RNA提取准备工作及注意项目.doc

一、枪头和EP管等消毒灭菌
1、用去离子水配制0.1%（千分之一）DEPC（剧毒物），须在通风橱中小心使用，避光，密闭4℃保留;
DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒MiliQ纯水。经检测不含 RNase、DNase和proteinase。
2、将枪头和EP管放入0.1%DEPC内，确保枪头和EP管内全部充满0.1%DEP,
3、避光、静置、过夜（12-24 h）
4、装枪头和EP管盒子不需要用DEPC浸泡，将枪头或EP管内DEPC水大致去除干后，装起，包好
5、121摄氏度，30min
6、180摄氏度，干燥数个钟头（最少3小时以上）。
注意：a、处理DEPC时需要戴乳胶手套、口罩！
b、或不用DEPC消毒，130℃，90min高压灭菌（很多试验室高温灭菌两次）

二、RNA提取注意事项
1、组织 RNA 抽提失败两大现象是： RNA 降解和组织内杂质残留。相关降解问题，首先看一下为何从培养细胞中抽提 RNA 不轻易降解。现有 RNA 抽提试剂，全部含有快速抑制 Rnase 成份。在培养细胞中加入裂解液，简单混匀，即可使全部细胞和裂解液充足混匀，细胞被根本裂解。细胞被裂解后，裂解液中有效成份立即抑制住细胞内 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是说，培养细胞因为很轻易快速和裂解液充足接触，所以其 RNA 不轻易被降解；反过来讲，组织中 RNA 之所以轻易被降解，是因为组织中细胞不轻易快速和裂解液充足接触所致。所以，假定有一个措施，在抑制 RNA 活性同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就能够根本处理了。液氮碾磨就是最有效这么一个措施。不过，液氮碾磨方法很麻烦，假如碰到样品数比较多时候愈加会有此感觉。这么就产生了退而求其次方法：匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞和裂解液接触前怎样抑制 Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织速度比细胞内 Rnase 降解 RNA 速度快。电动匀浆器效果很好，玻璃匀浆器效果较差，但总来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象。所以，假如抽提出现降解，原来用电动匀浆器，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器，改用电动匀浆器或直接用液氮碾磨，问题几乎 100% 能取得处理。影响后续试验杂质残留问题，其原因比降解更多样，处理方法对应也不一样。总而言之，假如出现降解现象或组织内杂质残留现象，则必需对具体试验材料抽提方法/试剂进行优化。优化大可无须使用您宝贵样品：能够从市场上购置部分鱼/鸡之类小动物，取对应部分材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白质 – 用嘴碾磨，肠胃抽提。
2、抽提 RNA 目标
RNA 用于不一样后续试验，其质量要求不尽相同。cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留；Northern 对 RNA 完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出；每次全部以取得最高纯度 RNA 为目标，劳民伤财。

3、样品搜集/保留 – 影响降解原因
样品离开活体/或原来生长环境后，样品中内源酶即会开始降解 RNA，降解速度和内源酶含量及温度相关。传统上，只有两个措施能够根本抑制内源酶活性：立即加入裂解液而且根本而快速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻。这两个措施全部要求操作快速。后者适合全部样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低而且较轻易匀浆组织。具体地讲，植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等最好全部先用液氮冷冻起来，再往下做。

4、样品破碎及匀浆 – 影响降解和得率原因
样品破碎是为了根本匀浆，匀浆是为了使 RNA 根本完整地释放出来。细胞无须破碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用对应酶破壁后才能匀浆。内源酶含量较低而且较轻易匀浆组织能够在裂解液中经过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程；植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等样品，它们不是内源酶含量高，就是不轻易匀浆，所以必需将组织破碎和匀浆分开操作。最可靠而且得率最高破碎方法是使用液氮碾磨，最可靠匀浆方法是使用电动匀浆器。使用液氮碾磨要尤其注意一点：在整个碾磨过程中，样品不得融化，因为冷冻后内源酶更轻易起作用。

5、裂解液选择 – 影响操作方便程度，内源杂质残留原因
常见裂解液几乎全部能抑制 Rnase 活性，所以，选择裂解液关键是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源酶含量样品提议使用含苯酚裂解液，以增加灭活内源酶能力。

6、纯化方法选择 – 影响内源杂质残留，抽提速度原因
对于洁净样品，如细胞，手边几乎任何纯化方法全部能够取得满意结果。但对于很多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高样品，选择适宜纯化方法是至关关键。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应杂质，但价格较贵；使用经济而经典纯化方法，如 LiCl 沉淀等，也能够取得满意结果，但操作时间长。

7、RNA 抽提“三大纪律八项注意”
纪律一：杜绝外源酶污染。
注意一：严格戴好口罩，手套。
注意二：试验所包含离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，试验台面等要根本处理。
注意三：试验所包含试剂/溶液，尤其是水，必需确保 RNase-Free。
纪律二：阻止内源酶活性
注意四：选择适宜匀浆方法。
注意五：选择适宜裂解液。
注意六：控制好样品起始量。
纪律三：明确自己抽提目标
注意七：任何裂解液系统在靠近样品最大起始量时，抽分成功率急剧下降。
注意八：RNA 抽分成功唯一经济标准是后续试验一次成功，而不是得率。

8、RNase 污染10大起源
1）手指头，手指头是外源酶第一起源，所以必需戴手套而且频繁更换。另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个关键酶起源。戴手套口罩另外好处是保护试验人员。
2）枪头，离心管，移液器 – 单纯灭菌是不能灭活 Rnase ，所以枪头和离心管要用 DEPC 处理，即使是标明为 DEPC 处理过。移液器最好是专用，用前用 75% 酒精棉球搽拭洁净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。
3）水/缓冲液一定要确保无 Rnase 污染。
4）试验台面最起码要用 75% 酒精棉球搽拭洁净。
5）内源 Rnase全部组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解最好措施。液氮保留/碾磨方法确实不方便，但对有部分内源酶含量很高组织，却是唯一措施。
6）RNA 样品RNA 抽提产物可能全部会含痕量 Rnase 污染。
7）质粒抽提质粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，残留 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。
8）RNA 保留即使低温保留，痕量 Rnase 亦会造成 RNA 降解。长久保留 RNA 最好措施是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制全部酶活性。
9）阳离子 （Ca， Mg）在含这些离子时，80C 加热 5 分钟会造成 RNA 被剪切，故假如 RNA 需要被加热，保留液需要含螯合剂 （1mM Sodium Citrate， pH 6.4）。
10）后续试验所用酶酶全部有可能被 Rnase 污染。

9、RNA 抽提10大窍门
1：快速阻止 Rnase 活性样品搜集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活 Rnase。
2：选择适宜抽提方法高核酶含量组织，脂肪组织最好用含苯酚方法。
3：预判质量要求Northern，cDNA 文库构建对完整性要求高，RT-PCR， RPA （Ribonuclease protection assay） 对完整性要求不是很高。RT-PCR 对纯度 （酶抑制物残留） 要求很高。
4：根本匀浆是提升得率和降低降解关键。
5：检验 RNA 完整性电泳检测，28S：18S =2：1 是完整标志，1：1 对大部分试验也是能够接收。
6：去除 DNA用于 RT-PCR， array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。
7：降低外源酶污染 – 不能从外面又导入酶。
8：低浓度核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。但要预防助沉淀剂含酶及 DNA 污染。
9：根本溶解 RNA，必需时能够 65C 加热 5 分钟。
10：适宜保留方法 – 短时间能够 –20C 保留，长久请保留于 –80C。
提升 RNA 得率
首先要意识到不一样得样品其 RNA 含量差异很大。高丰度 （2-4ug/mg） 如肝脏，胰腺，心脏，中丰度 （0.05-2ug/mg） 如脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢，低丰度 （<0.05ug/mg） 如膀胱，骨，脂肪。
1：裂解细胞使 RNA 释放出来 – RNA 假如不被释放出来，得率是会降低。电动匀浆比其它匀浆方法效果愈加好，但也可能需要结合其它得方法，如液氮捣碎，酶消化 （Lysozyme/Lyticase）

2：抽提方法优化。基于苯酚方法最大问题是分层不根本和部分 RNA 丢失（不能全部将上清取出）。分层不根本是因为核酸和蛋白质含量高，能够用增加裂解液使用量或降低样品量处理。脂肪组织要增加一步氯仿抽提。RNA 丢失能够用反抽方法或去除有机层后再离心方法降低。基于柱离心式方法最大问题是样品过量。

10、经典抽提小技巧

1）Phenol 纯化：将等体积 1：1 Phenol/Chloroform 加入，猛烈混允 1-2 分钟。高速离心 2 分钟。小心取上清 （80-90%）。决不能取到中间层。能够使用等体积反应液加入 Phenol/Chloroform 中，一样再取出上清。将两次上清混在一起用于核酸沉淀，能够提升得率。混允时不能太温和，也不要试图取出全部上清。
2）70-80% 乙醇洗涤：洗涤时，一定要将核酸悬浮起来，才能确保残留盐被洗去。同时，在倒掉乙醇后，立即高速离心数秒，再用移液器去除残留乙醇。室温静置 5-10分钟后，溶解。

11、特殊组织抽提
1）纤维组织：心脏/骨骼肌等纤维组织抽提 RNA 关键在根本破碎组织。这些组织细胞密度低，故单位重量组织 RNA 含量就少，最好用尽可能多起始量。一定要在冷冻条件下将组织根本磨碎。
2）蛋白/脂肪含量高组织：脑/植物脂肪含量高，PCI 抽提后，上清含白色絮状物。必需用氯仿再次对上清进行抽提。
3）核酸/核酶含量高组织：脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。在冷冻条件下碾磨组织，再快速匀浆，能有效灭活核酶。但假如裂解液太粘稠 （因为核酸含量高缘故），PCI 抽提不能有效分层；加入更多裂解液能够处理此问题。数次PCI抽提能够去除更多残留 DNA。假如加入醇后立即有白色沉淀形成提醒有 DNA 污染。溶解后用酸性 PCI 再次抽提，能够去除 DNA 污染。

4）植物组织：植物组织比动物组织更为复杂。通常，大家全部是在液氮条件下对植物进行碾磨，所以内源酶作用使 RNA 降解现象不常见。假如降解问题不能处理，几乎能够肯定是样品中内含杂质造成。很多植物内含杂质全部会造成残留，之所以残留，往往是因为这些杂质和 RNA 有部分相同性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。这些特点决定了它们是很强酶抑制剂。现在，商品化 RNA 抽提试剂经过小量调整，能够适合几乎全部动物组织，但却没有一个商品化 RNA 抽提试剂，能够适合大部分植物组织。

12、样品冻融影响

冷冻样品可能较大，用于抽提 RNA 之前，需要切割。切割过程中样品往往出现融化 （可能是部分融化）。冷冻样品抽提 RNA 前可能还要称重，这个过程肯定会出现融化。有时候，液氮碾磨过程中也会出现样品融化；或冷冻样品不经过液氮碾磨直接加入裂解液中，在根本匀浆前肯定会出现融化。试验表明，冷冻组织在融化过程中比新鲜组织更轻易发生 RNA 降解。可能原因是：冻融过程破坏了细胞内结构，使内源酶更轻易和 RNA 直接接触。

13、RNA 质量判定

通常，使用电泳判定 RNA 完整性，使用 A260/A280 判定 RNA 纯度。理论上，完整 RNA 拥有 28S：18S = 2.7：1 百分比，大部分资料则强调 28S：18S = 2：1 百分比。事实是，除了细胞外，从其它样品中抽提 RNA 几乎全部得不到 2：1 百分比 （此结论使用 Agilent Bioanalyzer 取得）。RNA 电泳结果受很多原因影响，包含二级结构，电泳条件，上样量，被 EB 饱和程度等。使用非变性电泳检测 RNA，以 DNA Marker 做对照，假如 2kb 处 28S 和 0.9kb 处 18S 条带清楚，且 28S：18S > 1，该完整性能够满足绝大部分后续试验要求了。A260/A280 是一个给大家带来很多迷惑指标。首先要明确该指标用于核酸原始含义是：纯 RNA，其 A260/280 = 2.0 左右。纯 RNA 是‘因’，A260/A280 = 2 是‘果’。现在大家却在拿 A260/A280 当‘因’用，认为“假如 A260/A280 = 2，所以 RNA 是纯”，自然会产生迷惑。有爱好话，能够在您 RNA 样品中加入一点抽提中常常使用试剂，如苯酚，异硫氰酸胍，PEG 等，再测 A260/A280 比值。现实是，很多抽提 RNA 时使用试剂，和样品中很多杂质全部在 A260 和 A280 处周围有吸收，对 A260/A280 产生影响。现在最含有指导性做法是：对 RNA 样品在 200-300 nm 范围扫描。纯 RNA 曲线含有以下特点：曲线平滑，A230 和 A260 是两个拐点，A300 靠近 0，A260/A280 = 2.0 左右，A260/A230 = 2.0 左右。假如没有扫描数据，也一定要测定 A260/A230 比值，因为该比值对全部影响酶反应杂质残留更敏感。要考虑设备线形范围 （A260 要处于 0.1 – 0.5 之间）。另外有两个有用现象：在水中测定 A260/A280，比值将变低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中测定比值比在 1mM EDTA 中测定高 0.2 左右。

RNAguard：抑制组织/细胞内源酶试剂

总而言之，确保 RNA 不降解传统做法是：在取组织前将含液氮容器放在手边，一旦取出所需组织，立即切割小后投入液氮中。抽提前先在碾钵中加入适量液氮，再将组织从液氮中取出快速放入已加入液氮碾钵中碾磨。碾磨过程中要立即补充液氮以预防组织融化。待组织根本碾磨碎后，等候剩下液氮恰好挥发完时，立即将碾磨碎组织移入裂解液中快速匀浆......安全称重几乎不可能。这么严格操作，是没有多少试验人员去认真实施。

RNAguard 能快速抑制样品中内源酶活性，确保动物组织/细胞中 RNA 在 37C 一天不降解，25C 一周不降解，4C 30天不降解，-20C 十二个月以上不降解。RNAguard适用样品包含：动物组织，培养细胞，昆虫，及部分植物组织。经过 RNAguard 处理样品能够用几乎全部常见 RNA 方法/试剂抽提 RNA，全部操作和用新鲜组织没有什么不一样。

使用 RNAguard 操作很简单：在取组织前预先估量组织重量，在一个容器中加入 5-10 倍体积 RNAguard，放在手边。取出所需组织后，立即切割成厚度小于 0.5 厘米，放入含 RNAguard 容器中即可。抽提前先用镊子将组织从 RNAguard 中取出，在室温进行切割和称重后，移入裂解液中快速匀浆。