miR-375靶向PI3K_AKT通路在高糖诱导的人视网膜内皮细胞增殖和血管生成中的作用.pdf

欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉引文格式：张悦之，殷小龙，邓燕，熊晓顺 靶向 通路在高糖诱导的人视网膜内皮细胞增殖和血管生成中的作用 眼科新进展，（）：【实验研究】靶向 通路在高糖诱导的人视网膜内皮细胞增殖和血管生成中的作用张悦之殷小龙邓燕熊晓顺欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉作者 简 介：张 悦 之（：），女，年 月出生，江西人，硕士研究生，主治医师。研究方向：小儿斜弱视、近视发病机制。：通信 作 者：熊 晓 顺（：），男，年 月出生，江西人，博士研究生，主管技师。研究方向：临床微生物致病机制 研 究。：收稿日期：修回日期：本文编辑：付中静基金项目：江西省自然科学基金项目（编号：）作者单位：江西省南昌市，南昌大学第二附属医院眼科中心（张悦之，殷小龙，邓燕）；江西省南昌市，南昌大学第二附属医院检验科（熊晓顺）【摘要】目的探讨 靶向磷脂酰肌醇 激酶（）蛋白激酶 （）通路对高糖诱导的人视网膜内皮细胞（）增殖和血管生成的影响机制。方法体外培养 ，对 进行转染及双荧光素酶检测。分为对照组、高糖组、高糖 组、高糖 组。采用 实验检测细胞增殖能力，采用血管形成实验检测细胞血管形成能力，采用 检测 内 和 的表达情况，采用 检测 内 、蛋白表达的情况。结果与对照组比较，高糖组、高糖 组、高糖 组培养 和 时 增殖活力、和 的蛋白表达水平、血管形成能力和 表达均显著升高，而 表达降低（均为 ）；与高糖组比较，高糖 组培养 和 时 增殖活力、和蛋白以及 的蛋白表达水平、血管形成能力均降低，而 表达升高（均为 ）；与高糖 组比较，高糖 组培养 和 时 增殖活力、血管形成能力和 蛋白表达水平均升高（均为 ），而 、差异均无统计学意义（均为 ）。转染 模拟物和 野生型载体后，中相对荧光素酶活性分别较转染 阴性对照、转染 突变型载体后显著降低（均为 ）。结论 靶向抑制 通路可抑制高糖诱导的 增殖和血管生成，进而缓解 。【关键词】高血糖；糖尿病视网膜病变；血管生成；通路【中图分类号】糖尿病是一种严重危害人类健康的慢性疾病 ，长期血糖代谢紊乱可诱发糖尿病视网膜病变（）。然而，目前关于 视网膜功能障碍的发病机制尚未完全清楚 。有研究表明，高血糖会导致微血管病变、黄斑水肿和新生血管形成，磷脂酰肌醇 激酶（）蛋白激酶 （）通路能够促进视网膜内皮细胞（）的增殖 ，但该通路是否会影响 的血管生成仍未完全清楚。在 的进展中发挥多种功能 ，是最新发现的与 相关的 ，有报道提示高葡萄糖会导致 水平的降低 。但是 对 以及血管生成的影响仍未完全清楚。基于此，本研究分析 靶向 通路在高糖诱导的人视网膜内皮细胞（）增殖和新生血管生成中的作用，从而为 的诊断和治疗提供新方向。材料与方法 材料和试剂 购于武汉大学细胞库中国典型培养物保藏中心（武汉）。葡萄糖（广州百俊科技有限公司）。模拟物（）和 阴性对照（）（深圳市科普生物有限公司）。转染试剂 （广州速研生物科技有限公司）。突变和海肾荧光素酶质粒（广州特科锶科技服务有限公司）。激活剂 （广州市左克生物科技发展有限公司）。兔抗 、兔抗磷酸化 （）、兔抗 、兔抗 （广州新晋生物科技有限公司）。超敏 发光液（杭州弗德生物科技有限公司）。分组和处理取对数生长期的 ，将其分为对照组、高糖组、高糖 组、高糖 组。处理如下：（）对照组，不做任何处理；（）高糖组，在 中加入终浓度为 的葡萄糖孵育 后，按照 转染试剂 的说明书转染适量 ，转染 后继续下面的细胞学实验；（）高糖 组，在 中加入终浓度为 的葡萄糖孵育 后，按照 转染试剂 的 说 明 书 转 染 等 量 ，转 染 后继续下面的细胞学实验；（）高糖 组，在 中加入终浓度为 眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：的葡萄糖孵育 ，然后按照 转染试剂 的说明书转染等量 ，后加入 终 浓 度 为 预培养 来激活 通路 。细胞转染首先将 或者 溶解于 中，制成 稀释液。将 转染试剂 和 混合，室温静置 ，制作成 稀释液。将 稀释液和 转染试剂 稀释液充分混合静置 后作为转染复合物，室温静置 ，制成转染复合物。将上述 转染复合物加入到完全培养基中，混合均匀后，孵育 。方法 实验检测细胞增殖能力取对数生长期的四组细胞，用胰蛋白酶消化后，将细胞以 个 接种于 孔板内，每孔 细胞悬浮液，每组设置 个复孔，之后将 孔板置于 的细胞培养箱中继续培养 后，每孔加入 溶液，继续放入 的细胞培养箱中孵育 ，后记录在 波长处的光密度（）值，分别在培养 、各测定一次细胞的 值，绘制细胞的生长曲线。血管形成实验检测细胞血管形成能力将基质胶均匀涂到 孔板中（每孔 ），在 下硬化，将四组处于对数生长期的细胞以每孔 个细胞的密度接种到基质胶包被的孔顶部，每组设置 个复孔，分别于 、体积分数 的培养箱中培养 ，然后在倒置显微镜下观察体外管腔生成结果，使用 血管生成分析仪对每个样本中的管腔长度进行量化，以此比较各组细胞的血管形成能力。检测取四组处于对数生长期的细胞，每组 个细胞，使用 试剂盒提取 的总 ，并进行逆转录，生成 。试剂用于 扩增，反应条件为：，个循环，最后在 下延伸 。以 和 为内参，使用 方法检测 和 的表达情况。检测细胞内蛋白表达情况利用裂解液体（）蛋白酶抑制剂（）苯甲基磺酰氟（）配备细胞裂解液，取四组处于对数生长期的细胞，每组 个细胞，清洗后，加入 细胞裂解液裂解 ，然后离心（，）后，收集上清液。采用 蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度，然后加载到十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳微型凝胶上并转移到聚偏二氟乙烯膜上，用 脱脂牛奶封闭膜 后，分别加入 、和 （均为 ）过夜，然后将膜与 标记的山羊抗兔 二抗（）在室温下孵育，显色，凝胶成像系统成像分析，以 为内参，使用 软件分析目的蛋白的相对表达情况。双荧光素酶报告实验 与 的结合位点通过 数据库得到。将 和 分别与 野生型载体（）使用转染试剂 转染进 个 内，随后将 模拟物和 阴性对照分别与 突变型载体（）使用转染试剂 转染进 个 内 后，检测各组细胞荧光素酶的相对活性。统计学分析采用 统计学软件进行数据分析，多组间比较采用单因素方差分析，采用 检验进行两两比较。检验水准：。结果 和 对高糖下 增殖活力的影响培养 时，四组细胞的增殖活力差异无统计学意义（）；培养 和 时，四组细胞的增殖活力差异均有统计学意义（均为 ）。与对照组比较，培养 和 时，高糖组、高糖 组、高糖 组细胞增殖活力均显著升高（均为 ）。与高糖组比较，培养 和 时，高糖 组细胞增殖活力均显著降低（均为 ）。与高糖 组比较，培养 和 时，高糖 组细胞增殖活力均显著升高（均为 ）（表 ）。表 和 对高糖下 增殖活力的影响组别 对照组 高糖组 高糖 组 高糖 组 注：与对照组比较，；与高糖组比较，；与高糖 组比较，。和 对高糖下 血管形成能力的影响四组细胞的管腔长度差异有统计学意义（）。与对照组（）比较，高糖组、高糖 组、高糖 ：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 组的管腔长度 （）、（）、（）均升高（均为 ）。与高糖组比较，高糖 组的管腔长度降低（）。与高糖 组比较，高糖 组的管腔长度升高（）（图 ）。图 和 对高糖下 血管形成能力的影响 各组 和 水平比较四组细胞内 和 水平差异均有统计学意义（均为 ）。与对照组比较，高糖组的 降低，而 升高（均为 ）。与高糖组比较，高糖 组的 升高，而 降低（均为 ）。高糖 组与高糖 组的 、差异均无统计学意义（均为 ）（表）。表 各组 和 水平比较组别 对照组 高糖组 高糖 组 高糖 组 注：与对照组比较，；与高糖组比较，。和 对高糖下 中 通路蛋白的影响四组细胞内 和 蛋白水平差异均有统计学意义（均为 ）。与对照组比较，高糖组、高糖 组 和 高 糖 组 和 蛋白水平均显著升高（均为 ）。与高糖组比较，高糖 组的 和 蛋白水平均降低（均为 ）。与高糖 组比较，高糖 组的 蛋白水平升高（），蛋白水平差异无统计学意义（）（图 、表 ）。中 靶向 与 的靶向位点见图 。转染 、转染 后 中相对荧光素酶活性分别为 、，转染 后 中相对荧光素酶活性显著降低（）；另外，转染 、转染 后 中相对荧光素酶活性分别为 、，转染 后 中相对荧光素酶活性显著降低（）。图 和 对高糖下 中 通路蛋白的影响表 和 对高糖下 中 通路蛋白的影响组别 对照组 高糖组 高糖 组 高糖 组 注：与对照组比较，；与高糖组比较，；与高糖 组比较，。图 与 的结合位点眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：讨论 是目前成年人视力下降和失明的主要原因 ，其病理学特点是视网膜血管内皮细胞损伤和血管结构发生变化 。的发病机制是一个多因素综合作用的过程，研究显示，已被证明与糖尿病及其并发症的发病机制有关 。可作为 的诊断生物标志物 ，和 的缺失或过度表达可能会导致 及相关神经元的死亡和视网膜血流量的减少，从而促进 的进展 。目前，临床研究已经证实 型糖尿病患者 水平与 细胞功能、胰岛素抵抗和代谢参数密切相关 。通过靶向芳烃受体和细菌色氨酸酶基因预防高脂饮食诱导的胰岛素抵抗和肥胖 。但是 在 中的作用仍未完全明了，因此，本研究拟通过模拟高糖环境，探索 对 增殖和血管生成的影响。本研究将 转染至 内，比较高糖环境下 的增殖和血管生成能力，结果显示，在高糖条件下，内 的表达水平显著降低，的增殖和血管生成能力显著升高，而转染 后，的增殖和血管生成能力下降，这一结果表明高糖能抑制 的表达，且高糖能促进 增殖及血管形成，而 能抑制 增殖及血管形成。另有研究显示，通过靶向 样因子 调控糖尿病严重肢体缺血的血管生成 ，这与本研究所得出的结论相一致。在高糖环境下，在转染 的 中加入 （一种神经营养因子受体 型 神经营养因子受体 型激活剂，能诱导神经营养因子受体型、神经营养因子受体 型、和细胞外信号调节激酶的活化），的增殖和血管生成能力显著升高，说明 可能通过 通路调控 的进展。本研究中，我们发现高糖会促进 中 和蛋白表达以及 磷酸化，而过表达 不但抑制了 和蛋白表达，还逆转了高糖诱导的 磷酸化。通路对正常血管的形成起到重要作用，而细胞和全身代谢的胰岛素依赖性调节也离不开 信号通路 。细胞因子、生长因子和环境应激等刺激也都能够激活该信号通路，调节细胞增殖、迁移、分化和存活等生命过程 。有研究表明，的持续激活可以导致结构和功能异常的血管形成，而抑制该信号转导则可以抑制病理性血管的形成 。在 中，的升高以及磷酸化促进 的磷酸化，这不但可活化 使其增殖，还促进了血管生成 。另外，受到 的调控，如在 中，受到 的靶向调控，进而抑制 磷酸化 。这也进一步佐证了本研究的结果。为进一步验证 通路在 缓解 中的关键机制，我们在过表达 的基础上利用 来持续激活 通路，其中，可通过作用于 蛋白来激活 通路 。结果显示，对 和 的水平影响不显著，但却显著逆转了 对 磷酸化的抑制作用。更重要的是，利用 持续激活 通路也阻断了 的保护作用，逆转了 过表达对 增殖活力和血管生成能力的抑制作用。本研究明确了 以及 的结合位点，并且发现转染 和 后，中相对荧光素酶活性显著降低。另外，等 发现，催产素可通过诱导 抑制 通路，从而防止异丙肾上腺素诱导的心脏肥大。在肺癌和乳腺癌细胞中，的表达抑制 的磷酸化 。这表明 中 通路被 靶向，过表达 通过靶向抑制 通路降低 中 的增殖和血管生成。结论 通过靶向抑制 通路抑制高糖诱导的 增殖和血管生成，进而缓解 。关于 在 中的临床价值仍需要对大量 患者进行进一步研究，其对 的影响也需要进一步的体内实验来证实。说明靶向 可能成为治疗 的新靶点。参考文献 ，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，爦 ，爦 ，（）：，（）：?，?，?，?，（）：，（），（）：，?，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：【】（）（）（）（），（），（），（）；（），（），【】；眼 科新进展 年 月第 卷第 期 ：