培养基配制及适用性检查标准操作规程.doc

文献名称培养基配制及合用性检查标准操作规程文献编号SMP-10-QC-009版 本 号00起草部门质量控制部审核部门批 准 人起 草 人审 核 人批准日期起草日期审核日期生效日期颁发部门质量控制部分 发 号分发部门质量保证部 质量控制部 目的： 建立培养基配制及合用性检查的标准操作规程，规范实验人员的操作流程。范围： 合用于微生物检查人员对培养基的规范管理。依据：药品生产质量管理规范（2023年修订）、中华人民共和国药典2023年版第四部职责：1.微生物检查员：负责实验室所需求的培养基管理工作，使平常检查可以顺利进行。2.微生物检查主管：负责对平常配制培养基的规范操作进行监督。内容1 培养基的申购 根据检查项目、工作量和工作进度的需求，提前一个月进行所需的培养基申购。申购时需指定培养基供应商，必要时进行供应商审计。2 培养基的验收2.1 培养基到货后，微生物室检查员应进行验收。验收内容涉及核对品名、数量、规格、生产厂商，应与申购单一致；检查培养基包装有无破损、包装是否完整、产品是否在有效期内。2.2 验收合格后，登记于培养基领用台账（附记录文献编号：SMP-10-QC-009-02（00）。3 培养基的贮藏3.1未开封的脱水培养基贮存于阴凉室，使培养基处在低温、干燥、和避光条件下。已开封的脱水培养基应盖紧，贮存于阴凉库。3.2灭菌好的培养基应进行预培养72h检查无菌后，置48冷藏保存待用。灭菌后培养基储存期为7天。4 培养基的配制4.1培养基的配制和使用应填写 培养基配制及使用记录（附记录文献编号：SMP-10-QC-009-02（00）。4.2培养基配制批号原则：原材料批号-配制日期：比如2023年1月1日配制的培养基，培养基干粉批号000000，配制批号为:00。配制好的培养基贴培养基标签（附记录文献编号：R-SMP-10-QC-009-03）。（注：同一天同一培养基配置多次的，在原批号后加“-”加“数字”表达，如00-01）4.3培养基配制方法 4.3.1 使用商品化脱水合成培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配制，如重量/体积、pH、灭菌条件和操作环节等。实验室使用各种基础成分制备培养基时，应按照配方准确配制，并记录相关信息如：培养基名称和类型及试剂级别，每个成分物质含量、制造商、批号，pH值，培养基体积/分装体积，灭菌条件（灭菌方式、温度及时间），配制日期、人员等，以便溯源。4.3.2 水、容器具规定：培养基配制均采用纯化水，特殊说明时采用去离子水和蒸馏水。培养基配制所用容器和配套器具应洁净。对热敏感的培养基如糖发酵培养基其分装容器应先进行预灭菌，以保证培养基的无菌性。4.3.3 称量与分装： 快速称量所需量的脱水合成培养基（必要时佩戴口罩或在通风柜中操作，以防吸入具有有毒物质的培养基粉末）。以免吸潮。先加入适量的水，充足混合。注意避免培养基结块，然后加水至所需的量。根据说明书规定选择是否加热。分装体积不超过容器体积的2/3。配制斜面等含琼脂的培养基也需加热煮沸至完全溶解后分装。4.4 pH 值的测定和调整 pH值采用pH计进行检测，温度252。取配后培养基10ml进行灭前pH测定。另取20ml于50ml三角瓶与同批配制培养基同时灭菌冷却至252检测灭后PH。灭菌前后pH应按下表进行控制。灭菌前可使用浓度约为40g/L（约1mol/L）的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5g/L（约1mol/L）的盐酸溶液进行缓慢调整，避免反复调整而增长离子浓度。灭菌后培养基不符合标准时视为不合格，不进行使用。4.5 培养基灭菌 培养基和试剂应采用湿热灭菌法或过滤除菌法。 湿热灭菌在高压灭菌锅或蒸汽灭菌柜中进行，容器具若需湿热灭菌时，灭菌条件为121灭菌30 min。培养基严格按说明书条件进行灭菌。培养基灭菌后应立即取出，不得存放于高压灭菌器中。5 培养基的质量控制 5.1计数培养基合用性检查5.1.1菌种及菌液制备 菌种：实验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证实验菌株的生物学特性。计数培养基合用性检查和计数方法合用性实验用菌株见表1。 菌液制备：按表1规定程序培养各实验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，35培养1824小时，取上述培养物1ml加入9ml 0.9无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10-7， 分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml的菌液备用；取白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，25培养23天。取上述培养物1ml加入9ml 0.9无菌氯化钠溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀释至10-7，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml的菌液备用；取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基，经25培养57天，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液至无菌试管内，取上述培养物1ml加入9ml 0.9无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10-7， 分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml的菌液备用。 菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在28，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28 ,在验证过的贮存期内使用。5.1.2 阴性对照 为确认实验条件是否符合规定，应进行阴性对照实验，阴性对照实验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。5.1.3培养基合用性检査 微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基合用性检查。 按表1 规定，接种不大于l00cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表1 规定条件下培养。每一实验菌株平行制备2管或2个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.52 范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，实验菌应生长良好。表1 实验菌液的制备和使用实验菌株实验菌液的制备计数培养基合用性检查计数方法合用性实验需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)CMC C(B ) 26 003胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基培养温度303 5 ，培养时间1 824小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3035, 培养时间不超过3 天， 接种量不大100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（MPN法），培养温度3035, 培养时间不超过3 天，接种量不大于l00cfu铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC ( B ) 10 104胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3035，培养时间1 824小时 胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基， 培养温度303 5，培养时间不超过3 天，接种量不大于l00cfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（MPN 法），培养温度3035，培养时间不超过3天，接种量不大于l00cfu枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)CMCC(B)63 501胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度3035，培养时间18 -24小时胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30-35，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基（MPN法），培养温度3035，培养时间不超过3天，接种量不大l00cfu白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC(F)98 001沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度2025，培养时间2 3天胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度3035，培养时间不超过5天，接种量不大于l00cfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2025，培养时间不超过5天，接种量不大于l00cfu胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN 法不合用），培养温度3035，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2.025，培养时间不超过5天，接种量不大于l00cfu黑曲霉（Aspergillusniger) CMCC (F ) 98 003沙氏葡萄糖琼 脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养温度2025，培养时间57天，或直到获得丰富的孢子胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度3035 ，培养时间不超过5天，接种量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2025，培养时间不超过5天，接种量不大于l00cfu胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不合用），培养温度3035，培养时间不超过5天，接种量不大于l00cfu沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度2 025，培养时间不超过5天，接种量不大于l00cfu5.2控制菌检查用培养基合用性检查5.2.1 菌种及菌液制备 菌种：实验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证实验菌株的生物学特性。 菌液制备：按表1规定程序培养各实验菌株。取大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，35培养1824小时，取上述培养物1ml加入9ml 0.9无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10-7，分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml的菌液备用；取白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，25培养23天。取上述培养物1ml加入9ml 0.9无菌氯化钠溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀释至10-7，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml的菌液备用； 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28，可在24小时内使用。2.1.3 阴性对照 为确认实验条件是否符合规定，应进行阴性对照实验，阴性对照实验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。2.2 培养基合用性检查控制菌检查用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的合用性检查。控制菌检査用培养基的合用性检查项目涉及促生长能力、克制能力及指示特性的检查。各培养基的检查项目及所用的菌株见表1。表1 控制菌检査用培养基的促生长能力、克制能力和指示特性控制菌检查培养基特性实验菌株耐胆盐革兰阴性菌肠道菌增菌液体培养基紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基促生长能力克制能力促生长能力+指示特性大肠埃希菌、铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌、铜绿假单胞菌大肠埃希菌麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基促生长能力克制能力促生长能力+指示特性大肠埃希菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌沙门菌R V 沙门菌增菌液体培养木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基三糖铁琼脂培养基促生长能力克制能力促生长能力+指示特性指示能力乙型副伤寒沙门菌金黄色葡萄球菌乙型副伤寒沙门菌乙型副伤寒沙门菌白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基念珠菌显色培养基促生长能力促生长能力+指示特性促生长能力+指示能力克制能力白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌大肠埃希菌2.2.1 液体培养基促生长能力检査 分别接种不大于100cfu的实验菌(表1)于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管实验菌应生长良好。2.2.2 固体培养基促生能力检査 用涂布法分别接种不大于100cfu的实验菌（表1 )于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检査规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特性应一致。2.2.3 培养基克制能力检査 接种不少于l00cfu的实验菌（表1)于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检査规定的培养温度及不小于规定的最长培养时间下培养，实验菌应不得生长。2.2.4 培养基指示特性检査 用涂布法分别接种不大于100cfu的实验菌（表1 )于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上实验菌生长的菌落大小、形态特性、指示剂反映情况等应与对照培养基一致。6培养基销毁失效、检测用过培养基（无论是否有菌生长）均按废物进行高压蒸汽灭菌解决。参照实验室废弃物管理规程（文献编号：SMP-10-QC-014（00）。相关文献：文献名称文献编号检定菌管理规程SMP-10-QC-010实验室废弃物管理规程SMP-10-QC-014（00）相关记录：记录名称记录编号培养基登记台账R-SMP-10-QC-009-01培养基配制及使用记录R-SMP-10-QC-009-02培养基配制标签R-SMP-10-QC-009-03计数培养基合用性检查报告R-SMP-10-QC-009-04计数培养基合用性数据记录R-SMP-10-QC-009-05控制菌培养基合用性测试记录R-SMP-10-QC-009-06控制菌培养基合用性检查报告R-SMP-10-QC-009-07文献变更历史：文献修订及变更因素生效日期文献编号版本号新修订。SMP-10-QC-00900培 养 基 领 用 台 账R-SMP-10-QC-009-01(00)培养基名称供应商进厂编号规格安全库存量日期批号入库量领用数量剩余库存领用人管理人备注 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 培 养 基 配 制 及 使 用 记 录R-SMP-10-QC-009-02(00)培养基名称配制人/日期配制批号有效期至复核人/日期配制方法称取 g于 L纯化水中，加热煮沸至完全溶解分装，分装体积为 ml/瓶, _m l/瓶, ml/瓶。 分钟高压灭菌备用。灭菌后ph 使用日期用途使用数量使用人培 养 基 配 制 标 签R-SMP-10-QC-009-03(00)培养基名称配制批号合用性检查符合规定 不符合规定灭菌状态已灭菌 未灭菌配制日期有效期至配制人 复核人计数培养基合用性检查报告R-SMP-10-QC-009-04(00)被测培养基名称批号来源对照培养基名称批号来源检测日期放置天数菌种名称生长状况回收率结果判断备注计数培养基合用性数据记录R-SMP-10-QC-009-05(00)被测培养基名称批号来源对照培养基名称批号来源被测日期菌种名称对照培养基菌数被测培养基菌数回收率%备注1#2#平均值1#2#平均值控制菌培养基合用性测试记录R-SMP-10-QC-009-06(00)被测培养基名称批号来源对照培养基名称批号来源被测日期菌种名称对照培养基菌数测试结果被测培养基菌数测试结果备注控制菌培养基合用性检查报告R-SMP-10-QC-009-07(00)被测培养基名称批号来源对照培养基名称批号来源配制日期检测日期放置天数菌种名称测试指标结果判断备注