死松树进行取样分离判定，确定疫情发生地点。严禁在疫情发生林分边缘使用，预防疫情向外扩散蔓延。（3）线虫检测管监测在树干上用电钻（木工钻）钻一可见木质部圆孔，插入线虫检测管。14天后拔出检测管，经过检视管壁凝结水内有没有蠕动线虫，再判定是否为松材线虫。具体技术操作规程参见附录1。（4）航空遥感监测对地面不易调查高山密林地域，采取航空遥感技术进行监测，发觉枯死树后，再依据全球定位系统指示位置开展实地调查。实施航空遥感监测，要利用差分方法对机上显示地理位置进行校正。（三）取样1取样方法（1）取样部位通常情况下在树干下部（胸高处）、上部（主干和主侧枝交界处）、中部（上、下部之间）3个部位取样。如仅部分枝条表现症状，要在树干上部和死亡枝条上取样。如外部表现症状显著可在胸高处取样。在春季松褐天牛化蛹期，可在蛹室周围取样。（2）取样时在取样部位剥净树皮，直接砍取100克200克木片；或剥净树皮，用手摇钻从木质部至髓心钻取100克200克木屑；或在取样部位分别截取2 厘米厚圆盘。（3）取样时应排除人畜破坏、森林火灾、其它病虫害等原因造成枯死树。（4）取样时应考虑以下原因：松材线虫病发病高峰期通常在910月，从表现出针叶变黄、树脂分泌降低甚至停止至死亡约1个月至1个半月。在松林中通常是优势木先发病。因为不一样地域种源松材线虫致病性、松树抗性差异等原因，部分松树仅部分枝条表现感病外部症状。这种症状在混交林中表现尤其显著。抽取样品要立即并关键抽取还未完全枯死或刚枯死优势木（针叶呈黄绿或黄褐色，还未完全枯萎，树皮还未脱落，材质还未腐朽）。（5）所取样品要立即贴上标签（统计样品号、采集地点、树种、树龄、取样时间和取样人等）。2抽样数量以林业小班为单位，表现经典症状松树在10株以下时全部取样；10株以上时先抽取10株，再选择其它数量1%5%。3样品保留和处理取回样品应立即分离判定，若需要保留可采取以下方法：将木片装入塑料袋内，扎紧袋口，在袋上扎多个小孔（也可直接保留木段、圆盘），放入4冰箱。若需长久保留，要常常在样品上喷水（通常在半个月至1个月内完成份离判定）。样品分离判定结束后应立即对样品进行销毁。注：松材线虫普查监测工作具体技术操作规程参见国家标准松材线虫普查监测技术规程（GB/T 23478）。（四）分离判定1线虫分离将取回样品在室内采取贝尔曼漏斗法或浅盘法进行线虫分离，分离时间通常需12小时以上。将分离液体搜集到试管或烧杯中，经过自然沉淀或离心后进行镜检。2线虫培养（1）疫木保温保湿培养：将样品锯成小段，置于烧杯中加少许清水，木段下端浸在水中，木段上端用湿纱布覆盖，在30条件下保温保湿培养3天，倒取杯中水液，可取得较多雌雄成虫；或将样品木段合适浸湿，放于塑料袋里，扎紧袋口，置于30培养箱中3天取出重新分离，可取得较多雌雄成虫。（2）单异活体培养：制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板。用盘多毛孢（Pestalotia spp.）或镰刀孢（Fusarium spp.）或灰葡萄孢（Botrytis cinerea）培养线虫。无菌条件下将多毛孢或镰刀孢或灰葡萄孢接种在PDA平板上，置于2528恒温培养45天，菌丝长满平板时接种线虫。多毛孢或镰刀孢在30恒温条件下保湿培养线虫，接种20条幼虫，48小时即可分离判定，线虫量少时可对应延长培养时间。灰葡萄孢在25恒温培养线虫，培养时间要加长13天。3玻片制作（1）临时水玻片制作：在洁净载玻片中央滴一水滴，水滴量以加盖玻片后恰好充满盖玻片下空间为好。用细针挑取，或用毛细滴管吸收线虫置于载玻片水滴中，并使之沉底。将有线虫载玻片在酒精灯火焰上往返经过56秒，杀死线虫。用细针摆好水滴中死线虫，然后用镊子夹盖玻片从一侧轻轻盖下。（2）半永久玻片制作：将分离所得线虫液，转移至离心管中，转/分离心3分钟。吸去上部清水并保留底部34毫升线虫液，置于53热水中15 分钟杀死线虫，待冷却后，加入等体积TAF液固定48小时以上。再用上述方法再离心，用微量移液器吸收离心管底部线虫液，滴加进装有2 毫升棉蓝乳酚油钟面皿中，置恒温烘箱中45脱水二十四小时。在载玻片上加上封片蜡圈，用挑针加一小滴甘油于蜡圈中心位置。解剖镜下挑取脱水后目标线虫于甘油中，使其沉底并在甘油滴中心位置。在封片蜡圈上放置盖玻片，转移至控温电热平板上，保持75使蜡完全融化，取下并自然冷却后用透明指甲油加封一次。4判定（1）常规显微镜形态判定（仅适适用于雌雄成虫，以雌成虫为主）：将制作好玻片置于显微镜下观察其形态，判别是否为松材线虫。注：松材线虫分离、培养、镜检技术操作规程参见国家标准松材线虫病检疫技术规程（GB/T 23476）（2）分子检测（适适用于各虫态）：松材线虫分子检测技术采取实时PCR检测技术，操作规程见附录2。所需仪器和试剂可和国家林业局危险性林业有害生物检验判定技术培训中心联络。二、疫情汇报、公布和撤销（一）疫情确定1新发觉疫情省（区、市），疫情判定以国家林业局全国危险性林业有害生物检验判定技术培训中心或国家林业局林业有害生物检验判定中心判定结论为准，由国家林业局最终确定。2新发觉疫情县级行政区，疫情判定以省级以上森防机构或国家林业局认可教授判定结论为准，由省级林业主管部门最终确定。（二）疫情汇报1普查结果汇报：春季普查汇报应在5月份、秋季普查汇报应在11月份汇报国家林业局；汇报中应附年度松材线虫病监测普查统计表和年度松材线虫病发生情况统计表。2月汇报：各省（区、市）森防机构定时以电子邮件和书面形式同时向国家林业局森防总站报送松材线虫病除治工作进展情况。实施定时除治（集中在秋季普查后至翌年松褐天牛羽化前开展疫木除治），每个月报送一次；实施常年除治，每三个月报送一次。疫情监测情况每个月报送一次。3新发疫情汇报：在疫情监测中，一旦经技术判定证实新发觉松材线虫病，当地林业主管部门应在一周内逐层将发生地点、发觉日期、林分情况、发病面积、病死树数量等汇报国家林业局和当地人民政府。（三）疫情公布国家林业局依据全国松材线虫病疫情调查结果，每十二个月正式以公告或新闻公布会等形式公布松材线虫病疫情信息。（四）疫情撤销1当疫情发生区经过有效手段根除疫情后，由国家林业局以公告或新闻公布会等形式宣告该地解除疫情。2撤消疫情应满足下列条件之一：经过有效手段根除后，分布区中没有松材线虫寄主植物。经过有效手段根除后，连续3年疫情普查监测中没有发觉松材线虫。三、防治方法（一）计划设计1各省（区、市）林业主管部门依据国家林业局总体布署和本省（区、市）松材线虫病秋季普查结果，制订本省（区、市）松材线虫病防治方案。2各县级疫情发生区依据本省（区、市）松材线虫病防治预案，结合当地松材线虫病传输规律、发生区地理位置、林分用途、发生面积、危害程度等原因，以县级行政区为单位，进行防治作业设计。作业设计要划分不一样治理类型，实施分类施策，分区治理。内容包含不一样类型区特点、范围、面积、治理对策和技术方法。面积、技术方法和工程量要落实到林业小班，并绘制施工作业图、表和文字说明。3防治作业区以实际发生林份边缘为基准，向外延伸一定范围作为缓冲区。缓冲区按发生区处理。（二）疫木除治1皆伐适用范围：需要立即根除疫点，如孤立疫点、新发生疫点、区域位置关键疫点等。另外，在病死树率高而且松林无保留价值地方（或松树数量不占关键百分比混交林）也可采取。作业要求：防治作业区以实际发生林份边缘为基准，向外最少延伸100米。在松褐天牛成虫羽化前由外向内皆伐全部松材线虫寄主植物，全部伐除病死树、活树、直径超出1厘米枝条均须作除坏处理，并应在松褐天牛成虫羽化前完成；在操作许可条件下，病死木伐桩高度不得超出5厘米。2疫木清理适用范围：自然保护区和关键风景林区及其它特殊用途松林等必需保留松树林份、大面积松林且连片发生无法短期内根本根除疫情地方。作业要求：防治作业区以实际发生林份边缘为基准，向外最少延伸米。在松褐天牛成虫羽化前（松褐天牛十二个月一代地域为10月至翌年4月；松褐天牛十二个月两代地域为7至8月和11月至翌年3月）由外向内伐除包含病死松树、疑似感病木、衰弱木、受压木、风折木、旱死木、雪压木、当年枯死或已经萎蔫侧枝和多种人为乱砍滥伐松树枝、干及伐桩等，全部伐除松木及直径超出1厘米枝条均须作除坏处理，并应在松褐天牛成虫羽化前完成；在操作许可条件下，伐桩高度不得超出5厘米。注意事项：中国松材线虫病造成松树枯死存在越年病枯死现象，所以在松褐天牛羽化前应对防治作业区出现枯死松树再清理一次。注：松材线虫病疫木清理技术操作措施参见林业行业标准松材线虫病疫木清理技术规范（LY/T1865）3疫点封锁适用范围：病害发生面积大，危害严重，实施皆伐或清除感病木难度大，且不会造成疫情自然扩散地域可采取全方面疫点封锁方法。作业要求：严禁砍伐疫点内全部寄主植物，包含枝条。4伐桩处理病死木砍伐后伐桩可选择以下方法之一进行除坏处理：伐桩全部连根挖出后集中除坏处理。枯死松树伐桩全部去皮后喷16%喹硫磷丁硫克百威乳油1100倍液至伐桩湿透（或磷化铝12粒），再加套0.8毫米以上厚度塑料农膜袋并在四面压土。也可使用国家林业局推荐其它药剂。（三）松褐天牛防治1设置诱木防治适用范围：采取疫木清理方法松林。作业要求：在发生区内选择衰弱或较小松树作为诱木引诱松褐天牛集中在诱木上产卵，每10亩设置一株，并用GPS定位。于松褐天牛羽化早期，在诱木基部离地面3040厘米处3个方向侧面，用刀砍34刀（小树可少些），用注射器把引诱剂注入刀口内。诱木引诱剂使用浓度为13（1份引诱剂原液用3倍清水稀释）。施药量（毫升）大致和诱木树干基部直径（厘米）树相当。于每十二个月秋季将诱木伐除并进行除坏处理。或直接在林间放置新鲜松木段引诱松褐天牛集中在诱木上产卵，待产卵期后集中除坏处理。注意事项：严禁在疫情发生林分边缘使用，预防疫情向外扩散蔓延，同时要加强诱木管理，严防诱木流失。2化学药剂防治适用范围：全部松材线虫病发生区。作业要求：防治作业区以实际发生林分边缘为基准，向外最少延伸米。使用噻虫啉（也可使用国家林业局推荐其它药剂）在松褐天牛羽化早期和第一次药剂使用期末连续2次采取飞机，或地面喷药方进行松褐天牛防治。使用药剂和方法见附录3。或在松褐天牛幼龄幼虫期，对树干喷洒16喹硫磷丁硫克百威乳油80倍液，从树桠到树干基部，全株喷洒均匀。3天敌防治（1）利用管氏肿腿蜂或川硬皮肿腿蜂防治放蜂时间：通常在松褐天牛幼虫幼龄期，气温2528，相对湿度6070晴天放蜂。放蜂方法：单株放蜂：在零星危害林分，采取单株放蜂。放蜂时，在树干上斜插一根大头针，将蜂管棉塞打开后，蜂管倒插在大头针上，管底略高于管口，以预防雨水浸入。也能够把蜂管口倒插在树木枝桠上。中心点放蜂：在较大面积被害林分，采取中心点放蜂。每10亩林地布设一个放蜂点，每点放蜂1万头左右。放蜂时，依据平均每玻管含蜂量推算每个放蜂点放置蜂管数量，将蜂管棉塞打开后，蜂管平摊在靠近若干株松树地表中央，让蜂自行在林间扩散寻求寄主。（2）利用诱木+花斑花绒寄甲卵块或成虫防治在松褐天牛种群数量较低松林，每亩林地设1株至2株诱木；当该诱木中松褐天牛幼虫发育到2龄至3龄时，伐倒诱树，每株诱木释放花斑花绒寄甲卵1000粒或释放成虫20对。操作方法是：利用人工繁殖花斑花绒寄甲卵堆，按卵堆自然大小剪成每块含80粒至200粒卵卵块，制成卵卡，将卵卡用订书机均匀钉到树干上。释放成虫于下午黄昏时候进行，直接将成虫释放到树干基部即可。（3）直接在松林中释放花斑花绒寄甲卵块或成虫防治在松褐天牛种群数量较低林分，每亩松林选择松树枯死木或有松褐天牛危害松树4株至5株，作为直接释放花斑花绒寄甲卵或成虫受体，释放量为卵粒株或成虫10对株。在松褐天牛发生严重林分（在每亩松林地受害死树15株以上），按每亩释放花斑花绒寄甲卵2万粒或成虫150正确释放量释放。释放卵卡、成虫时间和操作方法同上。（4）管氏肿腿蜂或川硬皮肿腿蜂+花斑花绒寄甲卵块或成虫防治在林分内受害木中松褐天牛幼虫12龄时释放管氏肿腿蜂或川硬皮肿腿蜂，在松褐天牛幼虫发育至2龄以上时释放花斑花绒寄甲，释放量和操作方法同上。（5）注意事项在释放花斑花绒寄甲林分中，花斑花绒寄甲已寄生在死树中松褐天牛上，不要将诱木和枯死树清理出林地，可于松褐天牛羽化前砍伐集中起来，放在林中，用8目铁丝网笼罩住，待花绒寄甲羽化迁飞后将诱木集中并烧毁。（四）名松古树保护对有特殊意义名松古树可在树干上打孔注药进行保护，具体技术操作措施及使用药剂见附录4。注：松褐天牛防治具体技术方法参见林业行业标准松褐天牛防治技术规范（LY/T1866）四、防治成效检验（一）疫木除治质量检验1调查时间：除治工作结束至松褐天牛羽化前。2评价指标：实施清理林分无病死树；防治作业区伐桩高度低于5厘米，并进行处理；除治迹地不残留直径1厘米以上松树枝桠。3抽查百分比：（1）县级疫情发生区：有基础根除任务、或上年度新发生、或疫情上升、或县级自查达成基础根除目标，应该全部检验。其它县级疫情发生区检验数量不少于1/3。（2）乡镇级疫点：关键抽查新发疫点、有根除任务及区域位置关键疫点。抽查率应不少于1/2。（3）发生小班：每个乡镇发病小班1个到3个，全部检验；每个乡镇有4个以上发病小班，随机抽取3个小班进行检验。（二）防治效果检验1调查时间：每十二个月秋季。2评价指标：对照国家林业局下达年度除治任务书要求年度防治目标任务逐条检验，年度任务未提出要求地方随机抽查。五、疫木除坏处理和安全利用（一）除坏处理方法依据当地疫木数量、疫木处理能力等实际情况，在确保疫木不流失和处理质量前提下，选择以下1种或1种以上方法进行除坏处理。全部处理必需在松褐天牛非羽化期内进行。1热处理：将疫木置于热风型干燥窑，或木材专用热风（蒸汽）烘干箱内，对其进行加热处理时，在木材中心温度达成65以上后，再连续处理4小时。具体方法见附录5、6。2微波处理：将疫木制成板材或方料，利用特定疫木微波除坏处理设施设备，依据疫木含水率、厚度和温度安排微波处理时间，直至达成处理要求。具体方法见附录7、8。3集中熏蒸处理：疫木熏蒸常见熏蒸剂有溴甲烷（CH3Br）、硫酰氟（SO2F2）、磷化铝（AlP）。在远离居民区、公共场所、人口稠密地方，选择地势平坦、土壤紧密、向阳、通风良好、交通方便地方作为熏蒸场所，对疫木进行熏蒸处理，直至达成处理要求。具体方法见附录9。4制板处理：在松褐天牛非羽化期，将疫木根据胶合板、刨花板、中密度纤维板生产工序，加工制作成胶合板、刨花板、中密度纤维板，并在加工制作过程中，将松材线虫及其媒介昆虫杀死，达成除坏处理目标。疫木处理过程中枝桠和废料应在同期全部烧毁。5烧炭处理：将疫木置于炭窑中燃烧25小时后，封闭点火孔。6造纸处理：利用疫木进行造纸，在造纸生产制浆工序中将媒介昆虫和松材线虫杀死，达成疫木除坏处理目标。7烧毁处理：选择远离居民区、建筑物且交通方便地点进行烧毁。可使用易燃物引火焚烧疫木。8林间就地用作培育茯苓材料：将感病松木伐倒后，截成长度为60厘米木段，集中在林地内晾晒10天后，当木段含水量约在25%28%时，接茯苓菌种。接种后将木段放入80厘米50厘米35厘米规格坑内，坑内及段木上撒杀虫剂，再掩土填埋、压实，覆土厚度高出木段15厘米。9林间就地套袋熏蒸：将砍伐树干及直径1厘米以上树枝截成长度100厘米150厘米木段，在林间空地装入0.8厘米以上厚度塑料农膜袋里，投放56磷化铝药片进行熏蒸，用量每立方米体积20克，密封10 天15天。熏蒸袋上有警示标志(注明：处理单位、处理时间、药剂名称)。使用磷化铝熏蒸处理应在室外最低温度10以上时进行。（二）疫木安全利用疫木安全利用是指将疫木在指定厂家经过热处理、微波处理后进行利用，或在指定厂家将疫木制作胶合板、刨花板、中密度纤维板、造纸，或将疫木就地用作培育茯苓材料。有条件地方应开展疫木安全利用，以降低损失。六、检疫封锁方法（一）松材线虫病发生省份要根据森林法、植物检疫条例和国务院办公厅相关深入加强松材线虫病预防和除治工作通知要求，划定松材线虫病疫区，并在疫区周围设定4公里隔离区。（二）严格根据国家林业局相关要求，做好对辖区内生产、使用、经营松木及其制品单位和个人进行全方面登记工作，建立国家、省、市、县四级生产使用经营松木单位和个人档案，并建立厂家汇报制度。（三）要常常性地对辖区内松苗繁育基地、加工、使用、经营松木单位进行检疫检验，严厉查处非法加工、利用、经营疫情发生区松材及其制品行为。实施检疫检验抽样百分比，苗木按一批货物总件数5%进行抽样、木材按总件数10%进行抽样。所抽样品取样分离判定方法按本文“疫情监测”中“取样、分离”和“判定”栏要求进行。发觉带疫材料就地实施除坏处理（处理方法参见本文“疫木除坏处理”），切实预防松材线虫病传输。对有组织实施疫木安全利用，相关森检部门要指定专员全过程监督。（四）以县级行政区为单位，需要调入松木包装材料，调入单位或个人应向当地相关植物检疫机构申报，经审查后，视情况提出检疫管理意见，同时向调出方森防检疫机构提出检疫要求书。（五）发生区要在关键通道设置森林植物检疫检验站（或木材检验站），配置必需专职或兼职检疫人员，对运出发生区松木及制品进行检验，发觉非法调运疫木及其制品必需就地进行除坏处理。运输松材线虫病发生区松木包装材料车辆途经相关植物检疫检验站要查验相关运输单证、标志等。如发觉途经货物松木包装材料未达成标准要求，应该依法给予扣留，并通知所在相关植物检疫机构处理。可采取处理方法有：除坏处理、改变用途、退运处理、销毁等。处理费用及其损失由责任人负担。七、预防方法（一）黄山、张家界等关键预防区要采取人工清除松林内衰弱松木、施放天敌等综合方法防治松褐天牛，降低疫情发生风险；要结合造林项目，有计划地对现有纯松林进行改造；对有特殊意义松树，应采取保护剂进行关键保护。（二）其它未发觉松材线虫病疫情适生区要加强疫情监测普查，做到立即发觉立即根除。对松褐天牛虫口密度较大林分，要采取人工、化学等方法降低虫口密度。要加强对纯松林改造，增加阔叶林百分比，提升林分抗病能力。（三）加强复检工作，松木包装材料调入地相关植物检疫机构复检发觉有松材线虫或松褐天牛活体存在迹象，应采取紧急方法，如除坏处理、焚烧或作人造板、造纸原料或拒绝入境等，并将相关情况立即通知调出地相关植物检疫机构。（四）因为全球气候变暖可能造成松材线虫病适生区北移，北京、天津、河北、山西、甘肃等省份要根据上述要求加强松材线虫病预防工作，预防疫情入侵。附录：1线虫检测管检测松材线虫技术2松材线虫实时PCR检测技术3噻虫啉防治松褐天牛成虫技术方法4名松古树打孔注药保护技术5松材线虫病疫木热处理技术（热风烘干箱处理）6松材线虫病疫木热处理技术（热风干燥窑处理）7松材线虫病疫木微波处理技术（辊轴式）8松材线虫病疫木微波处理技术（隧道式）9松材线虫病疫木熏蒸处理技术附录1线虫检测管检测松材线虫技术1 适用范围松属Pinus植物活体及木材、木制品等。2 分散型松材线虫取样2.1 引诱剂配制和引诱管制备2.1.1 将蒎烯（Acros Organics，98%），蒎烯（Fluka Chemie AG，80%）和长叶烯（Acros Organics，99%），根据百分比12.71.1 配制后用 40l nhexane溶解 （Fisher Chemicals，99%）成浓度为7mg/40l引诱剂备用。 2.1.2 取样管由一个2ml离心管制成 （北京Zohonice 科技有限发展企业，北京），内装引诱剂载体橡胶头（通州顺义塑料厂，北京），将0.8%琼脂凝固在载体上方周围。取样管封口储藏在4C待用。在试验前，将40l引诱剂滴入到橡胶头，待溶剂被挥发后，进行取样。2.2 取样方法2.2.1 11月明年4月，林间松木中松材线虫属于分散型松材线虫，并聚集在松墨天牛蛹室周围。取样时，用电钻垂直打入松墨天牛椭圆形取食孔（2cm深，1cm直径），并使之和天然蛹室相通，引诱管插入取样孔，2二十四小时后拔出。2.2.2 对非当年病害原木进行调查，假如找到椭圆形松墨天牛侵入孔，即电钻垂直打入取食孔（2cm深，1cm直径），并使之和天然蛹室相通，引诱管插入取样孔，2二十四小时后拔出。3 繁殖型松材线虫取样3.1 引诱剂配制将蒎烯（Acros Organics，98%），蒎烯（Fluka Chemie AG，80%）和长叶烯（Acros Organics，99%），根据百分比10.10.01配制后用40l nhexane溶解（Fisher Chemicals，99%）成浓度为130mg/40l引诱剂备用。 3.2 取样孔横截面部位选择取样孔选择在树体南面进行打孔，深度为23cm。3.3 取样高度选择3.3.1 对于初步表现症状松树：叶失绿80%，无刻槽，枝条有天牛取食痕迹，无腐生线虫，无小蠹、白蚁危害；取样部位选择树干上部分杈侧枝处，有天牛取食痕迹部位周围。3.3.2 当症状表现为叶失绿99%，针叶红褐色，无刻槽，无小蠹、白蚁危害：取样部位为树干2m周围。3.3.3 当症状表现为下部针叶黄褐色，上部针叶红褐色。天牛刻槽多，有天牛蛀屑，有小蠹、白蚁等次生害虫危害：取样部位为树干11.5m处。3.3.4 当症状表现为枯萎死亡，刻槽多，小蠹、白蚁等次生害虫危害严重，线虫量极少，选择树干基部1m处。4 镜检室内用水将引诱管中琼脂冲出，倒入3.5cm直径培养皿中，放置片刻，在显微镜下观察线虫形态，对松材线虫加以判定。依据种特征、和近缘种区分判定是否为松材线虫。附录2松材线虫实时PCR检测技术1 检测程序松材线虫分离基因组DNA提取实时PCR扩增数据分析结果判定。2 检测试剂2.1 DNA提取试剂：线虫裂解液2.2 实时PCR扩增试剂：探针（TaqMan11）、引物对（F11/R11）、TaqMan Universal PCR Master Mix3 操作步骤3.1 线虫基因组DNA提取3.1.1 吸收23ul 线虫混合液于Eppendorf管中；3.1.2 加入18 ul F11液；3.1.3 加入2 ul预冷R11液体；3.1.4 加入17 ul双蒸水（C液）；3.1.5 在PCR仪上，于6570条件下保温处理35分钟；在95条件下保温处理10分钟；3.1.6 1rpm离心5min，上清液（X液）用于扩增。3.2 准备实时PCR扩增反应板在Eppendorf管中依次加入下列成份： 3.2.1 PCR Master MIX （K液）5 ul；3.2.2 10 umol/L TaqMan 探针（L液）0.5 ul；3.2.3 10 umol/L正向引物和负向引物（M）共0.5 ul；3.2.4 上述步骤1所提取DNA模版（X液）0.5 ul；3.2.5 灭菌双蒸水（C液）3.5 ul。3.3 创建反应板文件3.3.1 点击file下拉菜单中new（新建文件）。3.3.2 在plate Nme 栏编辑文件名，如 0916，单击Next。3.3.3 选择要添加到反应板文件探针。a.单击选择一个探针（本试验中，taqMan探针选fam，TaqManMgb探针选stdl）；b.单击add键。探针即被添加到反应板文件中；c.单击Next键。3.3.4 为每反应孔指定探针和任务。a.单击一个反应孔（对于反复，选择一组反应孔），方便选择它（们）。b.单击探针名，为反应孔选定探针。c.单击task（任务）栏下边，以指定探针任务。d.单击ues（使用）。所选反应孔中显示探针任务和颜色。e.单击Finish（完成）。SDS软件即创建反应板文件。3.3.5 输入样本名。a.单击View well Inspector（反应孔设定）。b.单击一个反应孔或选中多个反复反应孔。c.输入样本名。d.反复a至c，直到全部反应孔均指定好样本名。e.关闭well Inspector。3.4 设计热循环条件反应程序50 2min，95 10min;35个循环程序为95 15s，60 35s。3.5 运行反应板3.6 数据分析3.7 结果判读依据CT值或扩增信号均能够判读检测样品中是否含有松材线虫。3.7.1 CT值：由下表可知，单条松材线虫扩增CT值小于30，所以，在实际检测过程中，当检测样品CT值小于35时，即可很肯定地判定检测样品中含有松材线虫。但当检测样品CT值大于35或无CT值时，即可判定检测样品中不含有松材线虫。Sample1条2条3条4条5条6条7条8条CT29.617829.064428.452728.293726.314925.214824.269624.2434实时PCR扩增图谱3.7.2 扩增信号如上图，2号待测样本和4号阳性对照扩增图谱有阳性扩增信号，则2号待测样本中含有松材线虫，1号、3号待测样本和5号阴性对照没有阳性扩增荧光信号，则1号、3号待测样本中不含有松材线虫。4 松材线虫实时PCR检测仪器设备实时PCR基因扩增，离心机，冰箱，漩涡混合气，2.5ul、20 ul、200ul移液器。附录3噻虫啉防治松褐天牛成虫技术方法1 关键剂型中国林业现在关键使用剂型为2%噻虫啉微胶囊悬浮剂、1%噻虫啉微胶囊粉剂。2 使用方法2.1 2%噻虫啉微囊悬浮剂使用方法2.1.1 飞机低容量喷雾防治防治适期：在松褐天牛羽化早期和第一次药剂使用期末（约隔30日）各喷一次。药剂：2%噻虫啉微胶囊悬浮剂。方法：以18百分比稀释后按500700ml/亩用量飞机低容量喷雾。2.1.2 林间用机动喷雾机防治防治适期：同上。药剂：2%噻虫啉微胶囊悬浮剂。方法：将2%噻虫啉微胶囊悬浮剂兑水稀释倍后以ml/亩用量，用机动喷雾机喷雾，将药液喷洒在枝干、树冠和其它天牛成虫喜出没之处，以树皮微湿为宜。注意事项：忌阴雨天喷雾，若施药6小时内遇雨，药效会大大降低。正常情况下，2%噻虫啉微囊悬浮剂降雨量较少地域持效期可应达成60天以上，在连续小雨地域，其防效可达30天以上，但在施药后若遇暴雨天气和其它原因影响而造成药剂流失，应考虑补防。2%噻虫啉微囊悬浮剂还应达成以下技术指标：a.有效成份含量大于2%b.游离有效成份释放速度小于5%c.成囊率大于95%d.悬浮率大于75%e.热贮稳定性：合格f.微囊平均粒度小于5um2.2 1%噻虫啉微囊粉剂使用方法2.2.1 林间用机动喷粉机防治防治适期：同上。药剂：1%噻虫啉微胶囊颗粒剂。方法：以11.5百分比将1%微胶囊粉剂和滑石粉或高岭土拌匀后，按500g/亩用量，用机动静电喷粉机进行林间喷粉。注意事项：在郁闭度较高林区可合适加大药剂用量。喷粉时要注意风向，以顺风为宜。喷粉选择清晨林间露珠较多时为最好，方便药剂愈加好地黏附在树枝和树干上。2.2.2 利用灭虫布撒器防治防治适期：同上。适用药剂：1%噻虫啉微胶囊粉剂。药剂用量及使用方法：按11.5百分比加入滑石粉或高岭土拌匀后，制成椭圆型（长径1805mm，宽径1100.5mm）、重约1400g灭虫药包，使用便携式或车载式布撒器进行作业，每个药包防治面积为68亩。方法：检验灭虫弹标签是否和发射项目一致，查对无误后剪去标签；去掉灭虫弹尾部延期管保护帽；将延期管头朝下，用送弹器将灭虫弹送入发射器底部；将发射药管装入尾栓高压室内，拧紧击发装置；拉起击针，将拉火绳置于发射器上，发射人员退至安全距离后进行发射即可。注意事项：灭虫药包及布撒器安全管理要严格按国家林业局相关印发通知（林造发210号）实施。注：正常情况下，2%噻虫啉微囊悬浮剂降雨量较少地域持效期可应达成60天以上；在连续小雨地域，其防效可达30天以上；但在施药后若遇暴雨天气和其它原因影响而造成药剂流失，连续效果会显著下降，需要补防。1%噻虫啉微囊粉剂，还应达成以下技术指标a.有效成份含量大于1%b.微囊平均粒径小于10umc.水分含量小于2%d.游离有效成份释放速率小于5%e.热贮稳定性：合格f.流动性：合格3 其它如用其它剂型，可依据药剂使用说明书，参考上述方法使用。附录4名松古树打孔注药保护技术1 松材线虫免疫注射液1.1 使用时间：当年12月至第二年3月10日前，最好时期为当年12月至第二年1月。1.2 使用方法：用打孔器杆和树干成45夹角，夹角开口斜向上；移去或剪开注射瓶瓶尖头部，头部插入注入孔，然后再注射瓶底开出气孔，即可输液；输液结束后需封住伤口。1.3 剂量：见下表 不一样胸径松树免疫注射用药量表胸径（cm）株/m3株/m310ml/瓶50ml/瓶0.5%1%2%0.5%1%2%760.11010支20支2 3%甲维盐阿维菌素注干液剂2.1 使用时间：当年12月至第二年3月10日前，最好时期为当年12月至第二年1月。2.2 使用方法：在松树基部斜打一夹角45、方向斜向上、直径4mm、深5cm小孔；用刀片斜切注药嘴，用大头针打透气盲孔，再将注药嘴插入打好小孔中。2.3 剂量：2ml/cm胸径。（或：树木胸径15cm以下，每株注25ml一瓶；胸径2030cm，每株注50ml一瓶；胸径30cm以上，每株注50ml两瓶。）注意：注药嘴以切出注药孔即可，不宜切过大；透气盲孔扎透即可；注药瓶内药液12天时间流完为宜；树皮较厚松树，用刀刮一小块致韧皮部后再打孔。3 松线光3.1 使用时间：当年12月至第二年3月10日前，最好时期为当年12月至第二年1月。3.2 使用方法：在树干距离地面1m左右处用穿孔器打一夹角45、方向斜向上、直径约67mm，深约58cm孔。拆掉容器注入头部，注意不要漏药液，头部插入注入孔，轻击容器底部，然后用针头在底打通空气流通孔，注入药液。注入完成后，拔出空容器，然后在注入孔内插入愈合剂或木塞子盖上。3.3 剂量： 20cm以下胸径使用3支；胸径20cm以上，每增加5cm，增加